hape 反义核酸的构建及其对细胞辐射效应的影响
hape 反义核酸的构建及其对细胞辐射效应的影响
隋建丽 周平坤 侯建毅 杨素红 赵修南
摘要 目的：克隆人AP内切核酸酶基因(hape)cDNA全长编码序列，研究hape反义核酸对细胞辐射敏感性和H2O2细胞毒的影响。方法：反转录PCR克隆人hape cDNA，应用基因重组技术构建真核反义表达载体，用Lipofectamine介导基因转染，细胞克隆形成法分析细胞存活。结果：从人胚肺(HEL)细胞中克隆出hape cDNA全长编码序列，构建了hape的真核反义表达质粒pCIN/AShape并转染HOC8细胞，研究表明hape反义核酸，提高了HOC8细胞对γ射线和H2O2损伤的敏感性。结论：利用分子生物学技术手段，阻断细胞DNA修复过程中的某一环节，是细胞辐射或化疗药物增敏的一种有效途径。
关键词：AP内切核酸酶基因 DNA修复 反义核酸 辐射增敏 H2O2
, 百拇医药
脱嘌呤/脱嘧啶碱基位点(apurinic/apyrimidinic,AP位点)是细胞DNA分子中常见损伤之一，它可以是碱基自发水解、氧化损伤、辐射诱发等产生。其中自发产生的AP位点损伤每个细胞多达104/d。如果AP位点得不到及时有效的修复，将导致细胞突变、死亡等发生。在真核细胞中，AP位点的修复是一个DNA切除修复过程，AP内切核酸酶(APE)在其中起关键作用。APE能识别AP位点，并在损伤处的5’端切断DNA链，启动修复反应。此外，APE还具有3’-5’外切酶、DNA3’修复二酯酶、DNA3’-磷酸酯酶等活性，因而，是一个很重要的多功能DNA修复酶。本研究通过反转录PCR，从人胚肺(HEL)细胞中克隆了hape cDNA全长编码序列，并构建hape反义真核表达质粒，将其转染辐射抗性的人卵巢癌细胞株HOC8中，研究hape反义核酸对细胞辐射敏感性及H2O2损伤反应的影响，尝试一条有效的辐射增敏途径。
材料和方法
, 百拇医药
1.细胞株、菌株及质粒：HEL细胞为北京毒物药物研究所保存，人卵巢癌细胞株HOC8由英国Paterson癌症研究所 J.Hendry教授提供，在含10%小牛血清的DMEM培养液中培养；JM109菌株由本室保存；pBV220质粒由本室保存，pCI-neo和pGEM-T载体购自Promega公司。
2.RNA分离纯化：收集1×107 HEL细胞(第15代)，用异硫氰酸胍-酸酚法提取总RNA[1]。采用Promega的PolyATract mRNA分离试剂盒分离纯化mRNA，具体操作按提供的手册进行。
3.逆转录PCR
(1)逆转录反应：50μl反应液中含mRNA 0.5μg，200μmol/L dNTP,AMV 4U,RNasin 24U,6核甘酸随机引物100 ng，42℃ 1小时，95℃ 5分钟后冰浴冷却。
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(2)PCR：根据文献[2]发表的hape序列合成一对特异性引物，在上、下游引物的5’端分别加上BamHI和EcoRI酶切位点，上游引物序列：5’-CTGAGGATCCATGCCGAAGCGTGGGAAA-3’，下游：5’-GATCGAATTCTCACAGTGCTAGGTATA-
GGGT-3’。
50μl PCR反应液中含反转录产物1.5μl，200μmol/L dNTP，上、下游引物各50pmole, Taq聚合酶2U。PCR条件：94℃ 5分钟→94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟，40个循环→72℃ 10分钟。
4.重组克隆和鉴定技术：①DNA的酶切、连接、转化JM109宿主菌根据分子克隆手册进行[1]。②转化质粒的鉴定：挑取单菌落进行PCR反应快速鉴定。③DNA序列分析：采用Pharmacia公司的T7 SequencingTM试剂盒，测序引物为T7和SP6启动子序列，按说明操作。
, 百拇医药
5.基因转染及筛选鉴定
(1)转染：转染前24小时，接种2.5×105 HOC8于60mm直径平皿中，用Lipofectamine (GIBCOBRL)介导hape反义载体和对照pCI-neo质粒转染HOC8细胞，按试剂盒说明操作。
(2)筛选：细胞转染后48 小时，按1×105/皿的细胞密度接种于90mm直径的培养皿中，加入含800μg/ml G 418的培养液，选择培养3～4星期，期间3～4 天更换一次选择培养液，筛选转化细胞克隆。
(3)鉴定。①单链特异探针的制备(体外转录合成RNA链探针)：按分子克隆手册操作。以T-vector/hape质粒DNA为模板，SP6 RNA聚合酶体外转录合成hape的正义RNA链。10μl反应体系中含模板DNA 0.5μg,rATP,rUTP, rCTP各5mmol/L，[α32-P]rGTP,1.85 MBq,SP6 RNA聚合酶 12U，RNasin 10U,40℃温浴2小时。然后加入1μg DNA酶I，37℃保温15 分钟。酚/氯仿抽提纯化RNA探针。②转化克隆细胞总RNA提取、RNA电泳、Northern印迹杂交按分子克隆手册操作。
, 百拇医药
6.细胞辐射敏感性分析(细胞克隆形成法)：指数生长细胞，冰浴下照射60Coγ射线，吸收剂量率为2 Gy/min。细胞按一定数量接种于60mm直径培养皿中，每个剂量选两个接种细胞数点，各种3皿，在二氧化碳培养箱中培养两星期，结晶紫染色，计算细胞克隆数。
7.H2O2细胞毒性分析：接种一定数量细胞于60mm直径培养皿中，6小时后用0～20μg/ml H2O2处理细胞1小时，然后用PBS洗细胞两次，加入生长培养液继续培养两星期，根据上述方法计算细胞克隆。
8.统计分析用t检验。
结果
1.hape cDNA克隆及其反义真核表达质粒的构建：HEL细胞未经任何刺激处理，提取mRNA经反转录成cDNA,PCR扩增后出现一条0.96 kb的特异带，大小与hape cDNA全长编码序列的理论值一致。PCR产物纯化后与克隆载体pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌JM109，挑取白色菌落，用PCR快速鉴定。对阳性菌落扩大培养，提取重组T-Vector/hape质粒DNA，分别以T7和SP6启动子序列作测序引物，测得所克隆基因两侧200碱基序列与文献报道的hape一致，并且明确hape cDNA在T-Vector中插入方向，即上游端与近SP6启动子侧连接，下游端与近T7启动子侧连接。
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利用限制性内切酶位点，定向构建hape反义真核表达质粒。EcoR I/Not I双酶切从T-Vector/hape 质粒中回收hape cDNA,pCI-neo质粒也用RcoR I/Not I双酶切，使hape cDNA反向插入pCI-neo质粒，转化JM109宿主菌，筛选出重组质粒pCIN/AShape，图1为酶切鉴定结果。
图1 pCIN/AShape质粒酶切鉴定
2.pCIN/AShape等质粒DNA转染HOC8细胞：用Lipofectamine 介导pCIN/AShape和对照pCI-neo质粒转染HOC8细胞，经G418筛选出转化细胞克隆。以hape转录的正义RNA链作探针，Northern 印迹杂交结果表明，转染的hape反义表达载体受CMV I.E启动子和增强子控制下在HOC8细胞中表达(图2)。
图2 hape反义核酸的Northern印迹杂交结果
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3.hape反义核酸对细胞的辐射增敏和增强H2O2细胞毒作用：用细胞克隆形成分析法检测了hape反义核酸对HOC8细胞辐射敏感性和H2O2细胞毒性作用的影响。研究结果显示表达hape反义核酸的pAShape2转化细胞克隆，对γ射线照射(表1)和H2O2(表2)损伤比对照的pCI-neo转化细胞克隆pCIN或HOC8细胞更为敏感。相比之下，hape反义核酸对H2O2细胞毒性的增强作用比辐射增敏效应更为明显。
表1 不同剂量的γ射线照射后HOC8、pCIN和pAShape2的细胞存活率(x±s)
剂 量
(Gy)
细胞存活率(%)
, http://www.100md.com
HOC8
pCIN
pAShape2
0.5
97.8±2.1
91.9±1.9
93.2±2.2
1.0
91.0±4.9
90.3±6.8
73.5±2.2*
2.0
, http://www.100md.com
68.6±4.4
60.7±0.3
42.6±2.6*
4.0
36.2±7.8
22.2±2.8
17.2±2.4*
6.0
12.4±2.5
10.1±0.5
6.5±0.2*
, 百拇医药
10.0
1.4±0.2
1.2±0.1
0.5±0.1*
注：HOC8存活率为6次实验结果均值，pCIN和pAShape2为3次实验均值; 与同剂量照射的HOC8细胞比 * P<0.01表2 不同浓度H2O2对HOC8和pAShape2细胞的毒性作用(x±s)
H2O2浓度
(μg/ml)
细胞存活率(%)
HOC8
, 百拇医药
pAShape2
2.5
34.1±3.4
12.7±1.3*
5.0
32.8±2.1
11.4±0.3*
7.5
21.9±3.2
6.2±0.7*
10.0
, 百拇医药 18.5±1.4
3.6±0.1*
15.0
8.5±0.8
0.8±0.1*
注：表中数字为3次实验结果均值; 与同剂量照射的HOC8细胞比 * P<0.01
讨论
提高组织细胞对电离辐射损伤的敏感性，是改善临床肿瘤放射治疗疗效的一个重要措施，至今许多学者根据不同作用原理设计了各不相同的辐射增敏药物[3]，但有些又因明显的毒性作用限制了其临床应用。DNA损伤修复对细胞辐射反应有着重要的影响，利用分子生物学技术手段，抑制细胞DNA修复过程中的某一环节，将是细胞辐射增敏的一种新的思路和尝试。
, 百拇医药
本研究通过反转录PCR，从HEL细胞中，克隆hape cDNA的全长编码序列，构建了反义真核表达质粒并转染人卵巢癌HOC8细胞。导入的hape反义载体在HOC8细胞中表达。
研究表明hape反义核酸提高了HOC8细胞对H2O2损伤的敏感性，说明H2O2能引起细胞DNA形成AP位点损伤，并通过有HAPE参与的DNA修复反应进行修复，此结果与Walker等[4]和Ono等[5]的报道一致。他们所用的细胞分别为HeLa细胞和大鼠胶质瘤C6细胞，此外在他们的报告中还显示hape反义核酸增强细胞对博莱霉素、二甲基磺酸酯和丝裂酶素C的敏感性，但对紫外线损伤无影响，说明hape将是很多化疗药物增敏的一个有效靶分子。
本研究结果还表明hape反义核酸能提高细胞对γ射线损伤的敏感性，相比之下在细胞培养体系中，hape反义核酸的电离辐射增敏作用幅度比上述化学药物稍低，提示AP位点损伤对γ射线照射所致细胞死亡的贡献相对要小。那么，hape能否作为电离辐射增敏靶基因还得从整体来考虑。我们知道肿瘤组织的供氧和细胞中含巯基化合物的氧化还原状态对放疗效果有着重要影响，值得一提的是细胞在缺氧状态下hape的表达明显提高，并且通过反义核酸抑制hape表达后明显增加缺氧引起的细胞死亡[4]。hape表达产物除DNA修复酶活性外，还具有氧化还原(redox)作用，实际上与氧化还原因子-1(Ref-1)就是同一分子[6，7]，其作用在于调节转录因子AP-1(Fos/Jun)中保守的半胱氨酸残基的氧化还原状态，从而影响AP-1的DNA结合活性和基因转录调节作用。已知转录因子AP-1在电离辐射损伤修复过程中的基因表达调控反应中发挥重要作用[8，9]，因此，hape反义核酸可能在整体应用中具有多个途径的调节细胞辐射反应作用。
, 百拇医药
作者单位：100850 北京放射医学研究所(隋建丽、周平坤、杨素红)；北京毒物药物研究所(赵修南)；解放军北京医学高等专科学校(侯建毅)
参考文献
[1]Sambrook J, Firtsh EF, Maniatis T.Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,1:5-82;7:6-23.
[2]Akiyama K,Seki S, Oshida T, et al. Structure, promoter analysis and chromosomal assignment of the human APEX gene. Biochem Biophys Acta, 1994, 1219:15-25.
, http://www.100md.com
[3]郑秀龙.放射增敏作用机理.国外医学放射医学核医学分册,1993,17:247-248.
[4]Walker LJ, Craig RB, Harris AL,et al. A role for the human DNA repair enzyme HAPE in cellular protection against DNA damaging agents and hypoxia. Nucleic Acids Res, 1994,22:4884-4889.
[5]Ono Y,Furuta T, Ohmoto T,et al. Stable expression in rat glioma cells of sense and antisense nucleic acids to a human multifunctional DNA repair enzyme, APEX nuclease. Mutat Res, 1994, 315:55-63.
, 百拇医药
[6]Xanthoudakis S, Miao GG, Curran T. The redox and DNA-repair activities of Ref-1 are encoded by nonoverlapping domains. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:23-27.
[7]Hirota K, Matsui M, Iwata S, et al. Ap-1 transcription activity is regulated by a direct association between thioredoxin and Ref-1. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:3633-3638.
[8]Little J.Changing views of cellular radiosensitivity. Radiat Res, 1994, 140:299-311.
[9]Lehnert S. Gene induction and adaptive response in irradiated cells: mechanisms and clinical implication. Radiat Res, 1995,141:108-111., 百拇医药
隋建丽 周平坤 侯建毅 杨素红 赵修南
摘要 目的：克隆人AP内切核酸酶基因(hape)cDNA全长编码序列，研究hape反义核酸对细胞辐射敏感性和H2O2细胞毒的影响。方法：反转录PCR克隆人hape cDNA，应用基因重组技术构建真核反义表达载体，用Lipofectamine介导基因转染，细胞克隆形成法分析细胞存活。结果：从人胚肺(HEL)细胞中克隆出hape cDNA全长编码序列，构建了hape的真核反义表达质粒pCIN/AShape并转染HOC8细胞，研究表明hape反义核酸，提高了HOC8细胞对γ射线和H2O2损伤的敏感性。结论：利用分子生物学技术手段，阻断细胞DNA修复过程中的某一环节，是细胞辐射或化疗药物增敏的一种有效途径。
关键词：AP内切核酸酶基因 DNA修复 反义核酸 辐射增敏 H2O2
, 百拇医药
脱嘌呤/脱嘧啶碱基位点(apurinic/apyrimidinic,AP位点)是细胞DNA分子中常见损伤之一，它可以是碱基自发水解、氧化损伤、辐射诱发等产生。其中自发产生的AP位点损伤每个细胞多达104/d。如果AP位点得不到及时有效的修复，将导致细胞突变、死亡等发生。在真核细胞中，AP位点的修复是一个DNA切除修复过程，AP内切核酸酶(APE)在其中起关键作用。APE能识别AP位点，并在损伤处的5’端切断DNA链，启动修复反应。此外，APE还具有3’-5’外切酶、DNA3’修复二酯酶、DNA3’-磷酸酯酶等活性，因而，是一个很重要的多功能DNA修复酶。本研究通过反转录PCR，从人胚肺(HEL)细胞中克隆了hape cDNA全长编码序列，并构建hape反义真核表达质粒，将其转染辐射抗性的人卵巢癌细胞株HOC8中，研究hape反义核酸对细胞辐射敏感性及H2O2损伤反应的影响，尝试一条有效的辐射增敏途径。
材料和方法
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1.细胞株、菌株及质粒：HEL细胞为北京毒物药物研究所保存，人卵巢癌细胞株HOC8由英国Paterson癌症研究所 J.Hendry教授提供，在含10%小牛血清的DMEM培养液中培养；JM109菌株由本室保存；pBV220质粒由本室保存，pCI-neo和pGEM-T载体购自Promega公司。
2.RNA分离纯化：收集1×107 HEL细胞(第15代)，用异硫氰酸胍-酸酚法提取总RNA[1]。采用Promega的PolyATract mRNA分离试剂盒分离纯化mRNA，具体操作按提供的手册进行。
3.逆转录PCR
(1)逆转录反应：50μl反应液中含mRNA 0.5μg，200μmol/L dNTP,AMV 4U,RNasin 24U,6核甘酸随机引物100 ng，42℃ 1小时，95℃ 5分钟后冰浴冷却。
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(2)PCR：根据文献[2]发表的hape序列合成一对特异性引物，在上、下游引物的5’端分别加上BamHI和EcoRI酶切位点，上游引物序列：5’-CTGAGGATCCATGCCGAAGCGTGGGAAA-3’，下游：5’-GATCGAATTCTCACAGTGCTAGGTATA-
GGGT-3’。
50μl PCR反应液中含反转录产物1.5μl，200μmol/L dNTP，上、下游引物各50pmole, Taq聚合酶2U。PCR条件：94℃ 5分钟→94℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 1分钟，40个循环→72℃ 10分钟。
4.重组克隆和鉴定技术：①DNA的酶切、连接、转化JM109宿主菌根据分子克隆手册进行[1]。②转化质粒的鉴定：挑取单菌落进行PCR反应快速鉴定。③DNA序列分析：采用Pharmacia公司的T7 SequencingTM试剂盒，测序引物为T7和SP6启动子序列，按说明操作。
, 百拇医药
5.基因转染及筛选鉴定
(1)转染：转染前24小时，接种2.5×105 HOC8于60mm直径平皿中，用Lipofectamine (GIBCOBRL)介导hape反义载体和对照pCI-neo质粒转染HOC8细胞，按试剂盒说明操作。
(2)筛选：细胞转染后48 小时，按1×105/皿的细胞密度接种于90mm直径的培养皿中，加入含800μg/ml G 418的培养液，选择培养3～4星期，期间3～4 天更换一次选择培养液，筛选转化细胞克隆。
(3)鉴定。①单链特异探针的制备(体外转录合成RNA链探针)：按分子克隆手册操作。以T-vector/hape质粒DNA为模板，SP6 RNA聚合酶体外转录合成hape的正义RNA链。10μl反应体系中含模板DNA 0.5μg,rATP,rUTP, rCTP各5mmol/L，[α32-P]rGTP,1.85 MBq,SP6 RNA聚合酶 12U，RNasin 10U,40℃温浴2小时。然后加入1μg DNA酶I，37℃保温15 分钟。酚/氯仿抽提纯化RNA探针。②转化克隆细胞总RNA提取、RNA电泳、Northern印迹杂交按分子克隆手册操作。
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6.细胞辐射敏感性分析(细胞克隆形成法)：指数生长细胞，冰浴下照射60Coγ射线，吸收剂量率为2 Gy/min。细胞按一定数量接种于60mm直径培养皿中，每个剂量选两个接种细胞数点，各种3皿，在二氧化碳培养箱中培养两星期，结晶紫染色，计算细胞克隆数。
7.H2O2细胞毒性分析：接种一定数量细胞于60mm直径培养皿中，6小时后用0～20μg/ml H2O2处理细胞1小时，然后用PBS洗细胞两次，加入生长培养液继续培养两星期，根据上述方法计算细胞克隆。
8.统计分析用t检验。
结果
1.hape cDNA克隆及其反义真核表达质粒的构建：HEL细胞未经任何刺激处理，提取mRNA经反转录成cDNA,PCR扩增后出现一条0.96 kb的特异带，大小与hape cDNA全长编码序列的理论值一致。PCR产物纯化后与克隆载体pGEM-T载体连接，转化大肠杆菌JM109，挑取白色菌落，用PCR快速鉴定。对阳性菌落扩大培养，提取重组T-Vector/hape质粒DNA，分别以T7和SP6启动子序列作测序引物，测得所克隆基因两侧200碱基序列与文献报道的hape一致，并且明确hape cDNA在T-Vector中插入方向，即上游端与近SP6启动子侧连接，下游端与近T7启动子侧连接。
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利用限制性内切酶位点，定向构建hape反义真核表达质粒。EcoR I/Not I双酶切从T-Vector/hape 质粒中回收hape cDNA,pCI-neo质粒也用RcoR I/Not I双酶切，使hape cDNA反向插入pCI-neo质粒，转化JM109宿主菌，筛选出重组质粒pCIN/AShape，图1为酶切鉴定结果。
图1 pCIN/AShape质粒酶切鉴定
2.pCIN/AShape等质粒DNA转染HOC8细胞：用Lipofectamine 介导pCIN/AShape和对照pCI-neo质粒转染HOC8细胞，经G418筛选出转化细胞克隆。以hape转录的正义RNA链作探针，Northern 印迹杂交结果表明，转染的hape反义表达载体受CMV I.E启动子和增强子控制下在HOC8细胞中表达(图2)。
图2 hape反义核酸的Northern印迹杂交结果
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3.hape反义核酸对细胞的辐射增敏和增强H2O2细胞毒作用：用细胞克隆形成分析法检测了hape反义核酸对HOC8细胞辐射敏感性和H2O2细胞毒性作用的影响。研究结果显示表达hape反义核酸的pAShape2转化细胞克隆，对γ射线照射(表1)和H2O2(表2)损伤比对照的pCI-neo转化细胞克隆pCIN或HOC8细胞更为敏感。相比之下，hape反义核酸对H2O2细胞毒性的增强作用比辐射增敏效应更为明显。
表1 不同剂量的γ射线照射后HOC8、pCIN和pAShape2的细胞存活率(x±s)
剂 量
(Gy)
细胞存活率(%)
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HOC8
pCIN
pAShape2
0.5
97.8±2.1
91.9±1.9
93.2±2.2
1.0
91.0±4.9
90.3±6.8
73.5±2.2*
2.0
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68.6±4.4
60.7±0.3
42.6±2.6*
4.0
36.2±7.8
22.2±2.8
17.2±2.4*
6.0
12.4±2.5
10.1±0.5
6.5±0.2*
, 百拇医药
10.0
1.4±0.2
1.2±0.1
0.5±0.1*
注：HOC8存活率为6次实验结果均值，pCIN和pAShape2为3次实验均值; 与同剂量照射的HOC8细胞比 * P<0.01表2 不同浓度H2O2对HOC8和pAShape2细胞的毒性作用(x±s)
H2O2浓度
(μg/ml)
细胞存活率(%)
HOC8
, 百拇医药
pAShape2
2.5
34.1±3.4
12.7±1.3*
5.0
32.8±2.1
11.4±0.3*
7.5
21.9±3.2
6.2±0.7*
10.0
, 百拇医药 18.5±1.4
3.6±0.1*
15.0
8.5±0.8
0.8±0.1*
注：表中数字为3次实验结果均值; 与同剂量照射的HOC8细胞比 * P<0.01
讨论
提高组织细胞对电离辐射损伤的敏感性，是改善临床肿瘤放射治疗疗效的一个重要措施，至今许多学者根据不同作用原理设计了各不相同的辐射增敏药物[3]，但有些又因明显的毒性作用限制了其临床应用。DNA损伤修复对细胞辐射反应有着重要的影响，利用分子生物学技术手段，抑制细胞DNA修复过程中的某一环节，将是细胞辐射增敏的一种新的思路和尝试。
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本研究通过反转录PCR，从HEL细胞中，克隆hape cDNA的全长编码序列，构建了反义真核表达质粒并转染人卵巢癌HOC8细胞。导入的hape反义载体在HOC8细胞中表达。
研究表明hape反义核酸提高了HOC8细胞对H2O2损伤的敏感性，说明H2O2能引起细胞DNA形成AP位点损伤，并通过有HAPE参与的DNA修复反应进行修复，此结果与Walker等[4]和Ono等[5]的报道一致。他们所用的细胞分别为HeLa细胞和大鼠胶质瘤C6细胞，此外在他们的报告中还显示hape反义核酸增强细胞对博莱霉素、二甲基磺酸酯和丝裂酶素C的敏感性，但对紫外线损伤无影响，说明hape将是很多化疗药物增敏的一个有效靶分子。
本研究结果还表明hape反义核酸能提高细胞对γ射线损伤的敏感性，相比之下在细胞培养体系中，hape反义核酸的电离辐射增敏作用幅度比上述化学药物稍低，提示AP位点损伤对γ射线照射所致细胞死亡的贡献相对要小。那么，hape能否作为电离辐射增敏靶基因还得从整体来考虑。我们知道肿瘤组织的供氧和细胞中含巯基化合物的氧化还原状态对放疗效果有着重要影响，值得一提的是细胞在缺氧状态下hape的表达明显提高，并且通过反义核酸抑制hape表达后明显增加缺氧引起的细胞死亡[4]。hape表达产物除DNA修复酶活性外，还具有氧化还原(redox)作用，实际上与氧化还原因子-1(Ref-1)就是同一分子[6，7]，其作用在于调节转录因子AP-1(Fos/Jun)中保守的半胱氨酸残基的氧化还原状态，从而影响AP-1的DNA结合活性和基因转录调节作用。已知转录因子AP-1在电离辐射损伤修复过程中的基因表达调控反应中发挥重要作用[8，9]，因此，hape反义核酸可能在整体应用中具有多个途径的调节细胞辐射反应作用。
, 百拇医药
作者单位：100850 北京放射医学研究所(隋建丽、周平坤、杨素红)；北京毒物药物研究所(赵修南)；解放军北京医学高等专科学校(侯建毅)
参考文献
[1]Sambrook J, Firtsh EF, Maniatis T.Molecular cloning, a laboratory manual. 2nd ed. New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989,1:5-82;7:6-23.
[2]Akiyama K,Seki S, Oshida T, et al. Structure, promoter analysis and chromosomal assignment of the human APEX gene. Biochem Biophys Acta, 1994, 1219:15-25.
, http://www.100md.com
[3]郑秀龙.放射增敏作用机理.国外医学放射医学核医学分册,1993,17:247-248.
[4]Walker LJ, Craig RB, Harris AL,et al. A role for the human DNA repair enzyme HAPE in cellular protection against DNA damaging agents and hypoxia. Nucleic Acids Res, 1994,22:4884-4889.
[5]Ono Y,Furuta T, Ohmoto T,et al. Stable expression in rat glioma cells of sense and antisense nucleic acids to a human multifunctional DNA repair enzyme, APEX nuclease. Mutat Res, 1994, 315:55-63.
, 百拇医药
[6]Xanthoudakis S, Miao GG, Curran T. The redox and DNA-repair activities of Ref-1 are encoded by nonoverlapping domains. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91:23-27.
[7]Hirota K, Matsui M, Iwata S, et al. Ap-1 transcription activity is regulated by a direct association between thioredoxin and Ref-1. Proc Natl Acad Sci USA, 1997, 94:3633-3638.
[8]Little J.Changing views of cellular radiosensitivity. Radiat Res, 1994, 140:299-311.
[9]Lehnert S. Gene induction and adaptive response in irradiated cells: mechanisms and clinical implication. Radiat Res, 1995,141:108-111., 百拇医药