常压高浓度氧对正常新生大鼠脑组织的影响
作者：戈平 姜毅
单位：戈平(100034 北京医科大学第一医院儿科)；姜毅(100034 北京医科大学第一医院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000616 氧疗是围产期新生儿缺氧性疾病必不可少的治疗手段之一。但长时间吸入高浓度氧对机体、器官有严重的毒性作用。临床应用的高浓度氧主要有常压高浓度氧(normobaric hyperoxia，NH)和高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)两种，前者应用更广泛，但人们对其中枢神经系统(CNS)毒性的研究却不如高压氧普遍和深入。为探讨常压高浓度氧对脑神经细胞的影响、以及是否有细胞凋亡的发生，我们采用光镜、电镜和DNA电泳法对吸常压高浓度氧的大鼠进行研究。
材料和方法
7日龄Wistar大鼠82只，体重12～19 g，随机分为两组，即正常对照组(置于空气中)和吸氧组(吸入体积浓度为100%的氧气 48 h)。两组分别于吸氧停止后第 0 、2、5、7、14天断头处死，取脑组织作HE染色(n=5)，光镜下观察大脑皮质、海马、纹状体、丘脑、黑质、红核等部位。用酚/氯仿抽提法提取双侧皮质、海马、纹状体、丘脑、脑干和小脑组织，(各组织重约80～120 g)的DNA。剥离对照组和吸氧组第0、5天的皮质和海马齿状回(第0天的仅剥离皮质)进行电镜检查(n=3)。统计学处理：实验结果以均值±标准差(±s)表示，两组间比较用非配对t检验，左右脑比较用配对t检验，各实验组与对照组比较以及各实验组之间比较分别用方差分析的D检验和q检验。
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结果
1.一般情况：30只新生大鼠在吸氧过程中及吸氧48 h后均未出现惊厥、瘫痪等异常行为，其中1只大鼠在吸氧过程中死亡(死因不明)。5只(12%)于吸氧后第2～3天局部毛发稀疏、发黄、失去光泽，第2～3天后逐渐恢复正常。
2.脑病理学检查结果：(1)脑大体检查：吸氧组各时间点处死的大鼠脑外观与对照组相比无明显充血、水肿、出血、萎缩等异常变化。(2)光镜下：吸氧组脑组织神经元出现变性，表现为胞浆呈均匀的粉红色嗜酸性染色，尼氏体消失，细胞皱缩，部分细胞胞核深染，核仁不清。未见崩解细胞和吞噬细胞，神经元无脱失，无明显胶质细胞反应。正常对照组几乎未见变性细胞。病变主要累及大脑皮质，呈层状、灶状改变，外侧较内侧改变明显。海马的CA3区和齿状回改变轻微。小脑受累不明显，中央白质仅见少许散在的变性细胞，蒲肯野细胞无明显变化。其他部位如新纹状体、苍白球、丘脑、黑质、红核均未见异常改变。以上脑组织病变于吸氧后第0天即已出现，但病变范围小，细胞变性程度较轻，组织轻度水肿。吸氧后第2天病变范围扩大，细胞变性程度加重。第5天时严重变性的细胞数增多，病变范围达高峰，但水肿消退。第7天后无论是细胞变性程度还是病变范围均趋于减轻，至第14天时基本恢复正常。定量分析：在400倍光镜下取双侧皮质10个视野，每个视野计数100个细胞(共1000个细胞)中的变性细胞数，结果对照组和吸氧组第0、2、5、7、14天的变性细胞数分别为(5±6)、(86±82)、(174±100)、(438±82)、(267±37)、(101±33)个，吸氧组各时间点的变性细胞数均明显多于对照组，吸氧组各时间点之间变性细胞数比较，第5天明显多于第0、2、7、14天(P均<0.05)，第7天明显多于第0天和第14天(P均<0.05)。计数吸氧后第5天左右皮质各500个细胞中的变性细胞数，分别为(226±30)、(212±57)(t=0.78, P>0.05),说明双侧半球病变为对称性改变。(3)电镜下：吸氧组第0天皮质神经元胞浆内线粒体轻度肿胀、线粒体嵴排列紊乱，有小空泡形成。第5天时皮质和海马齿状回神经元胞浆内线粒体肿胀明显、嵴断裂溶解、空泡融合，粗面内质网扩张、部分附着核糖体脱落，胞核无明显异常。胶质细胞亦有类似的改变。对照组及吸氧组均未找到凋亡细胞或凋亡小体。
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3.DNA电泳结果：吸氧组不同时间点的皮质、海马、纹状体、丘脑、脑干和小脑的DNA电泳与对照组相应脑区比较，既未见到细胞坏死时DNA随机降解的模糊涂片状带，亦未见到细胞凋亡时特有的“梯形条带”。
讨论
NH对CNS的病理损害，目前仅有关于突触和内皮细胞的研究报道[1,2]。从本研究结果看，正常新生大鼠持续吸入纯氧48 h可造成脑氧中毒，表现为神经元变性和脑组织水肿。脑损伤在吸氧停止后有从轻到重、再到恢复正常的演变过程。病变部位主要在双侧大脑皮质，呈对称性改变，海马和小脑病变较轻，其他部位未见异常，提示NH对神经元的损伤是有选择性的。Balentine[3]报道HBO下脑易损区是苍白球和黑质，而大脑皮质和海马一般不受损，与我们的结果正相反，这可能是因为实验所用的高氧条件不同。电镜下神经元和神经胶质细胞的改变在胞浆内，而胞核无明显变化，表明神经细胞变性是可逆的，但若延长吸氧时间有可能造成更严重的后果。在预实验中我们曾给正常新生大鼠吸入体积浓度为100% 的氧气24 h，于吸氧停止后第0、2、5、7天处死，光镜下未发现神经元有明显的改变，延长吸氧时间至48 h才可见轻微的超微结构改变，此现象表明高浓度氧对中枢神经系统的损伤可能随着吸氧时间延长而加重，此点尚需进一步研究。此外，我们还发现吸氧后大鼠体重增长受到一定影响，局部毛发出现可恢复性的异常改变，未发现惊厥、瘫痪等神经行为异常现象，这与Balentine[3]报道的新生大鼠在HBO下CNS氧中毒很少出现惊厥和瘫痪相一致。
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脑氧中毒发生的机制考虑有以下几种可能性：(1)氧自由基生成过多。大量实验表明，吸NH很短时间内，脑组织氧自由基和脂质过氧化物含量即显著增加，能造成脑组织氧化损伤。(2)脑血管收缩致脑缺氧损伤。NH下脑组织通过血管收缩以减少过多的氧进入脑组织，这一防御功能存在致脑缺血的危险性，特别是新生鼠脑血管可以持续收缩[4]，当再回到空气中时，则脑组织处于缺血状态，可以造成继发性脑缺氧缺血损伤。(3)脑血管损伤。我们从吸氧后脑组织有轻微水肿推断毛细血管有轻度损伤，这可加重脑组织缺氧。另外不同部位神经元对高氧的内在敏感性也有一定关系。
目前普遍认为氧中毒时氧自由基可触发细胞凋亡，但氧自由基也可氧化损伤膜结构及蛋白质和核酸，严重者可导致细胞坏死。那么脑氧中毒时细胞的损伤形式如何？本研究表明，NH造成的脑细胞损伤是变性，即坏死的最早期表现，无细胞凋亡现象。若延长吸氧时间是否会出现细胞坏死或凋亡，还有待于进一步研究。
总之，我们从病理学角度证实了吸高浓度氧48 h可以造成脑组织氧中毒，主要表现为神经细胞的变性改变，无细胞凋亡现象。脑损伤在停止吸氧一段时间后虽然可以恢复，但如不及时停止吸氧则损伤有可能成为不可逆性的。因此提醒我们在临床工作中不要忽视脑氧中毒问题，尽量避免长时间吸高浓度氧。
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参考文献
1，Gordon-Majszak BW, Gajkowska B. Biochemical and morphological changes in rat brain synaptosomes after expose to normobaric hyperoxia in vivo. Exp Toxic Pathol, 1992, 44: 96-101.
2，Shaikh AY, Xu J, Wu Y, et al. Melatonin protects bovine cerebral endothelial cells from hyperoxia-induced DNA damage and death. Neurosci Lett, 1997, 229: 193-197.
3，Balentine JD. The nervous system. In：Balentine JD, ed. Pathology of oxygen toxicity. New York：Academic Press, 1982. 172-214.
4，Torbati D, Wafapoor H, Peyman GA. Hyperbaric oxygen tolerance in newborn mammals-hypothesis on mechanisms and outcome. Free Radical Biol Med, 1993, 14pp: 695-703.
(收稿日期：1999-05-27), http://www.100md.com
单位：戈平(100034 北京医科大学第一医院儿科)；姜毅(100034 北京医科大学第一医院儿科)
关键词：
中华儿科杂志000616 氧疗是围产期新生儿缺氧性疾病必不可少的治疗手段之一。但长时间吸入高浓度氧对机体、器官有严重的毒性作用。临床应用的高浓度氧主要有常压高浓度氧(normobaric hyperoxia，NH)和高压氧(hyperbaric oxygen，HBO)两种，前者应用更广泛，但人们对其中枢神经系统(CNS)毒性的研究却不如高压氧普遍和深入。为探讨常压高浓度氧对脑神经细胞的影响、以及是否有细胞凋亡的发生，我们采用光镜、电镜和DNA电泳法对吸常压高浓度氧的大鼠进行研究。
材料和方法
7日龄Wistar大鼠82只，体重12～19 g，随机分为两组，即正常对照组(置于空气中)和吸氧组(吸入体积浓度为100%的氧气 48 h)。两组分别于吸氧停止后第 0 、2、5、7、14天断头处死，取脑组织作HE染色(n=5)，光镜下观察大脑皮质、海马、纹状体、丘脑、黑质、红核等部位。用酚/氯仿抽提法提取双侧皮质、海马、纹状体、丘脑、脑干和小脑组织，(各组织重约80～120 g)的DNA。剥离对照组和吸氧组第0、5天的皮质和海马齿状回(第0天的仅剥离皮质)进行电镜检查(n=3)。统计学处理：实验结果以均值±标准差(±s)表示，两组间比较用非配对t检验，左右脑比较用配对t检验，各实验组与对照组比较以及各实验组之间比较分别用方差分析的D检验和q检验。
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结果
1.一般情况：30只新生大鼠在吸氧过程中及吸氧48 h后均未出现惊厥、瘫痪等异常行为，其中1只大鼠在吸氧过程中死亡(死因不明)。5只(12%)于吸氧后第2～3天局部毛发稀疏、发黄、失去光泽，第2～3天后逐渐恢复正常。
2.脑病理学检查结果：(1)脑大体检查：吸氧组各时间点处死的大鼠脑外观与对照组相比无明显充血、水肿、出血、萎缩等异常变化。(2)光镜下：吸氧组脑组织神经元出现变性，表现为胞浆呈均匀的粉红色嗜酸性染色，尼氏体消失，细胞皱缩，部分细胞胞核深染，核仁不清。未见崩解细胞和吞噬细胞，神经元无脱失，无明显胶质细胞反应。正常对照组几乎未见变性细胞。病变主要累及大脑皮质，呈层状、灶状改变，外侧较内侧改变明显。海马的CA3区和齿状回改变轻微。小脑受累不明显，中央白质仅见少许散在的变性细胞，蒲肯野细胞无明显变化。其他部位如新纹状体、苍白球、丘脑、黑质、红核均未见异常改变。以上脑组织病变于吸氧后第0天即已出现，但病变范围小，细胞变性程度较轻，组织轻度水肿。吸氧后第2天病变范围扩大，细胞变性程度加重。第5天时严重变性的细胞数增多，病变范围达高峰，但水肿消退。第7天后无论是细胞变性程度还是病变范围均趋于减轻，至第14天时基本恢复正常。定量分析：在400倍光镜下取双侧皮质10个视野，每个视野计数100个细胞(共1000个细胞)中的变性细胞数，结果对照组和吸氧组第0、2、5、7、14天的变性细胞数分别为(5±6)、(86±82)、(174±100)、(438±82)、(267±37)、(101±33)个，吸氧组各时间点的变性细胞数均明显多于对照组，吸氧组各时间点之间变性细胞数比较，第5天明显多于第0、2、7、14天(P均<0.05)，第7天明显多于第0天和第14天(P均<0.05)。计数吸氧后第5天左右皮质各500个细胞中的变性细胞数，分别为(226±30)、(212±57)(t=0.78, P>0.05),说明双侧半球病变为对称性改变。(3)电镜下：吸氧组第0天皮质神经元胞浆内线粒体轻度肿胀、线粒体嵴排列紊乱，有小空泡形成。第5天时皮质和海马齿状回神经元胞浆内线粒体肿胀明显、嵴断裂溶解、空泡融合，粗面内质网扩张、部分附着核糖体脱落，胞核无明显异常。胶质细胞亦有类似的改变。对照组及吸氧组均未找到凋亡细胞或凋亡小体。
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3.DNA电泳结果：吸氧组不同时间点的皮质、海马、纹状体、丘脑、脑干和小脑的DNA电泳与对照组相应脑区比较，既未见到细胞坏死时DNA随机降解的模糊涂片状带，亦未见到细胞凋亡时特有的“梯形条带”。
讨论
NH对CNS的病理损害，目前仅有关于突触和内皮细胞的研究报道[1,2]。从本研究结果看，正常新生大鼠持续吸入纯氧48 h可造成脑氧中毒，表现为神经元变性和脑组织水肿。脑损伤在吸氧停止后有从轻到重、再到恢复正常的演变过程。病变部位主要在双侧大脑皮质，呈对称性改变，海马和小脑病变较轻，其他部位未见异常，提示NH对神经元的损伤是有选择性的。Balentine[3]报道HBO下脑易损区是苍白球和黑质，而大脑皮质和海马一般不受损，与我们的结果正相反，这可能是因为实验所用的高氧条件不同。电镜下神经元和神经胶质细胞的改变在胞浆内，而胞核无明显变化，表明神经细胞变性是可逆的，但若延长吸氧时间有可能造成更严重的后果。在预实验中我们曾给正常新生大鼠吸入体积浓度为100% 的氧气24 h，于吸氧停止后第0、2、5、7天处死，光镜下未发现神经元有明显的改变，延长吸氧时间至48 h才可见轻微的超微结构改变，此现象表明高浓度氧对中枢神经系统的损伤可能随着吸氧时间延长而加重，此点尚需进一步研究。此外，我们还发现吸氧后大鼠体重增长受到一定影响，局部毛发出现可恢复性的异常改变，未发现惊厥、瘫痪等神经行为异常现象，这与Balentine[3]报道的新生大鼠在HBO下CNS氧中毒很少出现惊厥和瘫痪相一致。
, http://www.100md.com
脑氧中毒发生的机制考虑有以下几种可能性：(1)氧自由基生成过多。大量实验表明，吸NH很短时间内，脑组织氧自由基和脂质过氧化物含量即显著增加，能造成脑组织氧化损伤。(2)脑血管收缩致脑缺氧损伤。NH下脑组织通过血管收缩以减少过多的氧进入脑组织，这一防御功能存在致脑缺血的危险性，特别是新生鼠脑血管可以持续收缩[4]，当再回到空气中时，则脑组织处于缺血状态，可以造成继发性脑缺氧缺血损伤。(3)脑血管损伤。我们从吸氧后脑组织有轻微水肿推断毛细血管有轻度损伤，这可加重脑组织缺氧。另外不同部位神经元对高氧的内在敏感性也有一定关系。
目前普遍认为氧中毒时氧自由基可触发细胞凋亡，但氧自由基也可氧化损伤膜结构及蛋白质和核酸，严重者可导致细胞坏死。那么脑氧中毒时细胞的损伤形式如何？本研究表明，NH造成的脑细胞损伤是变性，即坏死的最早期表现，无细胞凋亡现象。若延长吸氧时间是否会出现细胞坏死或凋亡，还有待于进一步研究。
总之，我们从病理学角度证实了吸高浓度氧48 h可以造成脑组织氧中毒，主要表现为神经细胞的变性改变，无细胞凋亡现象。脑损伤在停止吸氧一段时间后虽然可以恢复，但如不及时停止吸氧则损伤有可能成为不可逆性的。因此提醒我们在临床工作中不要忽视脑氧中毒问题，尽量避免长时间吸高浓度氧。
, 百拇医药
参考文献
1，Gordon-Majszak BW, Gajkowska B. Biochemical and morphological changes in rat brain synaptosomes after expose to normobaric hyperoxia in vivo. Exp Toxic Pathol, 1992, 44: 96-101.
2，Shaikh AY, Xu J, Wu Y, et al. Melatonin protects bovine cerebral endothelial cells from hyperoxia-induced DNA damage and death. Neurosci Lett, 1997, 229: 193-197.
3，Balentine JD. The nervous system. In：Balentine JD, ed. Pathology of oxygen toxicity. New York：Academic Press, 1982. 172-214.
4，Torbati D, Wafapoor H, Peyman GA. Hyperbaric oxygen tolerance in newborn mammals-hypothesis on mechanisms and outcome. Free Radical Biol Med, 1993, 14pp: 695-703.
(收稿日期：1999-05-27), http://www.100md.com