观察骨骼肌小动脉的三种形态学实验方法的比较
补永安 张远强
摘 要 目的： 寻找观察骨骼肌小动脉形态的有效方法. 方法： 采用墨汁灌注、石蜡切片HE染色及血管铸型结合扫描电镜三种手段观察了大鼠比目鱼肌小动脉，并对它们的效果及优缺点进行了比较. 结果： 墨汁灌注法能清楚地显示整块比目鱼肌内的小动脉网；石蜡切片HE染色法能清楚地观察到血管壁断面的结构及其周围结缔组织的变化；血管铸型结合扫描电镜可观察到骨骼肌内小动脉网的立体构建. 结论： 上述三种方法在显示骨骼肌小动脉方面各有优缺点，应用时可根据不同的研究目的选择不同的方法.
关键词:肌，骨骼 小动脉 形态学
0 引言
骨骼肌小动脉的变化在机体多种生理及病理机制中都有着重要意义. 例如，肌肉锻炼即伴随有肌肉小动脉的生长[1]；局部血液动力学的变化常刺激该处肌肉小动脉发生重塑性变化[1]；而骨骼肌小动脉是形成外周阻力的重要组成部分，参与高血压病的形成机制[2]. 可见，寻找有效观察骨骼肌小动脉(包括小动脉壁的结构，甚至小动脉网的整体形态)的方法就显得十分必要. 但骨骼肌内小动脉较为稀少，而且各种观察方法又有其特定的放大倍数范围，因此，采用单一方法观察骨骼肌小动脉往往很难说明问题. 我们采用了本室改良的墨汁灌注法、石蜡切片HE染色及血管铸型观察比目鱼肌小动脉，并对它们的观察效果及优缺点进行了比较.
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1 材料和方法
1.1 动物 成年雄性SD大鼠(体质量250 g～300 g) 9只， 随机分为3组(每组n=3)，分别用于石蜡切片HE染色、血管铸型及墨汁灌注法的观察. 动物饲养与实验均遵照我校实验动物饲养与使用规定进行.
1.2 墨汁灌注法 戊巴比妥钠(45 mg/kg, ip)将动物麻醉，右侧髂外动脉插管. 在3.4 kPa下用Krebs平衡液(含硝普钠10 g/L, 37℃)以每100 g 体质量1 mL/min的流量灌流15 min. 随后用明胶墨汁(配法：明胶, Fluka公司产品, 15 g加热溶于100 mL蒸馏水，加中华墨汁20 mL搅拌均匀)灌流5 min，至本侧下肢充分变黑后，结扎股静脉. 切开皮肤，暴露下肢肌肉组织，原位固定于40 g/L多聚甲醛48 h. 仔细分离，并取下该侧比目鱼肌，酒精脱水, 二甲苯及香柏油透明. 将肌肉标本夹在两张载玻片之间，适度加压，镜下观察.
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1.3 苏木精-伊红(HE)染色 戊巴比妥钠(45 mg/kg, ip)将动物麻醉，右侧髂外动脉插管. 在3.4 kPa下用Krebs平衡液(含硝普钠10 mg/L, 37℃)以每100 g体质量1 mL/min的流量灌流15 min. 而后在相同压力下以40 g/L多聚甲醛250 mL灌注固定. 轻柔剪取右侧比目鱼肌. 常规酒精脱水：肌肉标本先依次置于700 mL/L, 800 mL/L及900 mL/L酒精12 h，而后再依次置于950 mL/L及无水乙醇各2 h. 以香柏油透明4 h, 二甲苯洗15 min. 温箱浸蜡2 h后包埋. 作10 μm厚的各向同性切片，隔10张切片取1张, 每块肌肉所选的切片数不少于6张. 常规HE染色： 二甲苯Ⅰ, Ⅱ各10 min，依次进入无水乙醇、950 mL/L, 900 mL/L, 800 mL/L及700 mL/L的酒精各5 min，蒸馏水洗；入苏木精染液10 min，盐酸酒精分色4 s，自来水洗10 min；依次入700 mL/L, 800 mL/L及900 mL/L酒精各5 min，入伊红染液染色10 min；入950 mL/L及无水乙醇Ⅰ, Ⅱ各5 min, 以二甲苯透明，中性树脂封片.
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1.4 小动脉血管铸型的扫描电镜观察[3]
1.4.1 预聚合体的配制 ①甲基丙烯酸甲脂单体在存放过程中加入适量阻聚剂对苯二酚，预聚合前用50 g/L氢氧化钠溶液洗涤甲基丙烯酸甲脂单体, 再用蒸馏水洗至中性, 并以无水氯化钙去水. ②预聚合：使甲基丙烯酸甲脂(单体)与丙烯酸甲脂(增韧剂)按9∶1的比例混合, 加入预聚合体总量6%的过氧化苯甲酰(引发剂), 混匀后于80℃恒温箱水浴中持续加热, 待溶液粘度与300 mL/L～500 mL/L甘油盐水相当时, 迅速取出, 流水冷却, 置冰箱待用.
1.4.2 标本制作 动物用戊巴比妥钠(45 mg/kg, ip)麻醉后, 右侧髂总动脉插管. 以37℃生理盐水(含10 g/L肝素)灌流, 至静脉流出液清澈，再以40 g/L多聚甲醛灌流固定, 甲基丙烯酸甲脂单体灌注(防止预聚体接触水后表面硬化, 阻塞血管). 预聚合体中加入15 mL/L～20 mL/L的N-N二甲基苯胺(加速剂), 迅速搅拌, 在手推最大压力(26.8 kPa)下匀速灌流，待静脉端流出液开始变硬时, 停止灌流. 整个过程须使灌注后肢始终处于伸展位. 将动物尸体置于50℃水浴中24 h, 离断右侧后肢，放入6 mol/L氢氧化钠液中腐蚀7 d～1 0 d, 每天换液, 清水缓缓洗去腐蚀组织.
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1.4.3 扫描电镜观察 在相当于比目鱼肌部剪取铸型物，并在解剖显微镜下清除其残余腐败物, 蒸馏水缓洗数次. 真空泵干燥, 用导电胶粘于标本托上喷金镀膜, 扫描电镜(Hitachi S-520)下观察照相.
2 结果
在墨汁灌注比目鱼肌标本可观察到，肌肉内的数支营养小动脉先分支为若干弓状小动脉并相互联结构成弓状小动脉网络. 从每支弓状小动脉又按一定间隔发出横行小动脉分支. 众多的横行小动脉又以非对称分枝方式，形成中间无吻合连接的横行小动脉树状结构. 其末端即直接延续为与骨骼肌纤维取平行走向的毛细血管. Fig 1为墨汁灌注比目鱼肌小动脉网照片.
图1 墨汁灌注比目鱼肌小动脉网
, 百拇医药
Fig 1 Microphotograph of the arteriole network with the soleus muscle by using of carbon injection LM ×200
采用石蜡切片HE染色观察比目鱼肌可清楚地观察到位于肌纤维之间结缔组织中小动脉的一些纵、横断面. 10×物镜下，单位视野可见小动脉断面1个～3个. 血管管径多在30 μm以下. Fig 2为比目鱼肌石蜡切片HE染色照片.
图2 比目鱼肌石蜡切片HE染色
Fig 2 Microphotograph of paraffin section of soleus muscle by using of He staining LM ×200
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Fig 3为比目鱼肌小动脉血管铸型扫描电镜照片. 扫描电镜下，可见有许多呈平行走向、直径较小且相对均一的毛细血管. 还可见这些管道的分支及其相互吻合连接. 偶尔也可见这些管道极度弯曲呈波浪状，这可能是由于局部肌肉处于强烈收缩状态有关. 在互相平行的毛细血管间可见有走向各异、粗细不等的小动、静脉相伴行. 小静脉外形不甚规则，且管径较大；在小动脉铸形表面常可见有卵圆形或梭形的血管内皮细胞核的压痕，而小静脉内皮细胞核的压痕则为圆形.
图3 比目鱼肌小动脉血管铸型扫描电镜
Fig 3 Microphotograph of casts of arterioles within the soleus muscle viewed with a scanning electron microscope SEM ×150
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3 讨论
我们采用墨汁灌注法、石蜡切片HE染色及血管铸型结合扫描电镜观察比目鱼肌小动脉，得到了三种截然不同的观察效果. 对它们的优缺点以下作一分析：
采用墨汁灌注法能较清楚完整地观察到整块比目鱼肌内的小动脉网，且方法也较简便. 在标本制备过程我们还注意到以下问题：
其一是，用化学固定剂处理组织标本，如何防止细胞和血管组织发生变形的问题. 化学固定剂可将粘弹性的物质转化为弹性凝胶. 一方面组织的变形可能是固定剂，如锇酸或戊二醛渗透压作用的结果. 另一方面，组织中的弹性蛋白等成分不能完全被固定，在相当长一段时间内可持续引起组织变形. 但此问题在骨骼肌标本并不严重，可能与被固定肌纤维的强有力机械支撑作用有关[4].
其二是应使被固定血管处于扩张状态才能测得可靠管径数据. 在固定时使用血管扩张剂，并于13.4 kPa压力下灌流，可使被固定小动脉处于扩张状态，且沿走行方向管径均匀一致，无管径逐渐变细的现象；仅在分支处管径才有变化[2].
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Engelson等[5]曾提出定量描述肌肉内小动脉网络的几何参数与拓扑参数，对比较不同条件下的网络变化有一定意义. 在本工作，由于比目鱼肌为一较厚的肌肉，直接应用上述定量分析方法尚有一定困难，但仍可对不同级小动脉内径进行测量.
石蜡切片HE染色观察肌肉小动脉的优点在于能较清楚地观察到血管壁断面的结构及周围结缔组织的改变；若采用体视学方法还可测量肌肉小动脉的长度密度及总长度. 而存在的问题在于所能观察到的小动脉数量较少；尽管在取材过程中采用了充分扩血管的方法，但石蜡切片的制备过程仍可引起小动脉管壁的收缩，因此测量小动脉内径所得数值往往偏小. 此外，标本制备方法虽成熟，但仍较为烦琐.
采用血管铸型结合扫描电镜可观察到骨骼肌内小动脉网的立体构建，且形态美观生动. 但由于扫描电镜的放大倍数较大，小动脉网仅能得到部分观察. 发展计算机辅助定量方法[6]，可以测量小动脉的内径及长度，但由于灌注铸型物时采用的压力高、使肌内小动脉过度扩张，所得数据将偏大. 标本制备过程烦琐且周期较长.
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可见，以上提到的三种方法在观察骨骼肌小动脉时有着各自的优缺点. 根据不同的研究需要，这三种方法可单独或结合使用.
作者简介：补永安，男，1957-11-29生，四川省遂宁市人，汉族. 1980年第四军医大学本科毕业，实验师. 发表论文6篇. 电话:(029)3374511
作者单位：第四军医大学基础部组织学与胚胎学教研室，陕西 西安 710033
参考文献
1 Hudlicka O, Brown M, Egginton S. Angiogenesis in skeletal and cardiac muscle. Physiol Rev, 1992;72(2):369-417
2 Engelson ET, Schmid-Schonbein GW, Zweifach BW. The microvasculature in skeletal muscle.II.Arteriolar network anatomy in normotensive and spontaneously hypertensive rats. Microvascular Res,1986;31:356-374
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3 张朝佑. 器官内微血管铸型扫描电镜图谱. 北京：科学出版社，1988；14-16
4 Sobin SS, Tremer HM. The effect of incomplete fixation of elastin on the appearance of pulmonary alveoli. J Biomech Eng, 1981;104:68-71
5 Engelson ET, Skalak TC, Schmic-Schonbein GW. The microvasculature in skeletal muscle. I arteriolar network in rat spinotrapezius muscle. Microvascular Res,1985;30:29-44
6 Potter RF, Groom AC. Capillary diameter and geometry in cardiac and skeletal muscle studied by means of corrosion casts. Microvascular Res,1983;25:68-84, 百拇医药
摘 要 目的： 寻找观察骨骼肌小动脉形态的有效方法. 方法： 采用墨汁灌注、石蜡切片HE染色及血管铸型结合扫描电镜三种手段观察了大鼠比目鱼肌小动脉，并对它们的效果及优缺点进行了比较. 结果： 墨汁灌注法能清楚地显示整块比目鱼肌内的小动脉网；石蜡切片HE染色法能清楚地观察到血管壁断面的结构及其周围结缔组织的变化；血管铸型结合扫描电镜可观察到骨骼肌内小动脉网的立体构建. 结论： 上述三种方法在显示骨骼肌小动脉方面各有优缺点，应用时可根据不同的研究目的选择不同的方法.
关键词:肌，骨骼 小动脉 形态学
0 引言
骨骼肌小动脉的变化在机体多种生理及病理机制中都有着重要意义. 例如，肌肉锻炼即伴随有肌肉小动脉的生长[1]；局部血液动力学的变化常刺激该处肌肉小动脉发生重塑性变化[1]；而骨骼肌小动脉是形成外周阻力的重要组成部分，参与高血压病的形成机制[2]. 可见，寻找有效观察骨骼肌小动脉(包括小动脉壁的结构，甚至小动脉网的整体形态)的方法就显得十分必要. 但骨骼肌内小动脉较为稀少，而且各种观察方法又有其特定的放大倍数范围，因此，采用单一方法观察骨骼肌小动脉往往很难说明问题. 我们采用了本室改良的墨汁灌注法、石蜡切片HE染色及血管铸型观察比目鱼肌小动脉，并对它们的观察效果及优缺点进行了比较.
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1 材料和方法
1.1 动物 成年雄性SD大鼠(体质量250 g～300 g) 9只， 随机分为3组(每组n=3)，分别用于石蜡切片HE染色、血管铸型及墨汁灌注法的观察. 动物饲养与实验均遵照我校实验动物饲养与使用规定进行.
1.2 墨汁灌注法 戊巴比妥钠(45 mg/kg, ip)将动物麻醉，右侧髂外动脉插管. 在3.4 kPa下用Krebs平衡液(含硝普钠10 g/L, 37℃)以每100 g 体质量1 mL/min的流量灌流15 min. 随后用明胶墨汁(配法：明胶, Fluka公司产品, 15 g加热溶于100 mL蒸馏水，加中华墨汁20 mL搅拌均匀)灌流5 min，至本侧下肢充分变黑后，结扎股静脉. 切开皮肤，暴露下肢肌肉组织，原位固定于40 g/L多聚甲醛48 h. 仔细分离，并取下该侧比目鱼肌，酒精脱水, 二甲苯及香柏油透明. 将肌肉标本夹在两张载玻片之间，适度加压，镜下观察.
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1.3 苏木精-伊红(HE)染色 戊巴比妥钠(45 mg/kg, ip)将动物麻醉，右侧髂外动脉插管. 在3.4 kPa下用Krebs平衡液(含硝普钠10 mg/L, 37℃)以每100 g体质量1 mL/min的流量灌流15 min. 而后在相同压力下以40 g/L多聚甲醛250 mL灌注固定. 轻柔剪取右侧比目鱼肌. 常规酒精脱水：肌肉标本先依次置于700 mL/L, 800 mL/L及900 mL/L酒精12 h，而后再依次置于950 mL/L及无水乙醇各2 h. 以香柏油透明4 h, 二甲苯洗15 min. 温箱浸蜡2 h后包埋. 作10 μm厚的各向同性切片，隔10张切片取1张, 每块肌肉所选的切片数不少于6张. 常规HE染色： 二甲苯Ⅰ, Ⅱ各10 min，依次进入无水乙醇、950 mL/L, 900 mL/L, 800 mL/L及700 mL/L的酒精各5 min，蒸馏水洗；入苏木精染液10 min，盐酸酒精分色4 s，自来水洗10 min；依次入700 mL/L, 800 mL/L及900 mL/L酒精各5 min，入伊红染液染色10 min；入950 mL/L及无水乙醇Ⅰ, Ⅱ各5 min, 以二甲苯透明，中性树脂封片.
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1.4 小动脉血管铸型的扫描电镜观察[3]
1.4.1 预聚合体的配制 ①甲基丙烯酸甲脂单体在存放过程中加入适量阻聚剂对苯二酚，预聚合前用50 g/L氢氧化钠溶液洗涤甲基丙烯酸甲脂单体, 再用蒸馏水洗至中性, 并以无水氯化钙去水. ②预聚合：使甲基丙烯酸甲脂(单体)与丙烯酸甲脂(增韧剂)按9∶1的比例混合, 加入预聚合体总量6%的过氧化苯甲酰(引发剂), 混匀后于80℃恒温箱水浴中持续加热, 待溶液粘度与300 mL/L～500 mL/L甘油盐水相当时, 迅速取出, 流水冷却, 置冰箱待用.
1.4.2 标本制作 动物用戊巴比妥钠(45 mg/kg, ip)麻醉后, 右侧髂总动脉插管. 以37℃生理盐水(含10 g/L肝素)灌流, 至静脉流出液清澈，再以40 g/L多聚甲醛灌流固定, 甲基丙烯酸甲脂单体灌注(防止预聚体接触水后表面硬化, 阻塞血管). 预聚合体中加入15 mL/L～20 mL/L的N-N二甲基苯胺(加速剂), 迅速搅拌, 在手推最大压力(26.8 kPa)下匀速灌流，待静脉端流出液开始变硬时, 停止灌流. 整个过程须使灌注后肢始终处于伸展位. 将动物尸体置于50℃水浴中24 h, 离断右侧后肢，放入6 mol/L氢氧化钠液中腐蚀7 d～1 0 d, 每天换液, 清水缓缓洗去腐蚀组织.
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1.4.3 扫描电镜观察 在相当于比目鱼肌部剪取铸型物，并在解剖显微镜下清除其残余腐败物, 蒸馏水缓洗数次. 真空泵干燥, 用导电胶粘于标本托上喷金镀膜, 扫描电镜(Hitachi S-520)下观察照相.
2 结果
在墨汁灌注比目鱼肌标本可观察到，肌肉内的数支营养小动脉先分支为若干弓状小动脉并相互联结构成弓状小动脉网络. 从每支弓状小动脉又按一定间隔发出横行小动脉分支. 众多的横行小动脉又以非对称分枝方式，形成中间无吻合连接的横行小动脉树状结构. 其末端即直接延续为与骨骼肌纤维取平行走向的毛细血管. Fig 1为墨汁灌注比目鱼肌小动脉网照片.
图1 墨汁灌注比目鱼肌小动脉网
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Fig 1 Microphotograph of the arteriole network with the soleus muscle by using of carbon injection LM ×200
采用石蜡切片HE染色观察比目鱼肌可清楚地观察到位于肌纤维之间结缔组织中小动脉的一些纵、横断面. 10×物镜下，单位视野可见小动脉断面1个～3个. 血管管径多在30 μm以下. Fig 2为比目鱼肌石蜡切片HE染色照片.
图2 比目鱼肌石蜡切片HE染色
Fig 2 Microphotograph of paraffin section of soleus muscle by using of He staining LM ×200
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Fig 3为比目鱼肌小动脉血管铸型扫描电镜照片. 扫描电镜下，可见有许多呈平行走向、直径较小且相对均一的毛细血管. 还可见这些管道的分支及其相互吻合连接. 偶尔也可见这些管道极度弯曲呈波浪状，这可能是由于局部肌肉处于强烈收缩状态有关. 在互相平行的毛细血管间可见有走向各异、粗细不等的小动、静脉相伴行. 小静脉外形不甚规则，且管径较大；在小动脉铸形表面常可见有卵圆形或梭形的血管内皮细胞核的压痕，而小静脉内皮细胞核的压痕则为圆形.
图3 比目鱼肌小动脉血管铸型扫描电镜
Fig 3 Microphotograph of casts of arterioles within the soleus muscle viewed with a scanning electron microscope SEM ×150
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3 讨论
我们采用墨汁灌注法、石蜡切片HE染色及血管铸型结合扫描电镜观察比目鱼肌小动脉，得到了三种截然不同的观察效果. 对它们的优缺点以下作一分析：
采用墨汁灌注法能较清楚完整地观察到整块比目鱼肌内的小动脉网，且方法也较简便. 在标本制备过程我们还注意到以下问题：
其一是，用化学固定剂处理组织标本，如何防止细胞和血管组织发生变形的问题. 化学固定剂可将粘弹性的物质转化为弹性凝胶. 一方面组织的变形可能是固定剂，如锇酸或戊二醛渗透压作用的结果. 另一方面，组织中的弹性蛋白等成分不能完全被固定，在相当长一段时间内可持续引起组织变形. 但此问题在骨骼肌标本并不严重，可能与被固定肌纤维的强有力机械支撑作用有关[4].
其二是应使被固定血管处于扩张状态才能测得可靠管径数据. 在固定时使用血管扩张剂，并于13.4 kPa压力下灌流，可使被固定小动脉处于扩张状态，且沿走行方向管径均匀一致，无管径逐渐变细的现象；仅在分支处管径才有变化[2].
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Engelson等[5]曾提出定量描述肌肉内小动脉网络的几何参数与拓扑参数，对比较不同条件下的网络变化有一定意义. 在本工作，由于比目鱼肌为一较厚的肌肉，直接应用上述定量分析方法尚有一定困难，但仍可对不同级小动脉内径进行测量.
石蜡切片HE染色观察肌肉小动脉的优点在于能较清楚地观察到血管壁断面的结构及周围结缔组织的改变；若采用体视学方法还可测量肌肉小动脉的长度密度及总长度. 而存在的问题在于所能观察到的小动脉数量较少；尽管在取材过程中采用了充分扩血管的方法，但石蜡切片的制备过程仍可引起小动脉管壁的收缩，因此测量小动脉内径所得数值往往偏小. 此外，标本制备方法虽成熟，但仍较为烦琐.
采用血管铸型结合扫描电镜可观察到骨骼肌内小动脉网的立体构建，且形态美观生动. 但由于扫描电镜的放大倍数较大，小动脉网仅能得到部分观察. 发展计算机辅助定量方法[6]，可以测量小动脉的内径及长度，但由于灌注铸型物时采用的压力高、使肌内小动脉过度扩张，所得数据将偏大. 标本制备过程烦琐且周期较长.
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可见，以上提到的三种方法在观察骨骼肌小动脉时有着各自的优缺点. 根据不同的研究需要，这三种方法可单独或结合使用.
作者简介：补永安，男，1957-11-29生，四川省遂宁市人，汉族. 1980年第四军医大学本科毕业，实验师. 发表论文6篇. 电话:(029)3374511
作者单位：第四军医大学基础部组织学与胚胎学教研室，陕西 西安 710033
参考文献
1 Hudlicka O, Brown M, Egginton S. Angiogenesis in skeletal and cardiac muscle. Physiol Rev, 1992;72(2):369-417
2 Engelson ET, Schmid-Schonbein GW, Zweifach BW. The microvasculature in skeletal muscle.II.Arteriolar network anatomy in normotensive and spontaneously hypertensive rats. Microvascular Res,1986;31:356-374
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3 张朝佑. 器官内微血管铸型扫描电镜图谱. 北京：科学出版社，1988；14-16
4 Sobin SS, Tremer HM. The effect of incomplete fixation of elastin on the appearance of pulmonary alveoli. J Biomech Eng, 1981;104:68-71
5 Engelson ET, Skalak TC, Schmic-Schonbein GW. The microvasculature in skeletal muscle. I arteriolar network in rat spinotrapezius muscle. Microvascular Res,1985;30:29-44
6 Potter RF, Groom AC. Capillary diameter and geometry in cardiac and skeletal muscle studied by means of corrosion casts. Microvascular Res,1983;25:68-84, 百拇医药