砷对睾丸补体抑制水平的影响及硒的拮抗作用
郑金平 祝寿芬 刘慧荣
摘 要：目的 研究砷对睾丸补体抑制水平的影响及硒的拮抗效应，以探讨砷的生殖毒性的免疫机制。方法 补体溶血抑制实验，测定大鼠睾丸及血清补体抑制水平。结果 以4.6mg/kg体重三氧化二砷(As2O3)灌胃大鼠5周，大鼠睾丸及血清补体抑制率显著低于对照组(P<0.05)。染砷大鼠同时分别给予含硒100，200μg/kg体重的康强硒，睾丸及血清补体抑制率比染砷组显著升高(P<0.05)，与对照组差异不显著(P>0.05)。结论 砷可导致大鼠睾丸补体抑制水平下降，可能与砷引起的精子畸变、流产、不育有关，硒可有效拮抗砷的生殖毒性。
关键词:砷 硒 睾丸 补体抑制率
有报道[1]认为，人的不育症和畸胎与环境中的砷有关。动物实验也表明，砷及化合物(As3+和As5+)可引起小鼠精子数量减少、精子畸形和活动力减弱，严重者可引起流产、畸胎和死胎[2]。此外，砷还可引起机体免疫功能紊乱[3，4]，那么，砷的生殖毒性与免疫毒性之间，是否存在着某种联系呢？有研究表明[5]，血清及精浆中的补体抑制活性与生殖功能密切相关，在精子的发生、成熟、获能等生殖活动中起着举足轻重的作用。我们推测，砷的生殖毒性可能与补体抑制活性有一定关系，因此，本文测定了染砷大鼠血清及睾丸中的补体抑制水平及硒的影响，以探讨砷的生殖毒性的可能机理。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 三氧化二砷(As2O3)，分析纯，北京化工厂生产。康强硒，山西康强硒制药有限公司提供。
1.2 动物分组 实验动物选用雄性Wistar大鼠(由山西医科大学实验动物中心提供)32只，体重170±20g，随机分为(1)对照组(每100g体重1ml蒸馏水)；(2)染砷组(4.6mg/kg);(3)砷+康强硒①组(4.6mg/kg+100μg/kg硒)；(4)砷+康强硒②组(4.6mg/kg+200μg/kg硒)。每组8只，经口灌胃5周。
1.3 样品处理 大鼠断头处死后，迅速取出两侧睾丸,称重，加2倍体积生理盐水制成0.5mg/ml的匀浆，1 000r/min离心10min，取上清液，-30℃保存，使用时按1∶10稀释。
1.4 补体抑制活性的测定[6]
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1.4.1 致敏绵羊红细胞(SRBC)悬液的制备：以无菌方法，取当日用量的SRBC，用巴比妥缓冲液(BBS，pH7.3～7.4)洗3次。取适量压积SRBC与BBS配制3% SRBC悬液，细胞浓度为6×108/ml。取等量单位溶血素，缓缓加入SRBC悬液中，混匀后置37℃水浴15min，使用时1∶2稀释。
1.4.2 补体：取5～10只豚鼠新鲜血清混合，4℃下操作，分装后保存于-30℃备用。每批使用前准确滴定补体效价及能引起75%致敏SRBC溶血(CH75)的补体滴度。
1.4.3 补体抑制活性的测定：以75%溶血(CH75)作为基础溶血率，在原有反应物中加入睾丸上清，应用Micro ELISA板作为标本载体进行操作，加样方法如表1。各反应物加完后充分混匀，37℃水浴60min 2000r/min,离心10min,取上清100μl于另一洁净的Micro ELISA板中，用光密度仪在410nm处测定每一孔的OD值，实验孔的OD值减去相应的空白对照及相应实验对照的OD值，即为实验孔的实际OD值。实验每次平行3孔，每份标本重复2次测定，结果取均值。
, 百拇医药
表1 补体抑制微量溶血实验加样方法(μl)
反应物
实验孔
空白对照
实验对照
CH75
CH100
质控
睾丸上清(1∶10)
补体CH75*
补体CH100**
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致敏SRBC
BBS
50
50
-
50
50
-
-
-
50
150
50
50
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-
-
100
-
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-
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-
50
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50
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50
-
50
50
注：*CH75能引起反应体系中75%致敏SRBC溶血的补体浓度，**CH100能引起反应中100%致敏SRBC溶血的最小补体浓度
1.4.4 结果判断及计算：首先观察5个对照孔，计算原反应体系的实际溶血率及睾丸上清质控孔的补体抑制率。分别求出每一实验孔的补体抑制率，计算方法见公式(1)、(2)。
(1)
睾丸补体抑制能力的大小以原反应体系中的溶血率(PH75)在加入睾丸上清后引起的变化(降低)表示，溶血的程度以光密度仪测定其410nm波长OD值的大小表示。最后，以补体被抑制的百分率表示睾丸补体抑制活性的大小。
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(2)
*C=补体,HSP=睾丸上清。
1.5 资料处理及结果分析 本研究数据为百分数，经平方根反正旋变换后进行统计分析。多组数据间比较用方差分析；多组数据间两两比较用q检验。
2 结果
染砷组大鼠睾丸补体抑制率为38.92%±2.90%,显著低于对照组(P<0.05)；砷+硒①组、砷+硒②组睾丸补体抑制率均显著高于染砷组(P<0.05)，但仍低于对照组(P<0.05)。染砷大鼠血清补体抑制率为36.01±2.99%，显著低于对照组(P<0.05)，；砷+硒①组、砷+硒②组补体抑制率均显著高于染砷组(P<0.05)，与对照组无显著性差异(P>0.05)。见表2。
表2 染砷及砷硒联合染毒大鼠睾丸、血清中补体抑制率
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组别
补体抑制率%(x±s)
睾丸
血清
对照组
染砷组
砷+硒①组
砷+硒②组
50.85±6.67
38.92±2.90a
44.04±2.77a,b
41.76±3.61a,b
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61.30±2.89
36.01±2.99a
73.73±1.35b
57.93±2.07b
注：a与对照组比有显著性差异P<0.05,b与染砷组有显著性差异P<0.05
3 讨论
精子作为一种自身抗原，在许多情况下，均可导致抗精子抗体产生，这种自身抗体与精子抗原结合后，或通过抗体的Fc段结合细胞(巨噬细胞、白细胞、K细胞)，促进细胞吞噬；或启动补体的连锁反应，最终导致在精子细胞表面组装形成大分子的补体攻膜复合物(MAC)，进而造成精子细胞的溶解，从而破坏精子。但在正常精浆中往往具有广泛的免疫抑制作用，保护精子在一定范围内不被抗精子抗体(AsAb)所破坏，其中补体抑制作用则是重要的一种。在大鼠，SGP-2,SP40/40是精浆中重要的补体抑制因子，它们集中分布于睾丸Sertoli细胞和副睾晕(halo)细胞的胞浆，且转化为成熟精子的一部分，分布于精子的顶部、颈部和尾部。研究表明，精浆中的补体抑制因子(SP40/40等凝集素)浓度与精子的形成，精子的活力等密切相关，其浓度高时受孕率亦高。另外，SP40/40等凝集素的另一作用是对暴露于AsAb面前的生殖细胞进行保护，它可防止MAC在生殖细胞上组装，中断补体终末阶段的连锁反应，抑制补体细胞溶解作用对精子的损伤。另外，其他补体抑制因子如：DAF、MCP、CD59等也表达于生殖系统和精子，分别对补体反应的前端反应和终末阶段进行调节，对保护胎儿和精子免受补体侵袭方面有重要意义[5～7]。
, 百拇医药
刘慧荣[6]曾对少精、弱精、畸形精子以及弱精症畸形精子症患者的精浆进行测定，发现其补体抑制活性明显低于正常人。我们的研究发现砷可造成大鼠血清及睾丸中的补体抑制活性明显降低，这样以来，在精子的发生、成熟等过程中，削弱了精子的自身保护作用。同时，因授精部位补体抑制活性的高低会影响授精的成功，所以，砷致血清及睾丸中补体抑制活性的降低可能与砷中毒引起的受孕率下降，精子数减弱，精子畸形率升高等有关。
还有学者发现[8，9]精浆与授精卵免疫耐受的形成有关，精浆中补体抑制因子可以为囊胚提供保护作用，使后者暴露于补体依赖性免疫损伤面前时，仍不受影响。睾丸是精液产生的主要器官之一，在砷的作用下，睾丸的补体抑制水平降低，可造成精浆中补体抑制水平的降低，从而使这种保护作用减弱，有可能与砷造成的流产有一定关系。
另外，刘慧荣研究中发现血清中的补体抑制活性与精浆呈高度正相关。本研究发现砷及砷硒联合作用对血清和睾丸补体抑制活性的影响趋势是一致的，表明砷对血清和睾丸补体抑制活性的影响机制是相同的，用血清中补体抑制水平可推测砷对睾丸或精浆的补体抑制水平。
, 百拇医药
砷致睾丸和血清中补体抑制水平的降低原因可能是：(1)砷与-SH或-S-S有高度亲和性。SP40/40、MCP补体抑制因子均是靠二硫键维持其空间构型[5]，砷与之结合，可导致SP40/40空间结构的改变而失活。(2)砷可直接通过自由基引发的脂质过氧化反应破坏睾丸组织及DNA，使得睾丸细胞不能或减少补体抑制因子的表达。
用砷的拮抗剂硒制剂联合处理大鼠，发现可使染砷大鼠血清和睾丸补体抑制水平显著上升。硒可加速砷从机体中排泄；硒可以与砷竞争-SH和-S-S，从而恢复酶或因子的空间结构；而硒制剂有抗氧化作用，可减少脂质过氧化对细胞膜和DNA的损伤，提高细胞的修复能力。这一结果一方面证实了砷对补体抑制水平的影响及其功能的机制,另一方面也为硒及硒制剂预防和治疗砷中毒，提供依据。
基金来源：山西省卫生厅重点项目(No9602)
作者简介：郑金平，男，1968年生，讲师，医学硕士
, 百拇医药
作者单位：郑金平(山西医科大学，卫生毒理教研组，山西，太原，030001)
祝寿芬(山西医科大学，卫生毒理教研组，山西，太原，030001)
刘慧荣(山西医科大学生，理教研组)
参考文献：
[1]张国禾.砷的胚胎毒性[J].国外医学卫生学分册，1984，11(4)：203.
[2]祝寿芬，仇玉兰，王仲霞.三氧化二砷对小鼠精子形态的影响[J].卫生毒理学杂志，1997，11(2)：122-123.
[3]刘 佳，吴克枫，俞 江.三氧化二砷对小鼠免疫功能的影响[J].中国地方病学杂志，1998，17(5)：281-283.
, http://www.100md.com
[4]夏雅娟，丁士辉.地方性砷中毒人群免疫毒性观察[J].内蒙古地方病防治研究，1995，20(4)：183-185.
[5]赵修竹.补体学[M].武汉：湖北科学技术出版社，1998.70-172.
[6]刘慧荣，邵 谭，梁 峰，等.人精浆的补体抑制活性与抗精子免疫不育的关系[J].中国计划生育学杂志，1998，6：414-416.
[7]O'Bryan MK,Baker HWG,Sanders JR,et al.Humen seminal clusterin (SP-40/40)[J].J Clin Inv,1990,85:1477-1486.
[8]程珠娟，郑振群.精浆中抗补体成分的近期研究[J].国外医学分子生物学分册，1994，16(6)：169-271.
[9]Vanderpuye OA,Labarrere CA and Mcintyce JA.The comoplement system in human reproduction[J].Am J Reprod Immunol,1992，27:144-155., 百拇医药
摘 要：目的 研究砷对睾丸补体抑制水平的影响及硒的拮抗效应，以探讨砷的生殖毒性的免疫机制。方法 补体溶血抑制实验，测定大鼠睾丸及血清补体抑制水平。结果 以4.6mg/kg体重三氧化二砷(As2O3)灌胃大鼠5周，大鼠睾丸及血清补体抑制率显著低于对照组(P<0.05)。染砷大鼠同时分别给予含硒100，200μg/kg体重的康强硒，睾丸及血清补体抑制率比染砷组显著升高(P<0.05)，与对照组差异不显著(P>0.05)。结论 砷可导致大鼠睾丸补体抑制水平下降，可能与砷引起的精子畸变、流产、不育有关，硒可有效拮抗砷的生殖毒性。
关键词:砷 硒 睾丸 补体抑制率
有报道[1]认为，人的不育症和畸胎与环境中的砷有关。动物实验也表明，砷及化合物(As3+和As5+)可引起小鼠精子数量减少、精子畸形和活动力减弱，严重者可引起流产、畸胎和死胎[2]。此外，砷还可引起机体免疫功能紊乱[3，4]，那么，砷的生殖毒性与免疫毒性之间，是否存在着某种联系呢？有研究表明[5]，血清及精浆中的补体抑制活性与生殖功能密切相关，在精子的发生、成熟、获能等生殖活动中起着举足轻重的作用。我们推测，砷的生殖毒性可能与补体抑制活性有一定关系，因此，本文测定了染砷大鼠血清及睾丸中的补体抑制水平及硒的影响，以探讨砷的生殖毒性的可能机理。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 三氧化二砷(As2O3)，分析纯，北京化工厂生产。康强硒，山西康强硒制药有限公司提供。
1.2 动物分组 实验动物选用雄性Wistar大鼠(由山西医科大学实验动物中心提供)32只，体重170±20g，随机分为(1)对照组(每100g体重1ml蒸馏水)；(2)染砷组(4.6mg/kg);(3)砷+康强硒①组(4.6mg/kg+100μg/kg硒)；(4)砷+康强硒②组(4.6mg/kg+200μg/kg硒)。每组8只，经口灌胃5周。
1.3 样品处理 大鼠断头处死后，迅速取出两侧睾丸,称重，加2倍体积生理盐水制成0.5mg/ml的匀浆，1 000r/min离心10min，取上清液，-30℃保存，使用时按1∶10稀释。
1.4 补体抑制活性的测定[6]
, 百拇医药
1.4.1 致敏绵羊红细胞(SRBC)悬液的制备：以无菌方法，取当日用量的SRBC，用巴比妥缓冲液(BBS，pH7.3～7.4)洗3次。取适量压积SRBC与BBS配制3% SRBC悬液，细胞浓度为6×108/ml。取等量单位溶血素，缓缓加入SRBC悬液中，混匀后置37℃水浴15min，使用时1∶2稀释。
1.4.2 补体：取5～10只豚鼠新鲜血清混合，4℃下操作，分装后保存于-30℃备用。每批使用前准确滴定补体效价及能引起75%致敏SRBC溶血(CH75)的补体滴度。
1.4.3 补体抑制活性的测定：以75%溶血(CH75)作为基础溶血率，在原有反应物中加入睾丸上清，应用Micro ELISA板作为标本载体进行操作，加样方法如表1。各反应物加完后充分混匀，37℃水浴60min 2000r/min,离心10min,取上清100μl于另一洁净的Micro ELISA板中，用光密度仪在410nm处测定每一孔的OD值，实验孔的OD值减去相应的空白对照及相应实验对照的OD值，即为实验孔的实际OD值。实验每次平行3孔，每份标本重复2次测定，结果取均值。
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表1 补体抑制微量溶血实验加样方法(μl)
反应物
实验孔
空白对照
实验对照
CH75
CH100
质控
睾丸上清(1∶10)
补体CH75*
补体CH100**
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致敏SRBC
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注：*CH75能引起反应体系中75%致敏SRBC溶血的补体浓度，**CH100能引起反应中100%致敏SRBC溶血的最小补体浓度
1.4.4 结果判断及计算：首先观察5个对照孔，计算原反应体系的实际溶血率及睾丸上清质控孔的补体抑制率。分别求出每一实验孔的补体抑制率，计算方法见公式(1)、(2)。
(1)
睾丸补体抑制能力的大小以原反应体系中的溶血率(PH75)在加入睾丸上清后引起的变化(降低)表示，溶血的程度以光密度仪测定其410nm波长OD值的大小表示。最后，以补体被抑制的百分率表示睾丸补体抑制活性的大小。
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(2)
*C=补体,HSP=睾丸上清。
1.5 资料处理及结果分析 本研究数据为百分数，经平方根反正旋变换后进行统计分析。多组数据间比较用方差分析；多组数据间两两比较用q检验。
2 结果
染砷组大鼠睾丸补体抑制率为38.92%±2.90%,显著低于对照组(P<0.05)；砷+硒①组、砷+硒②组睾丸补体抑制率均显著高于染砷组(P<0.05)，但仍低于对照组(P<0.05)。染砷大鼠血清补体抑制率为36.01±2.99%，显著低于对照组(P<0.05)，；砷+硒①组、砷+硒②组补体抑制率均显著高于染砷组(P<0.05)，与对照组无显著性差异(P>0.05)。见表2。
表2 染砷及砷硒联合染毒大鼠睾丸、血清中补体抑制率
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组别
补体抑制率%(x±s)
睾丸
血清
对照组
染砷组
砷+硒①组
砷+硒②组
50.85±6.67
38.92±2.90a
44.04±2.77a,b
41.76±3.61a,b
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61.30±2.89
36.01±2.99a
73.73±1.35b
57.93±2.07b
注：a与对照组比有显著性差异P<0.05,b与染砷组有显著性差异P<0.05
3 讨论
精子作为一种自身抗原，在许多情况下，均可导致抗精子抗体产生，这种自身抗体与精子抗原结合后，或通过抗体的Fc段结合细胞(巨噬细胞、白细胞、K细胞)，促进细胞吞噬；或启动补体的连锁反应，最终导致在精子细胞表面组装形成大分子的补体攻膜复合物(MAC)，进而造成精子细胞的溶解，从而破坏精子。但在正常精浆中往往具有广泛的免疫抑制作用，保护精子在一定范围内不被抗精子抗体(AsAb)所破坏，其中补体抑制作用则是重要的一种。在大鼠，SGP-2,SP40/40是精浆中重要的补体抑制因子，它们集中分布于睾丸Sertoli细胞和副睾晕(halo)细胞的胞浆，且转化为成熟精子的一部分，分布于精子的顶部、颈部和尾部。研究表明，精浆中的补体抑制因子(SP40/40等凝集素)浓度与精子的形成，精子的活力等密切相关，其浓度高时受孕率亦高。另外，SP40/40等凝集素的另一作用是对暴露于AsAb面前的生殖细胞进行保护，它可防止MAC在生殖细胞上组装，中断补体终末阶段的连锁反应，抑制补体细胞溶解作用对精子的损伤。另外，其他补体抑制因子如：DAF、MCP、CD59等也表达于生殖系统和精子，分别对补体反应的前端反应和终末阶段进行调节，对保护胎儿和精子免受补体侵袭方面有重要意义[5～7]。
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刘慧荣[6]曾对少精、弱精、畸形精子以及弱精症畸形精子症患者的精浆进行测定，发现其补体抑制活性明显低于正常人。我们的研究发现砷可造成大鼠血清及睾丸中的补体抑制活性明显降低，这样以来，在精子的发生、成熟等过程中，削弱了精子的自身保护作用。同时，因授精部位补体抑制活性的高低会影响授精的成功，所以，砷致血清及睾丸中补体抑制活性的降低可能与砷中毒引起的受孕率下降，精子数减弱，精子畸形率升高等有关。
还有学者发现[8，9]精浆与授精卵免疫耐受的形成有关，精浆中补体抑制因子可以为囊胚提供保护作用，使后者暴露于补体依赖性免疫损伤面前时，仍不受影响。睾丸是精液产生的主要器官之一，在砷的作用下，睾丸的补体抑制水平降低，可造成精浆中补体抑制水平的降低，从而使这种保护作用减弱，有可能与砷造成的流产有一定关系。
另外，刘慧荣研究中发现血清中的补体抑制活性与精浆呈高度正相关。本研究发现砷及砷硒联合作用对血清和睾丸补体抑制活性的影响趋势是一致的，表明砷对血清和睾丸补体抑制活性的影响机制是相同的，用血清中补体抑制水平可推测砷对睾丸或精浆的补体抑制水平。
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砷致睾丸和血清中补体抑制水平的降低原因可能是：(1)砷与-SH或-S-S有高度亲和性。SP40/40、MCP补体抑制因子均是靠二硫键维持其空间构型[5]，砷与之结合，可导致SP40/40空间结构的改变而失活。(2)砷可直接通过自由基引发的脂质过氧化反应破坏睾丸组织及DNA，使得睾丸细胞不能或减少补体抑制因子的表达。
用砷的拮抗剂硒制剂联合处理大鼠，发现可使染砷大鼠血清和睾丸补体抑制水平显著上升。硒可加速砷从机体中排泄；硒可以与砷竞争-SH和-S-S，从而恢复酶或因子的空间结构；而硒制剂有抗氧化作用，可减少脂质过氧化对细胞膜和DNA的损伤，提高细胞的修复能力。这一结果一方面证实了砷对补体抑制水平的影响及其功能的机制,另一方面也为硒及硒制剂预防和治疗砷中毒，提供依据。
基金来源：山西省卫生厅重点项目(No9602)
作者简介：郑金平，男，1968年生，讲师，医学硕士
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作者单位：郑金平(山西医科大学，卫生毒理教研组，山西，太原，030001)
祝寿芬(山西医科大学，卫生毒理教研组，山西，太原，030001)
刘慧荣(山西医科大学生，理教研组)
参考文献：
[1]张国禾.砷的胚胎毒性[J].国外医学卫生学分册，1984，11(4)：203.
[2]祝寿芬，仇玉兰，王仲霞.三氧化二砷对小鼠精子形态的影响[J].卫生毒理学杂志，1997，11(2)：122-123.
[3]刘 佳，吴克枫，俞 江.三氧化二砷对小鼠免疫功能的影响[J].中国地方病学杂志，1998，17(5)：281-283.
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[4]夏雅娟，丁士辉.地方性砷中毒人群免疫毒性观察[J].内蒙古地方病防治研究，1995，20(4)：183-185.
[5]赵修竹.补体学[M].武汉：湖北科学技术出版社，1998.70-172.
[6]刘慧荣，邵 谭，梁 峰，等.人精浆的补体抑制活性与抗精子免疫不育的关系[J].中国计划生育学杂志，1998，6：414-416.
[7]O'Bryan MK,Baker HWG,Sanders JR,et al.Humen seminal clusterin (SP-40/40)[J].J Clin Inv,1990,85:1477-1486.
[8]程珠娟，郑振群.精浆中抗补体成分的近期研究[J].国外医学分子生物学分册，1994，16(6)：169-271.
[9]Vanderpuye OA,Labarrere CA and Mcintyce JA.The comoplement system in human reproduction[J].Am J Reprod Immunol,1992，27:144-155., 百拇医药