海洋维生素B12产生菌培养条件研究
作者：陈皓文 刘秀云 高月华
单位：陈皓文(国家海洋局第一海洋研究所，青岛 266061)；刘秀云 高月华(中国科学院海洋研究所，青岛 266071)
关键词：海洋细菌，维生素B12生产，B12菌培养条件
中国海洋药物000603 摘 要 用大肠埃希氏菌(Escherichia coli)113-3测定14株分离自我国海域的海洋细菌维生素B12(Vit B12)产力。试验了它们产生B12的培养基及培养条件。结果表明，以海水浸提豆饼并添加一些营养组成的培养基适于进一步确定产B12的菌种。培养基中适当添加二氯化钴等盐类有利于B12合成。培养基酸碱度在所试菌种发酵过程中随时间延长而提高。保持偏碱性约96h，可获得较好的B12生产效益。所测菌株中，No.2627菌株表现良好。有No.2627菌株的混合培养，B12产力常常有潜力和优势可取。
, 百拇医药
STUDY ON CULTURE CONDITION OF MARINE VITAMIN B12-PRODUCING BACTERIA
Chen Haowen，Liu Xiuyun，Gao Yuehua
(First Institute of Oceanography, SOA, QingDao 266061)
ABSTRACT The vitamin B12 Productivity of 14 marine bacterial strains isolated from the China Sea was determined microbiologically using Escherichia coli 113-3.
Tests were made on the culturing media and culture conditions for Vitamin B12 production. The results showed that the culturing medium in which the extract from soybean cake with seawater and some nutriments were added was suitable to recognize further some marine Vitamin B12-producing bacterial strains. The medium with appropriate cobalt chloride and some salts added may be useful for Vitamin B12 biosynthesis. The PH value of the fermentation for the testing strains was raised with the lapse of time for fermentation. A better Vitamin B12-production may be obtained by keeping the fermentation liquid slightly basic till about 96h. No.2627 strain in all the strains tested showed well in the productivity. The mixed cultivation of some strains (including No.2627 strain) tested often has potentiality and superiority for Vitamin B12-production.
, 百拇医药
KEY WORDS: Marine bacteria, Vitamin B12 Production, Culturing conditions of Vitamin B12-producing bacteria.
维生素B12(本文简称为B12，下同)是自然界已知结构中较复杂的非聚合有机化合物，在医药、人和生物营养上具重要应用价值，如可促进、恢复造血功能，对恶性贫血症有疗效，可防止脂肪肝在肝脏中沉着，还可治疗神经痛等疾患。在各种水生态系统中发挥不可替代的重要作用[1、2]。迄今尚无法借助化学手段来实际生产B12。长期以来人们只从陆源或淡水微生物中筛选有限的B12生产菌株(简称B12菌，下同)以发酵法生产B12[3、4]。随着人口膨胀和资源短缺的压力，探索B12菌的眼光已更多地投向海洋[5、6]。我们对取自我国海域的一些初筛为B12菌的菌作培养条件等研究，以期为确定和构建出优秀工程B12菌提供依据。
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1 材料和方法
1.1 培养基 共计有7种，见表1。
表1 海洋维生素B12菌试用培养基成分一览表 编号
培养基名称
培养基成分及制作
1
改进的Zobell 2216
蛋白胨5g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，陈海水1000cm3。
2
玉米粒海水
玉米粒200g+陈海水1000cm3，3d后，2次热压，8层纱布滤得清液，加10%KNO3、10%KH2PO4、10%NH4NO3各10cm3。
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3
豆饼海水
豆饼40g+陈海水300cm3，煮沸后浸泡半日，热压后取清液，加陈海水至1000cm3,10%KH2PO4 5cm3。
4
花生饼海水
花生饼40g+陈海水300cm3，煮沸，浸泡半日，热压后取清液，加陈海水至1000cm3，10%KH2PO4 5cm3。
5
玉米浆海水
, 百拇医药
玉米浆5g+陈海水500cm3；10%KNO3、10%NH4NO3、10%KH2PO4各5cm3。
6
豆饼、玉米浆海水
No.3培养基：No.5培养基=1：3 混合
7
花生饼+玉米浆海水
NO.4培养基：No.5培养基=3：10 混合
注：以上各种培养基都加有0.01%的FePO4，30cm3分装前，调pH至7.4，101b 30′消毒；玉米粒、豆饼和花生饼为市售；济南第二制药厂产玉米浆。1.2 参试菌株 从收藏的初筛自中国海的部分B12菌菌株中随机抽取14株，编号分别为No.37、54、79、172、209A、279、822、933、2000、2036、2494、2627、2749及3595。用前在No.1 液体培养基中活化24h后接一环入表1的相应培养基中25℃振荡培养(120r*min-1)数日，待测B12产力。
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1.3 B12产力的鉴定 用来鉴定参试菌株B12产力的菌种为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)113-3。E.coli 113-3培养和B12的鉴定和差别方法见华北制药厂的“维生素B12含量测量(微生物杯蝶法)”。根据该E.coli113-3在培养基上显示的生长圈大小，并与所用标准Vit.B12浓度作对照，以比较和分析所试菌B12产力的大小。
以下1.4～1.7除特指外，所用培养基为No.3(下述)，培养法同1.2。B12产力按1.3测。
1.4 Co2+盐对B12产力的影响试验
在培养基中添加CoCl2,其浓度从0～25g*m-3(W/V)。参试单株菌分别为No.2036、2627或3595，混合株为No.2036+No.2627,连续培养5d后，分别测B12产力。
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1.5 不同培养时段B12产力的比较试验
比较4株菌(即No.54、2627、2749、3595)及不同培养时间段(从22～216h间分10次，即22、46、67、81、96、120、144、168、190及216h)的B12产力。
1.6 B12生产过程中pH值变化的测定
分别试验两单株细菌(即No.2627和No.3595)B12生产过程中pH值变化，以掌握pH值与B12产力间的关系。培养时间最长持续216h。
1.7 单株或混株培养的B12产力比较
分别选取No.54、2036、2627、2749和3539为单株，选取No.54+No.2627+NO.3539+No.2036+No.2627或No.2627+No.2749为3个混合菌株培养，比较72h和120h时不同菌株及其组合的B12产力。
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2 结果和讨论
2.1 培养基的比较表2 海洋维生素B12菌在不同培养基上B12产力比较 菌株编号No.
37
79
172
209A
279
822
933
2000
2494
, 百拇医药
2627
空白
对照
生长圈平均值
(mm)
1
15.7
15.7
16.2
13.1
晕圈
晕圈
15.0
, http://www.100md.com
太小
晕圈浓
13.7
晕圈
14.9
培 2
12.0
14.6
14.9
15.9
0
0
14.4
, 百拇医药
太小
15.3
17.1
0
14.9
养 3
太小
14.8
16.2
15.6
0
0
15.2
, 百拇医药
太小
17.5
19.2
0
16.4
基 4
太小
13.5
17.1
14.2
0
0
17.3
, 百拇医药
太小
14.6
19.3
0
16.0
编 5
16.3
9.5
15.8
14.4
0
0
14.6
, http://www.100md.com
太小
11.8
18.1
晕圈
14.4
号 6
18.3
晕圈
18.1
15.3
0
0
太小
, 百拇医药
13.5
9.1
9.4
—
14.0
7
0
太小
17.9
13.6
—
—
—
—
, 百拇医药
—
—
晕圈
15.8
平均
15.6
13.6
16.6
14.6
—
—
15.3
<13.5
, http://www.100md.com
13.7
16.1
≈0
-
注：培养时间：振荡58h+静止38h;Vit B12产力以E.coli113-3生长圈直径(mm)表示(下同)；标准Vit B12
(0.005mg*m-3)的E.coli生长圈均为13.5mm；“—”未参试；“晕圈”、“太小”为不计入者。
仅计算“0”以外的有效数。
表2比较了表1中各培养基中B12产力的状况。由表2可见，10株菌在7种培养基中平均的B12产力大小(即E.coli生长圈直径mm，下同)排序按培养基号分别为No.3(16.4)>No.4(16.0)>No.7(15.8)>No.1(14.9)=No.2(14.9)>No.5(14.4)>No.6(14.0)。这说明豆饼(No.3)、花生饼(No.4)或花生饼加玉米浆(No.7)的培养基效果好于改进的Zobell 2216(即No.1培养基)。No.1培养基主成分含牛肉膏、蛋白胨等，使其上生长出的细菌可携带多种维生素(包括B12)，因而将干扰真正B12菌的阳性率，抑或降低其B12产力。而且该培养基选择性不强。它不仅可作为从海洋中初筛B12菌用。统计该表数据还说明10株菌在7种培养基中给出的B12产力，各自平均的大小排序为No.172>2627>37>933>209A>2494>79>2000>279=No.822由此初步判断No.2627菌株可能有较好B12产力。方差分析结果显示，不同培养基间、不同菌株间均各有显著差异(P<0.01)。
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以下各试验一般均在No.3培养基基础上进行。
2.2 钴盐对B12产力的作用
钴盐对B12菌产力的作用可见表3。由该表可见，培养基中添加有二氯化钴(CoCl2)，其菌株经5d培养，无论是单株还是混合培养，其B12产力均比未加钴盐的大。平均地说，B12产力大小排序为：加25g*m-3(16.97mm)>5g*m-3(16.60mm)>无钴的(12.30mm)，但No.2627单株培养，其5g*m-3的B12产力却大于25g*m-3时的，这暗示特定菌株的不同培养方式，钴盐的作用是不一样的。还表达出过高钴离子浓度不利于B12生产。正如Yongsmith等(1982)指出的那样，12g*m-3浓度的CoSO4*7H2O最适于丙酸杆菌(Propioribacterium arl AKU1251)在基本培养基中积累B12，而处于固定化状态的该菌在最适培养中，需要20g*m-3浓度的该盐才可使其产生和积累更多B12[7]。
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表3 添加氯化钴对海洋维生素B12产生菌力的影响 菌株编号
培养方式
加钴量(g*m-3)
B12产力〔E.coli生长圈直径(mm)〕
2036
单株
0
10.6
2627
单株
0
, 百拇医药
5
25
13.2
19.8
17.4
3595
单株
0
5
25
12.6
16.0
19.3
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2036
2627
混合
0
5
25
12.8
14.0
14.2
注： 所用培养基为表1中的No.3，另加有10%MgSO4液10cm3，5%N-苯基甘氨酸1cm3，加Co2+或不加Co2+，培养时间：连续5d。
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2.3 B12生产过程中pH值的变化
图1 No.2627和3595两株海洋细菌维生素B12生产中产力与pH值变化图
图1可见No.2627和3595两株细菌在各自B12生产过程中培养液pH值的变化状态(培养基同表3，但未加Co2+)。由该图可见，pH值于发酵初期(50h以前)下降很快，B12产量也不大。到了中期(50～100h)，B12产力处于上升、稳定阶段，而pH也逐渐碱化。到了后期(100h以后)，pH值更大，B12生产和积累走向衰落。随着生产进程加深，pH值碱化，B12积累下降，说明过高pH值的培养液不利于所试菌株的B12生产。当然这一情况尚需具体分析。比如在另一个实验中，一直处于弱酸环境中的No.2634菌株之B12产力水平一直不高、变幅不大，这样生产过程势必拉长，成本增加。总之在一定限度内，pH值由小逐步变大至适当的碱性时，可能有利于B12菌生长和B12积累。
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2.4 培养时间长短对B12生产影响的比较
表4 不同培养时段海洋维生素B12产生菌产力比较 培养时间h
22
46
67
81
96
120
144
168
190
216
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菌 54
0
9.3
10.4
10.1
11.5
太小
10.3
11.5
—
—
株 2627
17.6
, 百拇医药
15.9
19.7
19.6
19.0
19.0
17.0
17.7
—
—
编 2749
12.3
12.6
15.7
, 百拇医药
12.7
14.0
9.7
11.2
11.8
—
—
号 3595
12.2
14.3
13.7
13.6
14.9
, http://www.100md.com
13.2
13.5
12.5
13.1
12.5
注：所用培养基同表3，但不加Co2+，Vit.B12产力以E.coli给出的生长圈直径(mm)，“-”未参试。
表4是4株菌分别在22～216h间的10个培养时段上得出的B12产力比较，统计表4的数据得出：4株菌B12产力的各个平均值大小依各培养时段排序如下：67h(14.9)>96h(14.9)>81h(14.0)>120h(14.0)>168h(13.7)>190h(13.1)>46h(13.0)>216h(12.5)>22h(14.0)。
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B12产量出现高峰时间，两株菌(No.2627和No.2749)在67h，另两株菌No.54和No.3595则在96h时。No.54在168h时也见B12产量高峰。在67～96h间，No.54菌株B12的平均产力为10.7mm,No.2627、2749和3595分别为19.4、14.1和14.1mm。这期间B12产力均比各自的全时期平均B12产力大(相应地，No.54、2627、2749和3595产力分别为9.0、18.2、12.5和13.4mm)，表明67～96h为这4株菌B12生产高峰期。各株菌平均的B12产力大小排序为：No.3539,No.2749,No.54。方差分析结果也表明该4株菌B12产力间差异十分明显(P<0.005)。总体讲，更短或更长的收获期很可能得不到好的B12生产效益。
2.5 单株或混合培养时B12产力的比较
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表5 单株或混合培养时海洋维生素B12产生菌产力的比较 菌株号
(No.)
培养方式
B12产力(E.coli113-3生长圈直径mm)
培养液终pH值
72h
120h
72h
120h
54
单株
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9.8
9.7
6.7
7.2
2036
单株
9.8
10.6
5.0
5.7
2627
单株
14.3
, 百拇医药
13.3
8.2
7.7
2749
单株
9.6
11.7
7.2
7.2
3595
单株
11.5
11.3
, 百拇医药
7.7
7.7
2036
2627
混合
13.9
13.6
7.2
8.0
2627
2749
混合
11.7
, 百拇医药
13.0
7.2
7.2
54
2627
3595
混合
12.4
13.9
8.0
8.0
注：所用培养基同表3，但不加Co2+，加5%的N-苯基甘氨酸1cm3。
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表5列出了5个单株培养和3种不同混合培养菌的B12产力比较。据该表作的统计可见，72h时5个单株培养的B12产力平均为11.1mm，3种混养平均B12产力为12.7mm,120h时单养的B12产力平均为11.3mm。混养平均产力为13.5mm，最差的单株菌是No.2749，最好株是No.2627。最差混养是No.2749+No.2627，最好混养是No.2036+No.2627。总的来看，混养B12产力好于单养。72h和120h的单株和混株培养，其B12的各自平均产力分别为12.1和11.6mm，表明培养时间短，B12产量显尚低之势(与2.4中所述一致)。试验还表达出保持7.2～8.2的pH值至少96h的合适培养液对B12生产有利。
3 结语
按微生物学方法用E.coli113-3测试了14株海洋细菌的B12产力，结果表明，改进的Zobell 2216培养基可作为海上或室内初筛B12菌用培养基。在以豆饼为基质的海水培养基中，参试菌将可显示较明确的B12产力。在此基础上选择菌株作添加Co2+、不同发酵时间、单养或混养及发酵期pH值变化与B12产力的关系等的试验表明，适当添加Co2+至培养基可促使B12的合成和生产。合适调节和保持发酵液偏碱性(如pH值为7.2～8.4)达96h有利于B12生产和积累。一定菌株的混养优于单养。结果表明菌株No.2627单养或它与No.2036菌株混养于豆饼等浸提的海水培养基中，添加钴离子等适当盐类，经4d以上的发酵可能得到较好的B12效益。对海洋维生素B12产生菌的性状及其B12生产条件值得进一步探讨。
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致谢：本实验张学雷同志对部分数据进行了统计学处理，在此表示感谢。
参考文献
1，陈皓文.海洋维生素B12供求变化及其生态意义.海洋科学，1980，3：51～54
2，西岛敏隆、孙修勤、火田幸彦.沿岸海域カら分离レ十二酵母の的B群ビタミン要求，Bull Mar Sei Fish, Kochi Unir, 1989,11:61～67
3，陈曾三.维生素B12工业化生产新方法，发酵科技通讯，1995，24(1)：42
4，Rawx E, Lanais A, et al. Cobalamin (Vitamin B12)biosgsthesis:identification and characterization of a Bacillus megaterlum Cobl oper on. Biochem J，1998, 335(11):159
, 百拇医药
5，Starr，TT, Jones ME,Martineg D.The production of Vitamin B12 active substances by marine bacteria. Limnol Oceangr, 1957,2:114～119
6，仓田，木俣正夫.海洋性ビタミンB12生产菌ビのタミン生产性，京都大学食粮科学研究所报告，1970，33：1～9
7，Yongsmith，B,Sonomoto K, Tanaka A, et al.Production of Vitamin B12 by immebiliged cells of a Propionic acid bacterium, Eur J Appl Microbiol Biotechnol.1982,16:70
(收稿日期：2000-05-20), 百拇医药
单位：陈皓文(国家海洋局第一海洋研究所，青岛 266061)；刘秀云 高月华(中国科学院海洋研究所，青岛 266071)
关键词：海洋细菌，维生素B12生产，B12菌培养条件
中国海洋药物000603 摘 要 用大肠埃希氏菌(Escherichia coli)113-3测定14株分离自我国海域的海洋细菌维生素B12(Vit B12)产力。试验了它们产生B12的培养基及培养条件。结果表明，以海水浸提豆饼并添加一些营养组成的培养基适于进一步确定产B12的菌种。培养基中适当添加二氯化钴等盐类有利于B12合成。培养基酸碱度在所试菌种发酵过程中随时间延长而提高。保持偏碱性约96h，可获得较好的B12生产效益。所测菌株中，No.2627菌株表现良好。有No.2627菌株的混合培养，B12产力常常有潜力和优势可取。
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STUDY ON CULTURE CONDITION OF MARINE VITAMIN B12-PRODUCING BACTERIA
Chen Haowen，Liu Xiuyun，Gao Yuehua
(First Institute of Oceanography, SOA, QingDao 266061)
ABSTRACT The vitamin B12 Productivity of 14 marine bacterial strains isolated from the China Sea was determined microbiologically using Escherichia coli 113-3.
Tests were made on the culturing media and culture conditions for Vitamin B12 production. The results showed that the culturing medium in which the extract from soybean cake with seawater and some nutriments were added was suitable to recognize further some marine Vitamin B12-producing bacterial strains. The medium with appropriate cobalt chloride and some salts added may be useful for Vitamin B12 biosynthesis. The PH value of the fermentation for the testing strains was raised with the lapse of time for fermentation. A better Vitamin B12-production may be obtained by keeping the fermentation liquid slightly basic till about 96h. No.2627 strain in all the strains tested showed well in the productivity. The mixed cultivation of some strains (including No.2627 strain) tested often has potentiality and superiority for Vitamin B12-production.
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KEY WORDS: Marine bacteria, Vitamin B12 Production, Culturing conditions of Vitamin B12-producing bacteria.
维生素B12(本文简称为B12，下同)是自然界已知结构中较复杂的非聚合有机化合物，在医药、人和生物营养上具重要应用价值，如可促进、恢复造血功能，对恶性贫血症有疗效，可防止脂肪肝在肝脏中沉着，还可治疗神经痛等疾患。在各种水生态系统中发挥不可替代的重要作用[1、2]。迄今尚无法借助化学手段来实际生产B12。长期以来人们只从陆源或淡水微生物中筛选有限的B12生产菌株(简称B12菌，下同)以发酵法生产B12[3、4]。随着人口膨胀和资源短缺的压力，探索B12菌的眼光已更多地投向海洋[5、6]。我们对取自我国海域的一些初筛为B12菌的菌作培养条件等研究，以期为确定和构建出优秀工程B12菌提供依据。
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1 材料和方法
1.1 培养基 共计有7种，见表1。
表1 海洋维生素B12菌试用培养基成分一览表 编号
培养基名称
培养基成分及制作
1
改进的Zobell 2216
蛋白胨5g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，陈海水1000cm3。
2
玉米粒海水
玉米粒200g+陈海水1000cm3，3d后，2次热压，8层纱布滤得清液，加10%KNO3、10%KH2PO4、10%NH4NO3各10cm3。
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3
豆饼海水
豆饼40g+陈海水300cm3，煮沸后浸泡半日，热压后取清液，加陈海水至1000cm3,10%KH2PO4 5cm3。
4
花生饼海水
花生饼40g+陈海水300cm3，煮沸，浸泡半日，热压后取清液，加陈海水至1000cm3，10%KH2PO4 5cm3。
5
玉米浆海水
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玉米浆5g+陈海水500cm3；10%KNO3、10%NH4NO3、10%KH2PO4各5cm3。
6
豆饼、玉米浆海水
No.3培养基：No.5培养基=1：3 混合
7
花生饼+玉米浆海水
NO.4培养基：No.5培养基=3：10 混合
注：以上各种培养基都加有0.01%的FePO4，30cm3分装前，调pH至7.4，101b 30′消毒；玉米粒、豆饼和花生饼为市售；济南第二制药厂产玉米浆。1.2 参试菌株 从收藏的初筛自中国海的部分B12菌菌株中随机抽取14株，编号分别为No.37、54、79、172、209A、279、822、933、2000、2036、2494、2627、2749及3595。用前在No.1 液体培养基中活化24h后接一环入表1的相应培养基中25℃振荡培养(120r*min-1)数日，待测B12产力。
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1.3 B12产力的鉴定 用来鉴定参试菌株B12产力的菌种为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)113-3。E.coli 113-3培养和B12的鉴定和差别方法见华北制药厂的“维生素B12含量测量(微生物杯蝶法)”。根据该E.coli113-3在培养基上显示的生长圈大小，并与所用标准Vit.B12浓度作对照，以比较和分析所试菌B12产力的大小。
以下1.4～1.7除特指外，所用培养基为No.3(下述)，培养法同1.2。B12产力按1.3测。
1.4 Co2+盐对B12产力的影响试验
在培养基中添加CoCl2,其浓度从0～25g*m-3(W/V)。参试单株菌分别为No.2036、2627或3595，混合株为No.2036+No.2627,连续培养5d后，分别测B12产力。
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1.5 不同培养时段B12产力的比较试验
比较4株菌(即No.54、2627、2749、3595)及不同培养时间段(从22～216h间分10次，即22、46、67、81、96、120、144、168、190及216h)的B12产力。
1.6 B12生产过程中pH值变化的测定
分别试验两单株细菌(即No.2627和No.3595)B12生产过程中pH值变化，以掌握pH值与B12产力间的关系。培养时间最长持续216h。
1.7 单株或混株培养的B12产力比较
分别选取No.54、2036、2627、2749和3539为单株，选取No.54+No.2627+NO.3539+No.2036+No.2627或No.2627+No.2749为3个混合菌株培养，比较72h和120h时不同菌株及其组合的B12产力。
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2 结果和讨论
2.1 培养基的比较表2 海洋维生素B12菌在不同培养基上B12产力比较 菌株编号No.
37
79
172
209A
279
822
933
2000
2494
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2627
空白
对照
生长圈平均值
(mm)
1
15.7
15.7
16.2
13.1
晕圈
晕圈
15.0
, http://www.100md.com
太小
晕圈浓
13.7
晕圈
14.9
培 2
12.0
14.6
14.9
15.9
0
0
14.4
, 百拇医药
太小
15.3
17.1
0
14.9
养 3
太小
14.8
16.2
15.6
0
0
15.2
, 百拇医药
太小
17.5
19.2
0
16.4
基 4
太小
13.5
17.1
14.2
0
0
17.3
, 百拇医药
太小
14.6
19.3
0
16.0
编 5
16.3
9.5
15.8
14.4
0
0
14.6
, http://www.100md.com
太小
11.8
18.1
晕圈
14.4
号 6
18.3
晕圈
18.1
15.3
0
0
太小
, 百拇医药
13.5
9.1
9.4
—
14.0
7
0
太小
17.9
13.6
—
—
—
—
, 百拇医药
—
—
晕圈
15.8
平均
15.6
13.6
16.6
14.6
—
—
15.3
<13.5
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13.7
16.1
≈0
-
注：培养时间：振荡58h+静止38h;Vit B12产力以E.coli113-3生长圈直径(mm)表示(下同)；标准Vit B12
(0.005mg*m-3)的E.coli生长圈均为13.5mm；“—”未参试；“晕圈”、“太小”为不计入者。
仅计算“0”以外的有效数。
表2比较了表1中各培养基中B12产力的状况。由表2可见，10株菌在7种培养基中平均的B12产力大小(即E.coli生长圈直径mm，下同)排序按培养基号分别为No.3(16.4)>No.4(16.0)>No.7(15.8)>No.1(14.9)=No.2(14.9)>No.5(14.4)>No.6(14.0)。这说明豆饼(No.3)、花生饼(No.4)或花生饼加玉米浆(No.7)的培养基效果好于改进的Zobell 2216(即No.1培养基)。No.1培养基主成分含牛肉膏、蛋白胨等，使其上生长出的细菌可携带多种维生素(包括B12)，因而将干扰真正B12菌的阳性率，抑或降低其B12产力。而且该培养基选择性不强。它不仅可作为从海洋中初筛B12菌用。统计该表数据还说明10株菌在7种培养基中给出的B12产力，各自平均的大小排序为No.172>2627>37>933>209A>2494>79>2000>279=No.822由此初步判断No.2627菌株可能有较好B12产力。方差分析结果显示，不同培养基间、不同菌株间均各有显著差异(P<0.01)。
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以下各试验一般均在No.3培养基基础上进行。
2.2 钴盐对B12产力的作用
钴盐对B12菌产力的作用可见表3。由该表可见，培养基中添加有二氯化钴(CoCl2)，其菌株经5d培养，无论是单株还是混合培养，其B12产力均比未加钴盐的大。平均地说，B12产力大小排序为：加25g*m-3(16.97mm)>5g*m-3(16.60mm)>无钴的(12.30mm)，但No.2627单株培养，其5g*m-3的B12产力却大于25g*m-3时的，这暗示特定菌株的不同培养方式，钴盐的作用是不一样的。还表达出过高钴离子浓度不利于B12生产。正如Yongsmith等(1982)指出的那样，12g*m-3浓度的CoSO4*7H2O最适于丙酸杆菌(Propioribacterium arl AKU1251)在基本培养基中积累B12，而处于固定化状态的该菌在最适培养中，需要20g*m-3浓度的该盐才可使其产生和积累更多B12[7]。
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表3 添加氯化钴对海洋维生素B12产生菌力的影响 菌株编号
培养方式
加钴量(g*m-3)
B12产力〔E.coli生长圈直径(mm)〕
2036
单株
0
10.6
2627
单株
0
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5
25
13.2
19.8
17.4
3595
单株
0
5
25
12.6
16.0
19.3
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2036
2627
混合
0
5
25
12.8
14.0
14.2
注： 所用培养基为表1中的No.3，另加有10%MgSO4液10cm3，5%N-苯基甘氨酸1cm3，加Co2+或不加Co2+，培养时间：连续5d。
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2.3 B12生产过程中pH值的变化
图1 No.2627和3595两株海洋细菌维生素B12生产中产力与pH值变化图
图1可见No.2627和3595两株细菌在各自B12生产过程中培养液pH值的变化状态(培养基同表3，但未加Co2+)。由该图可见，pH值于发酵初期(50h以前)下降很快，B12产量也不大。到了中期(50～100h)，B12产力处于上升、稳定阶段，而pH也逐渐碱化。到了后期(100h以后)，pH值更大，B12生产和积累走向衰落。随着生产进程加深，pH值碱化，B12积累下降，说明过高pH值的培养液不利于所试菌株的B12生产。当然这一情况尚需具体分析。比如在另一个实验中，一直处于弱酸环境中的No.2634菌株之B12产力水平一直不高、变幅不大，这样生产过程势必拉长，成本增加。总之在一定限度内，pH值由小逐步变大至适当的碱性时，可能有利于B12菌生长和B12积累。
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2.4 培养时间长短对B12生产影响的比较
表4 不同培养时段海洋维生素B12产生菌产力比较 培养时间h
22
46
67
81
96
120
144
168
190
216
, 百拇医药
菌 54
0
9.3
10.4
10.1
11.5
太小
10.3
11.5
—
—
株 2627
17.6
, 百拇医药
15.9
19.7
19.6
19.0
19.0
17.0
17.7
—
—
编 2749
12.3
12.6
15.7
, 百拇医药
12.7
14.0
9.7
11.2
11.8
—
—
号 3595
12.2
14.3
13.7
13.6
14.9
, http://www.100md.com
13.2
13.5
12.5
13.1
12.5
注：所用培养基同表3，但不加Co2+，Vit.B12产力以E.coli给出的生长圈直径(mm)，“-”未参试。
表4是4株菌分别在22～216h间的10个培养时段上得出的B12产力比较，统计表4的数据得出：4株菌B12产力的各个平均值大小依各培养时段排序如下：67h(14.9)>96h(14.9)>81h(14.0)>120h(14.0)>168h(13.7)>190h(13.1)>46h(13.0)>216h(12.5)>22h(14.0)。
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B12产量出现高峰时间，两株菌(No.2627和No.2749)在67h，另两株菌No.54和No.3595则在96h时。No.54在168h时也见B12产量高峰。在67～96h间，No.54菌株B12的平均产力为10.7mm,No.2627、2749和3595分别为19.4、14.1和14.1mm。这期间B12产力均比各自的全时期平均B12产力大(相应地，No.54、2627、2749和3595产力分别为9.0、18.2、12.5和13.4mm)，表明67～96h为这4株菌B12生产高峰期。各株菌平均的B12产力大小排序为：No.3539,No.2749,No.54。方差分析结果也表明该4株菌B12产力间差异十分明显(P<0.005)。总体讲，更短或更长的收获期很可能得不到好的B12生产效益。
2.5 单株或混合培养时B12产力的比较
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表5 单株或混合培养时海洋维生素B12产生菌产力的比较 菌株号
(No.)
培养方式
B12产力(E.coli113-3生长圈直径mm)
培养液终pH值
72h
120h
72h
120h
54
单株
, 百拇医药
9.8
9.7
6.7
7.2
2036
单株
9.8
10.6
5.0
5.7
2627
单株
14.3
, 百拇医药
13.3
8.2
7.7
2749
单株
9.6
11.7
7.2
7.2
3595
单株
11.5
11.3
, 百拇医药
7.7
7.7
2036
2627
混合
13.9
13.6
7.2
8.0
2627
2749
混合
11.7
, 百拇医药
13.0
7.2
7.2
54
2627
3595
混合
12.4
13.9
8.0
8.0
注：所用培养基同表3，但不加Co2+，加5%的N-苯基甘氨酸1cm3。
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表5列出了5个单株培养和3种不同混合培养菌的B12产力比较。据该表作的统计可见，72h时5个单株培养的B12产力平均为11.1mm，3种混养平均B12产力为12.7mm,120h时单养的B12产力平均为11.3mm。混养平均产力为13.5mm，最差的单株菌是No.2749，最好株是No.2627。最差混养是No.2749+No.2627，最好混养是No.2036+No.2627。总的来看，混养B12产力好于单养。72h和120h的单株和混株培养，其B12的各自平均产力分别为12.1和11.6mm，表明培养时间短，B12产量显尚低之势(与2.4中所述一致)。试验还表达出保持7.2～8.2的pH值至少96h的合适培养液对B12生产有利。
3 结语
按微生物学方法用E.coli113-3测试了14株海洋细菌的B12产力，结果表明，改进的Zobell 2216培养基可作为海上或室内初筛B12菌用培养基。在以豆饼为基质的海水培养基中，参试菌将可显示较明确的B12产力。在此基础上选择菌株作添加Co2+、不同发酵时间、单养或混养及发酵期pH值变化与B12产力的关系等的试验表明，适当添加Co2+至培养基可促使B12的合成和生产。合适调节和保持发酵液偏碱性(如pH值为7.2～8.4)达96h有利于B12生产和积累。一定菌株的混养优于单养。结果表明菌株No.2627单养或它与No.2036菌株混养于豆饼等浸提的海水培养基中，添加钴离子等适当盐类，经4d以上的发酵可能得到较好的B12效益。对海洋维生素B12产生菌的性状及其B12生产条件值得进一步探讨。
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致谢：本实验张学雷同志对部分数据进行了统计学处理，在此表示感谢。
参考文献
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(收稿日期：2000-05-20), 百拇医药