一种与不育有关的人精子蛋白质的组织特异性及表达
张梅林 周雪峰 曹登峰 缪时英 吴燕婉 邢志军 宗书东 王琳芳
摘 要 目的 通过对已被GenBank接受、编码与不育有关的人精子蛋白质的cDNA片段(BSD-2.4)的组织特异性及表达阶段的研究，进一步了解其特性。方法 采用Dot blot、Northern blot和组织原位杂交技术。结果 该cDNA只在人和大鼠睾丸组织中表达；在人睾丸曲细精管的精原细胞、精母细胞和精子细胞中均有转录。结论 BSD-2.4 cDNA编码蛋白具有睾丸组织特异性，并在精子发生的各个阶段均有不同程度的表达。
关键词：人精子蛋白质 组织特异性 组织原位杂交
本研究组曾用一份含有抗精子抗体并能引起人精子头对头凝集的不育患者血清为探针，从人睾丸λgt-11表达文库中通过表位筛选，获得一个cDNA片段。核苷酸序列测定显示，其由2427个核苷酸组成，命名为BSD-2.4 cDNA，已被GenBank和GDB(Human Genome Database)资料库收集接受。经计算机网络查询，未见该cDNA与现有基因库中的cDNA有同源性[1]。为深入研究该基因的功能，本实验采用Dot杂交和Northern杂交方法观察其组织特异性，并应用组织原位杂交技术了解该基因在睾丸组织中的表达阶段。
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1 材料和方法
材料 JM109，pGEM3Z为本实验室提供。人睾丸组织取自北京协和医院泌尿科。斑点杂交装置购自美国Bio-Rad公司。含16种组织mRNA的尼龙膜购自Clontech公司。α-32p-dATP购自Dupond。
Dig-RNA标记和测定试剂盒、DNA随机引物标记盒均购自德国Boehringer-Mannheim公司，快速分离柱(Sephedex G-50)购自瑞典Pharmacia公司，硝酸纤维素膜购自Schleicher & Schuell公司。HindⅢ、NdeⅠ、EcoRⅠ等限制性内切酶，连接酶购自德国Boehringer-Mannheim公司或协和友谊开发公司。
方法 总RNA的提取：将健康大鼠的脑、心、肝、肾、肺、睾丸组织新鲜取出，迅速浸入变性液中匀浆。参照Chomczynski[2]方法，提取总RNA。
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标记探针：以100 μg BSD-2.4cDNA片段为模板，按随机引物标记法，参入dCTP、dTTP、dGTP和α-32p-dATP标记。标记后，用快速分离柱(Sephadex G-50)分离标记混合物，得到标记好的探针、杂交[3]，杂交后与X光片放射自显影。
斑点杂交：用Bio-Rad公司斑点杂交装置将提纯的大鼠脑、心、肝、肾、肺、睾丸6种组织及对照分别以0.8、0.4、0.2和0.1 μg的量，变性后点在硝酸纤维素膜上。与α-32p-dATP标记的BSD-2.4cDNA探针杂交，杂交后与X光片放射自显影。
Northern杂交：将人16种正常组织的mRNA电泳后，分别转到两张尼龙膜上，每种组织的样品量为2.0 μg。
探针为α-32p-dATP标记的BSD-2.4 cDNA。按105 cpm/ml杂交液的量加入探针。
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人睾丸组织冰冻切片的制备：新鲜的人睾丸组织，离体后立即放入液氮中保存。取一适当小块制备冰冻切片。
mRNA和cRNA探针的制备：将BSD-2.4 cDNA中的一段编码蛋白区的0.7 kb的片段，以EcoRⅠ酶切出重组入pGEM-3Z质粒中，经筛选、鉴定方向后，分别用HindⅢ和NdeⅠ酶切，使载体线性化。以线性化的重组质粒为模板，在ATP、CTP、GTP、Dig-UTP的参与下，分别加入SP6和T7RNA合成酶体外转录合成mRNA和cRNA探针。探针合成后，加入DNase(RNase free)消化转录模板，乙醇沉淀后，离心，溶解，电泳鉴定，在260 nm波长处测吸光度(A值)，计算探针含量。
组织切片原位杂交：参照文献[4]方法，按200～400 ng/组织片的量加入Dig-UTP标记的探针。
2 结果和讨论
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斑点杂交 以BSD-2.4 cDNA为探针，与对照tRNA的杂交信号呈阴性；与大鼠脑、心、肝、肾、肺、睾丸组织RNA杂交，仅在睾丸组织中显示较强的杂交信号，并随着RNA浓度的降低，杂交信号依次减弱(图1)。
图1 BSD-2.4 cDNA与大鼠组织mRNA斑点杂交结果
Fig 1 Dot blot of mRNA of 7 different rat tissues with BSD-2.4 cDNA
1.brain; 2.heart; 3.liver; 4.kidney; 5.lung; 6.testis; 7.tRNA
Northern杂交 以β-actin作为对mRNA量的评估和杂交方法的对照，β-actin在心脏、骨骼肌、前列腺和结肠中有1.8和2.0 kb两种形式，其他组织只有一种2.0 kb形式(图2a)。以BSD-2.4 cDNA为探针，与人心脏、脑、胎盘、肺脏、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、以及脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、外周血白细胞共16种组织的杂交结果显示，只在睾丸组织中有一清晰的强杂交带，位置在3.8～4.0 kb之间，其余均为阴性(图2b)。Northern结果和斑点杂交结果一致证明，BSD-2.4 cDNA具有很强的组织特异性，而且不同种属间(人和大鼠)有着相同的组织特异性。这为用动物作对象进行功能研究提供了条件和依据。该基因仅在睾丸组织中表达，在其他组织中不表达的结果表明此基因编码的蛋白质仅出现在睾丸组织中，提示其编码蛋白质与睾丸的生殖功能可能有密切关系。
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图2 BSD-2.4 cDNA与人组织mRNA Northern blot杂交结果
Fig 2 Northern blot of mRNA from 16 human tissues (two membranes) with BSD-2.4 cDNA probe
Membrane I：1.heart; 2.brain; 3.placenta; 4.lung; 5.liver; 6.skeletal; 7.kidney; 8.pancreas
Membrane Ⅱ：1.spleen; 2.thymus; 3.prostata; 4.testis; 5.ovary; 6.small intestine; 7.colon; 8.peripheral blood leukocyte
a：control，β-actin probe; b：BSD-2.4 cDNA probe
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Mobilizes for 1.35，2.4，4.4，7.5，9.5 kb RNA size marker bands are indicated
组织原位杂交 对照组，即未加探针组，用苏木素染色(图3a)。实验对照组以Sense RNA(mRNA)作为探针，杂交结果为阴性。为便于细胞定位，组织切片用苏木素复染，可见到
着色的细胞核(图3b)。实验组以anti-sense RNA(cRNA)作为探针，结果睾丸曲细精管截面上有阳性的杂交信号(图3c)。这些信号主要分布在生精过程中的各级生精细胞中，并随着生精细胞的发育顺序，杂交信号强度呈减弱趋势。表明BSD-2.4 cDNA的转录表达发生于精子成熟的整个时期，其编码蛋白可能与精子细胞的分化有关。
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图3 BSD-2.4与人睾丸组织原位杂交结果
Fig 3 In situ hybridization of human testis sections with BSD-2.4 antisense RNA probe
a.no probe ×60; b.sense RNA ×378; c.anti-sense RNA ×252
到目前为止，对精子膜蛋白质深入研究的报道仍然较少。此基因被较早分离出，在现有的基因库中无同源性，因此引起了同行的注意[5，6]。本文工作证明BSD-2.4具有强组织特异性，其是否有希望成为寻找免疫避孕疫苗的候选蛋白质抗原，还有待于今后进一步深入研究。
△国家自然科学基金(39670762),卫生部科学研究基金(96-1-007)及863高技术基金(863-102-07-05-01)资助
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张梅林为通讯作者
作者单位：张梅林 周雪峰 曹登峰 缪时英 邢志军 王琳芳 (国家计划生育委员会科学技术研究所,北京,100081)
吴燕婉 宗书东 (中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
参考文献
1 Zhang ML，WANG LF，Miao SY，et al.Isolation and sequencing of the cDNA encoding the 75-kD human sperm protein related to infertility.Chin Med J，1992，105(12):998～1003
2 Chomczynski P.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem，1987，162(1)：156～157
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3 王琳芳，潘华珍.分子生物学基本技术.北京：北京生理科学会.1991.48～62
4 吴燕婉，宗书东，于同德，等.编码人精子膜蛋白YWK-Ⅱ基因在人睾丸组织表达的研究.中国科学(C辑)，1997，27(6)：555～561
5 Benoff S.The Role of cholesterol during capacitation of human spermatozoa.Hum Repro，1993，8(12)：2001～2006
6 Benoff S，Rushbrook JI，Hurlet IR，et al.Co-expression of mannose-ligand and non-nuclear progesterone receptors on motile human sperm identifies an acrosome-reaction inducible subpopulation.Am J Reprod Immunol，1995，34(2):100～115, http://www.100md.com
摘 要 目的 通过对已被GenBank接受、编码与不育有关的人精子蛋白质的cDNA片段(BSD-2.4)的组织特异性及表达阶段的研究，进一步了解其特性。方法 采用Dot blot、Northern blot和组织原位杂交技术。结果 该cDNA只在人和大鼠睾丸组织中表达；在人睾丸曲细精管的精原细胞、精母细胞和精子细胞中均有转录。结论 BSD-2.4 cDNA编码蛋白具有睾丸组织特异性，并在精子发生的各个阶段均有不同程度的表达。
关键词：人精子蛋白质 组织特异性 组织原位杂交
本研究组曾用一份含有抗精子抗体并能引起人精子头对头凝集的不育患者血清为探针，从人睾丸λgt-11表达文库中通过表位筛选，获得一个cDNA片段。核苷酸序列测定显示，其由2427个核苷酸组成，命名为BSD-2.4 cDNA，已被GenBank和GDB(Human Genome Database)资料库收集接受。经计算机网络查询，未见该cDNA与现有基因库中的cDNA有同源性[1]。为深入研究该基因的功能，本实验采用Dot杂交和Northern杂交方法观察其组织特异性，并应用组织原位杂交技术了解该基因在睾丸组织中的表达阶段。
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1 材料和方法
材料 JM109，pGEM3Z为本实验室提供。人睾丸组织取自北京协和医院泌尿科。斑点杂交装置购自美国Bio-Rad公司。含16种组织mRNA的尼龙膜购自Clontech公司。α-32p-dATP购自Dupond。
Dig-RNA标记和测定试剂盒、DNA随机引物标记盒均购自德国Boehringer-Mannheim公司，快速分离柱(Sephedex G-50)购自瑞典Pharmacia公司，硝酸纤维素膜购自Schleicher & Schuell公司。HindⅢ、NdeⅠ、EcoRⅠ等限制性内切酶，连接酶购自德国Boehringer-Mannheim公司或协和友谊开发公司。
方法 总RNA的提取：将健康大鼠的脑、心、肝、肾、肺、睾丸组织新鲜取出，迅速浸入变性液中匀浆。参照Chomczynski[2]方法，提取总RNA。
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标记探针：以100 μg BSD-2.4cDNA片段为模板，按随机引物标记法，参入dCTP、dTTP、dGTP和α-32p-dATP标记。标记后，用快速分离柱(Sephadex G-50)分离标记混合物，得到标记好的探针、杂交[3]，杂交后与X光片放射自显影。
斑点杂交：用Bio-Rad公司斑点杂交装置将提纯的大鼠脑、心、肝、肾、肺、睾丸6种组织及对照分别以0.8、0.4、0.2和0.1 μg的量，变性后点在硝酸纤维素膜上。与α-32p-dATP标记的BSD-2.4cDNA探针杂交，杂交后与X光片放射自显影。
Northern杂交：将人16种正常组织的mRNA电泳后，分别转到两张尼龙膜上，每种组织的样品量为2.0 μg。
探针为α-32p-dATP标记的BSD-2.4 cDNA。按105 cpm/ml杂交液的量加入探针。
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人睾丸组织冰冻切片的制备：新鲜的人睾丸组织，离体后立即放入液氮中保存。取一适当小块制备冰冻切片。
mRNA和cRNA探针的制备：将BSD-2.4 cDNA中的一段编码蛋白区的0.7 kb的片段，以EcoRⅠ酶切出重组入pGEM-3Z质粒中，经筛选、鉴定方向后，分别用HindⅢ和NdeⅠ酶切，使载体线性化。以线性化的重组质粒为模板，在ATP、CTP、GTP、Dig-UTP的参与下，分别加入SP6和T7RNA合成酶体外转录合成mRNA和cRNA探针。探针合成后，加入DNase(RNase free)消化转录模板，乙醇沉淀后，离心，溶解，电泳鉴定，在260 nm波长处测吸光度(A值)，计算探针含量。
组织切片原位杂交：参照文献[4]方法，按200～400 ng/组织片的量加入Dig-UTP标记的探针。
2 结果和讨论
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斑点杂交 以BSD-2.4 cDNA为探针，与对照tRNA的杂交信号呈阴性；与大鼠脑、心、肝、肾、肺、睾丸组织RNA杂交，仅在睾丸组织中显示较强的杂交信号，并随着RNA浓度的降低，杂交信号依次减弱(图1)。
图1 BSD-2.4 cDNA与大鼠组织mRNA斑点杂交结果
Fig 1 Dot blot of mRNA of 7 different rat tissues with BSD-2.4 cDNA
1.brain; 2.heart; 3.liver; 4.kidney; 5.lung; 6.testis; 7.tRNA
Northern杂交 以β-actin作为对mRNA量的评估和杂交方法的对照，β-actin在心脏、骨骼肌、前列腺和结肠中有1.8和2.0 kb两种形式，其他组织只有一种2.0 kb形式(图2a)。以BSD-2.4 cDNA为探针，与人心脏、脑、胎盘、肺脏、肝脏、骨骼肌、肾脏、胰脏、以及脾脏、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠、外周血白细胞共16种组织的杂交结果显示，只在睾丸组织中有一清晰的强杂交带，位置在3.8～4.0 kb之间，其余均为阴性(图2b)。Northern结果和斑点杂交结果一致证明，BSD-2.4 cDNA具有很强的组织特异性，而且不同种属间(人和大鼠)有着相同的组织特异性。这为用动物作对象进行功能研究提供了条件和依据。该基因仅在睾丸组织中表达，在其他组织中不表达的结果表明此基因编码的蛋白质仅出现在睾丸组织中，提示其编码蛋白质与睾丸的生殖功能可能有密切关系。
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图2 BSD-2.4 cDNA与人组织mRNA Northern blot杂交结果
Fig 2 Northern blot of mRNA from 16 human tissues (two membranes) with BSD-2.4 cDNA probe
Membrane I：1.heart; 2.brain; 3.placenta; 4.lung; 5.liver; 6.skeletal; 7.kidney; 8.pancreas
Membrane Ⅱ：1.spleen; 2.thymus; 3.prostata; 4.testis; 5.ovary; 6.small intestine; 7.colon; 8.peripheral blood leukocyte
a：control，β-actin probe; b：BSD-2.4 cDNA probe
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Mobilizes for 1.35，2.4，4.4，7.5，9.5 kb RNA size marker bands are indicated
组织原位杂交 对照组，即未加探针组，用苏木素染色(图3a)。实验对照组以Sense RNA(mRNA)作为探针，杂交结果为阴性。为便于细胞定位，组织切片用苏木素复染，可见到
着色的细胞核(图3b)。实验组以anti-sense RNA(cRNA)作为探针，结果睾丸曲细精管截面上有阳性的杂交信号(图3c)。这些信号主要分布在生精过程中的各级生精细胞中，并随着生精细胞的发育顺序，杂交信号强度呈减弱趋势。表明BSD-2.4 cDNA的转录表达发生于精子成熟的整个时期，其编码蛋白可能与精子细胞的分化有关。
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图3 BSD-2.4与人睾丸组织原位杂交结果
Fig 3 In situ hybridization of human testis sections with BSD-2.4 antisense RNA probe
a.no probe ×60; b.sense RNA ×378; c.anti-sense RNA ×252
到目前为止，对精子膜蛋白质深入研究的报道仍然较少。此基因被较早分离出，在现有的基因库中无同源性，因此引起了同行的注意[5，6]。本文工作证明BSD-2.4具有强组织特异性，其是否有希望成为寻找免疫避孕疫苗的候选蛋白质抗原，还有待于今后进一步深入研究。
△国家自然科学基金(39670762),卫生部科学研究基金(96-1-007)及863高技术基金(863-102-07-05-01)资助
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张梅林为通讯作者
作者单位：张梅林 周雪峰 曹登峰 缪时英 邢志军 王琳芳 (国家计划生育委员会科学技术研究所,北京,100081)
吴燕婉 宗书东 (中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北京 100005)
参考文献
1 Zhang ML，WANG LF，Miao SY，et al.Isolation and sequencing of the cDNA encoding the 75-kD human sperm protein related to infertility.Chin Med J，1992，105(12):998～1003
2 Chomczynski P.Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal Biochem，1987，162(1)：156～157
, 百拇医药
3 王琳芳，潘华珍.分子生物学基本技术.北京：北京生理科学会.1991.48～62
4 吴燕婉，宗书东，于同德，等.编码人精子膜蛋白YWK-Ⅱ基因在人睾丸组织表达的研究.中国科学(C辑)，1997，27(6)：555～561
5 Benoff S.The Role of cholesterol during capacitation of human spermatozoa.Hum Repro，1993，8(12)：2001～2006
6 Benoff S，Rushbrook JI，Hurlet IR，et al.Co-expression of mannose-ligand and non-nuclear progesterone receptors on motile human sperm identifies an acrosome-reaction inducible subpopulation.Am J Reprod Immunol，1995，34(2):100～115, http://www.100md.com