抗CD40单克隆抗体诱导树突状细胞增殖和分化成熟作用研究
作者：赵文宝 周照华 王月丹 谢炜 张学光
单位：苏州医学院免疫学研究室，苏州，215007
关键词：CD40分子；抗人CD40单抗；树突状细胞；激发作用
苏州医学院学报000603 摘要 目的 探讨CD40分子在树突状细胞和外周血单核细胞表达的意义。方法 将人外周血单核细胞经不同组合的细胞因子共培养获得了树突状细胞，经流式细胞仪表型分析、活细胞计数、混合淋巴细胞反应等方法测定抗人CD40单抗对CD40分子的激发作用。结果 激发型抗人CD40单克隆抗体5C11能促使树突状细胞分化成熟，并且激发后的DCs具有明显的激发T细胞的功能。结论 抗人CD40激发型单抗是一种潜在的免疫激动剂。
中图法分类号 R392.11
Anti-CD40 Monoclonal Antibody Induced Formation and Maturation
, http://www.100md.com
of Dendritic Cells
Zhao Wenbao, Zhou Zhaohua, Wang Yuedan, et al
(Immunology Research Unit, Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Ojective To study the function of CD40 molecules expressed on peripheral monocytes and dendritic cells.Methods Dendritic cells were induced after peripheral monocytes had been cultured in medium with different combination of cytokines;Methods of flow cytomete analysis,cell counting,mixed lymphocyte reaction were used to study the function of agonistic anti-CD40 mAb 5C11.Results Agonistic anti-CD40 monoclonal antibody 5C11 induced formation and maturation of dendritic cells from peripheral monocytes and the DCs induced strongly stimulated T cell activation.Conclusion MAb 5C11 is a potential immunologic stimulator.
, 百拇医药
Key words CD40 molecules;agonistic anti-CD40 monoclonal antibody;dendritic cells;stimulated function
DCs起源于骨髓，与单核巨噬细胞具有共同的祖先，DCs除能从CD34+造血前提细胞诱导之外，还能在IL-4和GM-CSF存在下由CD14+的外周血单核细胞诱导产生[1，2]。外周血单核细胞弱表达CD40分子，而从单核细胞诱导而来的DCs强表达CD40分子。为了进一步研究CD40分子在单核细胞向DCs转化过程中的作用，我们以激发型抗人CD40单抗5C11[3]为手段 ，探讨了其对体外人外周血单核细胞来源的DC的初步作用。现报道如下。
1 材料和方法
1.1 树突状细胞的诱导 按本室建立的方法[4]进行：供血员新鲜外周血用Ficoll/Paque密度梯度离心分离得到单个核细胞(PBMNC)，将PBMNC按每孔1×107细胞/3ml置于含10%胎牛血清的RPMI1640中培养(6孔培养板)，2h后去除非贴壁细胞，贴壁生长的单核细胞中加不同组合的细胞因子：人重组IL-4(100U/ml)(购自法国Diaclone公司)、GM-CSF(1000U/ml,购自北京医科大学)、TNFα(100U/ml,日本东京大学松岛冈治教授赠送)和CD40mAb-5C11(1μg/ml),用相差显微镜观察细胞的形态变化，每隔3d计数细胞活率(胎盼兰染色)，并更换新鲜培养基。于培养的第7d检测DCs的诱导率及表型。
, 百拇医药
1.2 混合淋巴细胞培养(MLR) 常规分离脐带血单个核细胞，将用上述不同方法诱导的DCs与脐带血单个核细胞按1∶20混合，即DCs 1×104，脐带血单个核细胞2×105加于96孔板，以与DCs来源于同一供体的PBMNCs作为阴性对照、PHA作为阳性对照。5%CO2、37℃培养72h，加入MTT继续培养6h，吸弃上清，加酸化异丙醇溶解甲硂颗粒并测定570nm波长的OD值。按下列公式计算刺激指数(Stimulate Index,SI)：SI=实验组OD值/对照组OD值。
2 结果
2.1 5C11对树突状细胞的增殖和分化作用 见图1。图中结果表明，单用5C11对单核细胞来源的DC前体细胞的扩增作用与IL-4+GM-CSF相似，IL-4+GM-CSF与5C11联用可使诱导的细胞数量显著增加，所诱导的DCs CD 1a阳性率达80%，CD83阳性率达58%，证实5C11能通过对CD40分子的激发作用，介导外周血单核细胞向DCs分化及增殖。
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2.2 混合淋巴细胞反应 结果见图2。结果表明，加用激发型抗人CD40单抗后诱导的DCs具有明显的激发T细胞的功能。
图1 5C11对树突状细胞的促增殖和分化作用
-■-Control(0，0)
-▲-GM-CSF+IL-4(CDla；70%，CD83：74%)
-×-GM-CSF+IL-4+5C11(CD1a：80%，CD83：58%)
-◆-Anti-cd40McAb 5C11(CD1a；70%，CD83：49%)
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图2 混合淋巴细胞反应
3 讨论
树突状细胞(DCs)是体内专职的抗原递呈细胞，广泛分布于血液、肝脏、脾脏、淋巴结及其它非免疫组织。DCs表达MHC分子、粘附分子及其它抗原递呈必需的共刺激分子，具有很强的激活天然T(naiveT)细胞的作用，已成为肿瘤免疫治疗的一大热点。在特异性免疫反应中，特异性CTL的激发和扩增必须首先由Th细胞与APC细胞(DCs)相互作用，既而激发了的DCs再将信号传给CTL，其中DCs在Th细胞和CTL之间起了桥梁作用。然而，最近的研究发现，CTL的激发可以通过调控DCs上的CD40分子而绕过Th细胞。这无疑对激发体内CTL提供了新的手段[5]。
单核细胞和巨噬细胞亦为重要的抗原递呈细胞，但它们的抗原递呈能力均不能与DCs相比。然而，CD14+的外周血单核细胞能在M-CSF刺激下分化成为巨噬细胞或在GM-CSF与IL-4共培养中分化成DCs[6]，这种条件下形成的DCs呈均一性群体，为不成熟DCs，并能在炎性因子如TNF-α、IL-1或LPS刺激下被诱导而分化成熟[7～10]。来源于单核细胞的这种不成熟DCs，仍保留M-CSF受体，并在成熟过程中逐渐失去这些受体[11]。因此，可以认为单核细胞是DCs或巨噬细胞来源丰富的前体细胞，而单核细最终向何种细胞分化，关键取决于外源性细胞因子。单核细胞弱表达CD40分子，Peter等最近报道，应用CD40L转基因细胞可以在不需要GM-CSF的情况下诱导外周血单核细胞分化成熟为功能性树突状细胞[12]。本文实验也发现，用激发型CD40mAb-5C11可以在无需GM-CSF的情况下，显著地扩增单核细胞来源的DCs，且激发后的DCs具有成熟的标志和明显激发T细胞的功能。
, 百拇医药
国家自然科学基金杰出人才基金资助课题(39625024)和江苏省科委自然基金资助重点项目(BJ98100)
参 考 文 献
[1] Caux C,Dezutter-Dambuyant C,Schmitt D,et al.GM-CSF and TNF-α cooperate in the generation of dendritic Langerhans cells.Nature,1992,360∶258
[2] Flores-Romo L,Bjorck P,Duvert V,et al.CD40 ligation on human cord blood CD34+hematopoietic progenitors induces their proliferation and differentiation into functional dendritic cells. J Exp Med,1997,185∶341
, http://www.100md.com
[3] 周照华，王江方，王月丹，等.一株特殊功能的抗人CD40单克隆抗体的获得及其生物学特性分析.中国免疫学杂志，1999，15(12)∶529
[4] Wang Y D,Qiu Y H,Xie W,et al.Induction and phenotypic analysis of dendritic cells from fetal liver.Acta Academiae Medicinae Suzhou,1998,4∶61
[5] Ridge J P,Rosa F D,Matzinger P.A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ T-helper and a T-killer cell.Nature,1998,393∶474
[6] Szabolcs P,Avigan D,Gezlter S, et al.Dendritic cells and macrophagees can mature independently from a human bone marrow-derived,post-colony-foming unit intermediae.Blood,1996,87∶4520
, http://www.100md.com
[7] Romani N,Reider D,Heuer M,et al.Generation of mature dendritic cells from human blood.An improved method with special regard to clinical applicability. J Immunol Methods,1996,196∶137
[8] Peters JH,Gieseler R,Thiele B,et al.Dendritic cells:from ontogenetic orphans to myelomonocytic descendants.Immunol Today,1996,17∶273
[9] Piemonti L,Bemasconi S,Luini W,et al.IL-13 supports differentiation of dendritic cells from circulating precursors in concert with GM-CSF.Eur Cytokine Netw,1995,6∶245
, 百拇医药
[10] Zhou LI,Teddet TF.CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells.proc Natl Acad Sci USA，1996,93∶2588
[11] Bender A,Sapp M,Schuler G,et al.Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood.J Immunol Methods，1996,196∶121
[12] Peter B,Grünebach F,Stuhler G,et al.Generation of functional human dendritic cells from adherent peripheral blood monocytes by CD40 ligation in the absence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.Blood,1998,92(11)∶4238
(2000年2月18日收稿), http://www.100md.com
单位：苏州医学院免疫学研究室，苏州，215007
关键词：CD40分子；抗人CD40单抗；树突状细胞；激发作用
苏州医学院学报000603 摘要 目的 探讨CD40分子在树突状细胞和外周血单核细胞表达的意义。方法 将人外周血单核细胞经不同组合的细胞因子共培养获得了树突状细胞，经流式细胞仪表型分析、活细胞计数、混合淋巴细胞反应等方法测定抗人CD40单抗对CD40分子的激发作用。结果 激发型抗人CD40单克隆抗体5C11能促使树突状细胞分化成熟，并且激发后的DCs具有明显的激发T细胞的功能。结论 抗人CD40激发型单抗是一种潜在的免疫激动剂。
中图法分类号 R392.11
Anti-CD40 Monoclonal Antibody Induced Formation and Maturation
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Zhao Wenbao, Zhou Zhaohua, Wang Yuedan, et al
(Immunology Research Unit, Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Ojective To study the function of CD40 molecules expressed on peripheral monocytes and dendritic cells.Methods Dendritic cells were induced after peripheral monocytes had been cultured in medium with different combination of cytokines;Methods of flow cytomete analysis,cell counting,mixed lymphocyte reaction were used to study the function of agonistic anti-CD40 mAb 5C11.Results Agonistic anti-CD40 monoclonal antibody 5C11 induced formation and maturation of dendritic cells from peripheral monocytes and the DCs induced strongly stimulated T cell activation.Conclusion MAb 5C11 is a potential immunologic stimulator.
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Key words CD40 molecules;agonistic anti-CD40 monoclonal antibody;dendritic cells;stimulated function
DCs起源于骨髓，与单核巨噬细胞具有共同的祖先，DCs除能从CD34+造血前提细胞诱导之外，还能在IL-4和GM-CSF存在下由CD14+的外周血单核细胞诱导产生[1，2]。外周血单核细胞弱表达CD40分子，而从单核细胞诱导而来的DCs强表达CD40分子。为了进一步研究CD40分子在单核细胞向DCs转化过程中的作用，我们以激发型抗人CD40单抗5C11[3]为手段 ，探讨了其对体外人外周血单核细胞来源的DC的初步作用。现报道如下。
1 材料和方法
1.1 树突状细胞的诱导 按本室建立的方法[4]进行：供血员新鲜外周血用Ficoll/Paque密度梯度离心分离得到单个核细胞(PBMNC)，将PBMNC按每孔1×107细胞/3ml置于含10%胎牛血清的RPMI1640中培养(6孔培养板)，2h后去除非贴壁细胞，贴壁生长的单核细胞中加不同组合的细胞因子：人重组IL-4(100U/ml)(购自法国Diaclone公司)、GM-CSF(1000U/ml,购自北京医科大学)、TNFα(100U/ml,日本东京大学松岛冈治教授赠送)和CD40mAb-5C11(1μg/ml),用相差显微镜观察细胞的形态变化，每隔3d计数细胞活率(胎盼兰染色)，并更换新鲜培养基。于培养的第7d检测DCs的诱导率及表型。
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1.2 混合淋巴细胞培养(MLR) 常规分离脐带血单个核细胞，将用上述不同方法诱导的DCs与脐带血单个核细胞按1∶20混合，即DCs 1×104，脐带血单个核细胞2×105加于96孔板，以与DCs来源于同一供体的PBMNCs作为阴性对照、PHA作为阳性对照。5%CO2、37℃培养72h，加入MTT继续培养6h，吸弃上清，加酸化异丙醇溶解甲硂颗粒并测定570nm波长的OD值。按下列公式计算刺激指数(Stimulate Index,SI)：SI=实验组OD值/对照组OD值。
2 结果
2.1 5C11对树突状细胞的增殖和分化作用 见图1。图中结果表明，单用5C11对单核细胞来源的DC前体细胞的扩增作用与IL-4+GM-CSF相似，IL-4+GM-CSF与5C11联用可使诱导的细胞数量显著增加，所诱导的DCs CD 1a阳性率达80%，CD83阳性率达58%，证实5C11能通过对CD40分子的激发作用，介导外周血单核细胞向DCs分化及增殖。
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2.2 混合淋巴细胞反应 结果见图2。结果表明，加用激发型抗人CD40单抗后诱导的DCs具有明显的激发T细胞的功能。
图1 5C11对树突状细胞的促增殖和分化作用
-■-Control(0，0)
-▲-GM-CSF+IL-4(CDla；70%，CD83：74%)
-×-GM-CSF+IL-4+5C11(CD1a：80%，CD83：58%)
-◆-Anti-cd40McAb 5C11(CD1a；70%，CD83：49%)
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图2 混合淋巴细胞反应
3 讨论
树突状细胞(DCs)是体内专职的抗原递呈细胞，广泛分布于血液、肝脏、脾脏、淋巴结及其它非免疫组织。DCs表达MHC分子、粘附分子及其它抗原递呈必需的共刺激分子，具有很强的激活天然T(naiveT)细胞的作用，已成为肿瘤免疫治疗的一大热点。在特异性免疫反应中，特异性CTL的激发和扩增必须首先由Th细胞与APC细胞(DCs)相互作用，既而激发了的DCs再将信号传给CTL，其中DCs在Th细胞和CTL之间起了桥梁作用。然而，最近的研究发现，CTL的激发可以通过调控DCs上的CD40分子而绕过Th细胞。这无疑对激发体内CTL提供了新的手段[5]。
单核细胞和巨噬细胞亦为重要的抗原递呈细胞，但它们的抗原递呈能力均不能与DCs相比。然而，CD14+的外周血单核细胞能在M-CSF刺激下分化成为巨噬细胞或在GM-CSF与IL-4共培养中分化成DCs[6]，这种条件下形成的DCs呈均一性群体，为不成熟DCs，并能在炎性因子如TNF-α、IL-1或LPS刺激下被诱导而分化成熟[7～10]。来源于单核细胞的这种不成熟DCs，仍保留M-CSF受体，并在成熟过程中逐渐失去这些受体[11]。因此，可以认为单核细胞是DCs或巨噬细胞来源丰富的前体细胞，而单核细最终向何种细胞分化，关键取决于外源性细胞因子。单核细胞弱表达CD40分子，Peter等最近报道，应用CD40L转基因细胞可以在不需要GM-CSF的情况下诱导外周血单核细胞分化成熟为功能性树突状细胞[12]。本文实验也发现，用激发型CD40mAb-5C11可以在无需GM-CSF的情况下，显著地扩增单核细胞来源的DCs，且激发后的DCs具有成熟的标志和明显激发T细胞的功能。
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国家自然科学基金杰出人才基金资助课题(39625024)和江苏省科委自然基金资助重点项目(BJ98100)
参 考 文 献
[1] Caux C,Dezutter-Dambuyant C,Schmitt D,et al.GM-CSF and TNF-α cooperate in the generation of dendritic Langerhans cells.Nature,1992,360∶258
[2] Flores-Romo L,Bjorck P,Duvert V,et al.CD40 ligation on human cord blood CD34+hematopoietic progenitors induces their proliferation and differentiation into functional dendritic cells. J Exp Med,1997,185∶341
, http://www.100md.com
[3] 周照华，王江方，王月丹，等.一株特殊功能的抗人CD40单克隆抗体的获得及其生物学特性分析.中国免疫学杂志，1999，15(12)∶529
[4] Wang Y D,Qiu Y H,Xie W,et al.Induction and phenotypic analysis of dendritic cells from fetal liver.Acta Academiae Medicinae Suzhou,1998,4∶61
[5] Ridge J P,Rosa F D,Matzinger P.A conditioned dendritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ T-helper and a T-killer cell.Nature,1998,393∶474
[6] Szabolcs P,Avigan D,Gezlter S, et al.Dendritic cells and macrophagees can mature independently from a human bone marrow-derived,post-colony-foming unit intermediae.Blood,1996,87∶4520
, http://www.100md.com
[7] Romani N,Reider D,Heuer M,et al.Generation of mature dendritic cells from human blood.An improved method with special regard to clinical applicability. J Immunol Methods,1996,196∶137
[8] Peters JH,Gieseler R,Thiele B,et al.Dendritic cells:from ontogenetic orphans to myelomonocytic descendants.Immunol Today,1996,17∶273
[9] Piemonti L,Bemasconi S,Luini W,et al.IL-13 supports differentiation of dendritic cells from circulating precursors in concert with GM-CSF.Eur Cytokine Netw,1995,6∶245
, 百拇医药
[10] Zhou LI,Teddet TF.CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells.proc Natl Acad Sci USA，1996,93∶2588
[11] Bender A,Sapp M,Schuler G,et al.Improved methods for the generation of dendritic cells from nonproliferating progenitors in human blood.J Immunol Methods，1996,196∶121
[12] Peter B,Grünebach F,Stuhler G,et al.Generation of functional human dendritic cells from adherent peripheral blood monocytes by CD40 ligation in the absence of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.Blood,1998,92(11)∶4238
(2000年2月18日收稿), http://www.100md.com