抗凝血酶因子Ⅲ的分子生物学研究进展
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国外医学分子生物学分册 2000年第22卷第1期
抗凝血酶因子Ⅲ的分子生物学研究进展
吴强 成都生物制品研究所(成都，610063)
摘 要 AT-Ⅲ是人血浆中重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂，由9个α-螺旋结构，3个β-折叠，一个反应中心环组成。天然AT-Ⅲ与肝素结合使半掩埋的RCL排出分子表面，AT-Ⅲ分子处于高抑制活性构象。AT-Ⅲ基因位于1q23-25，长度为19kb。外显子I前后的DNA序列调控AT-Ⅲ基因的表达。基因的缺失， 变异将导致AT-Ⅲ分子在血浆中的浓度低下或功能异常，引发血栓性疾病。
关键词 ： 抗凝血酶因子Ⅲ
1 AT-Ⅲ的基本特征和生理功能
, 百拇医药 抗凝血酶因子Ⅲ(antithrombin Ⅲ,AT-Ⅲ)是正常人血浆中最重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor,Serpin)。它通过抑制凝血酶(FⅡa)、FXa等活化凝血因子的活性来调节凝血活性，维持血凝平衡[1]。
AT-Ⅲ为单肽链糖蛋白，肽链由432个氨基酸残基组成。肽链中有3对二硫键，分别为Cys8-Cys128、Cys21-Cys95、Cys247-Cys430连接。AT-Ⅲ分子的糖含量为13.4%%，由4个寡聚糖链组成，寡聚糖链分别连接肽链第96、135、155、192位的Asn上。血浆 AT-Ⅲ中约有10%为亚糖基化 AT-Ⅲ(β- AT-Ⅲ)，肽连Asn135上缺乏寡聚糖链。完整的 AT-Ⅲ分子量为58kD，等电点pI=4.8[1,2]。
, 百拇医药
2 AT-Ⅲ分子结构特征
作为Serpin家族中的一员， AT-Ⅲ分子具有与其它Serpin相似的空间结构。 AT-Ⅲ分子主要由9个α-螺旋结构(A-至I-螺旋)、3个β-折叠(A-至C-β-折叠)、1个反应中心环(reactive center loop,RCL)共同组成一个大小约75-100A的球状分子。在 AT-Ⅲ分子表面分布有两个活性区，一个为蛋白酶抑制活性区，另一个为肝素亲和结合区[3]。
蛋白酶抑制活性区由 AT-Ⅲ分子的C-末端氨基酸组成，主要分布在A-β折叠和C-β折叠结构区之间。天然 AT-Ⅲ分子的A-β-折叠结构由5条肽段组成，分别为肽段168-174(s1A)、139-149(s2A)、212-225(s3A)、360-378(s5A)、319-330(s6A)。C-β-折叠由4条肽段组成。s5A与s1C(肽段398～402)间相连接的肽段379～397约有20个氨基酸长度的肽段在 AT-Ⅲ分子表面向外伸展形成RCL。RCL的空间结构与FXa、凝血酶等目标酶的活性位点的底物结合槽的空间结构互补。 AT-Ⅲ的反应中心Arg393-Ser394位于RCL上。与Serpin家族中的其它成员相比， AT-Ⅲ分子的RCL在分子表面处于一种半掩埋状态，RCL的氨基酸端P14、P15折入A-β-折叠的s3A、s5A间的间隙，成为A-β的不完全第4肽段(s4A')[4]。围绕半掩埋的RCL有7个氢键网络维持其稳定，P13(Glu381)的侧链基团与Tyr220侧链基团形成的氢键进一步稳定半掩埋的RCL[5，6]。
, 百拇医药
AT-Ⅲ分子的肝素亲和结合区主要由 AT-Ⅲ分子的N-末端不同位置的碱性氨基酸组成，分布在D-螺旋和A-螺旋的氨基端区域内。形成肝素亲和结合区的氨基酸残基包括Arg24、Arg47、Lys107、Lys114、Lys125、Arg129、Lys136[7]。不同位置的碱性氨基酸通过二硫键、α-螺旋结构而聚集在一起，排列在 AT-Ⅲ分子表面D-螺旋结构而聚集在一起，排列在 AT-Ⅲ分子表面D-螺旋和A-螺旋间一长50A的长槽上，形成一个阳离子聚集区，与肝素多聚糖链中一个五聚已糖顺序连接[5～7]。此外，Arg132、Lys133是 AT-Ⅲ与肝素五糖以外的额外连接有关[6]。
3 AT-Ⅲ的蛋白酶抑制作用机理
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AT-Ⅲ抑制目标酶的作用原理与其它Serpin抑制其目标酶的作用原理相同，是一种自毁模式的蛋白酶抑制过程。AT-Ⅲ在抑制FXa、凝血酶等目标酶的过程中，自身亦被裂解灭活[8]。
AT-Ⅲ抑制凝血酶或FXa的过程中，RCL捕获目标酶，形成AT-Ⅲ-目标酶复合物。AT-Ⅲ的反应中心被目标酶的底物结合位点识别，Arg393-Ser394间的肽键被酶解，RCL的氨基端约15个氨基酸长度的肽段向s3A、s5A间间隙插入成为A-β-折叠结构的新的中心肽段s4A，A-β-折叠膨胀，AT-Ⅲ-目标酶复合物成为相对稳定的中间复合体。最后，新产生的羧基将蛋白酶活性中心的氨基酸残基酰化，形成稳定的1：1共价复合物，使蛋白酶失去活性。同时，AT-Ⅲ因RCL的裂解而失去蛋白酶抑制活性[8,9]。s4A在A-β-折叠的插入，使AT-Ⅲ的反应中心发生了30A距离的迁移。s4A的迁移使分子构像发生了一系列的改变。肽段342-347由分子内部向外迁移形成新的抗原决定簇便是构像变化之一[10]。
, 百拇医药
缺乏肝素时，由于RCL处于半掩埋状态，AT-Ⅲ仅具备缓慢的目标酶抑制活笥。肝素的亲和结合使AT-Ⅲ分子的D-螺旋、E-螺旋、F-螺旋、以及s1A、s2A、s3A作为一个结构块与AT-Ⅲ分子的另外部分分离，暴露出A-β-折叠s3A、s5A间的间隙。同时因AT-Ⅲ分子结构块的迁移，破坏了P13与 Tyr220的氢键，P14、P15向分子外迁移，半掩埋的RCL向分子表面排出，RCL结构恢复至Serpin的RCL典型结构，从而加速了AT-Ⅲ对目标酶的抑制活性[4,6,11]。
图1 人AT-Ⅲ合成全过程示意图
4 AT-Ⅲ的基因与调节
人类AT-Ⅲ的基因位于1q23-25,长度约19kb，由7个外显子和6个内含子组成[12]。外显子I(exon I,ex I)长度为354bp，编码信息肽的前14个氨基酸顺序；exⅡ长度439bp，编码122个氨基酸顺序，包括信号肽的剩余18个氨基酸残基；exⅢa长度为330 bp，编码72个氨基酸顺序；exⅢb长度为233bp，编码46个氨基酸顺序；exⅣ长度为505bp，编码131个氨基酸顺序；exⅤ长度为178bp，编码21个氨基酸顺序；exⅥ长度为206bp，编码58个氨基酸顺序[13,14]。从AT-Ⅲ基因转录的mRNA含1392bp，其中96bp编码32个氨基酸长度的信号肽，其余1296bp编码AT-Ⅲ全长432个氨基酸顺序[12]。
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AT-Ⅲ的启动基因位于ex I前的核苷酸序列-150～+68中。ex I及其两侧相邻DNA序列调控人AT-Ⅲ基因的表达[15,16]。
Tremp[15]及其同事在重组人Apo AT-Ⅱ转基因鼠的研究中，根据共同转基因的人AT-Ⅲ启动基因(ph AT-Ⅲ)对Apo A-Ⅱ表达的调节作用，证明ph AT-Ⅲ起调节作用的DNA序列为核苷酸顺序-67～-90，以及一123～-138。前者与肝脏富含的HNF4反应，后者与HNF3反应从而调节人AT-Ⅲ基因的器官特异性表达。
Fernandez-Rachubinski[16]及其同事将AT-Ⅲ基因的包括ex I及其两侧相邻DNA序列在内的DNA片段重组到HepG2、COS1、BSC40等细胞中，通过ex I及两侧相邻的DNA顺序对其下基因表达的增进作用，证明ex I及两侧的DNA片段调节人AT-Ⅲ基因的基本表达。起到调控作用的DNA片段为ex I两侧的两个DNA片段，一个片段为ex I5’端前核苷酸序列-150～+68，为AT-Ⅲ基因转录的起动基因；另一个片段为内含子I中核苷酸序列+300～+700，其调控作用与启动基因的调控作用相反，抑制或降低启动基因的转录活性。核苷酸序列-150-+68的调节活性主要由3个基本单元组成，单元A；核苷酸-92至-68；单元B：核苷酸-14至+37；以及单元C；核苷酸-126至-100[16]。Fernandez-Rachubinski[16]及其同事的研究证明，单元A可与HNF4、TRα、RXRα等反应，单元B可与C/EBPa反应，单元C可与HNF4反应。这些基因转录因子通过对核苷酸序列-150～+68中3个基本单元的作用调节人AT-Ⅲ基因的表达。
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5 AT-Ⅲ的遗传与变异
遗传性AT-Ⅲ缺陷为常染色体显性遗传，主要是AT-Ⅲ异常基因与正常基因的杂合子遗传型。AT-Ⅲ遗传缺陷的类型分为两大类型：I型(数量缺陷性变异)和Ⅱ(质量异常性变异)[14,17]。
I型AT-Ⅲ遗传缺陷为数量性遗传缺陷，血浆中的AT-Ⅲ抗原含量和功能水平皆较正常水平低50%[14,18～20]。引起I型AT-Ⅲ遗传缺陷的原因在于：①号染色体长臂缺失所致AT-Ⅲ基因的完全性缺失[18]；②部分基因的缺失[18]；③单一碱基的缺失、插入导致基因转录和翻译的缺陷[19]；④单一碱基对变异导致异常AT-Ⅲ的加工、分泌异常或细胞内外迅速的降解引发的缺陷[20]。
Ⅱ型AT-Ⅲ变异为质量异常性变异，临床表现为血浆中有略低、正常或略高的AT-Ⅲ抗原浓度，但血浆中出现了功能异常性AT-Ⅲ，因而AT-Ⅲ的活性低于正常水平。Ⅱ型变异AT-Ⅲ在遗传基因中发生了单一碱基对的变异，导致合成的AT-Ⅲ分子出现单一氨基酸替换，成为功能和结构异常性AT-Ⅲ。根据变异对AT-Ⅲ功能的影响方式将Ⅱ型AT-Ⅲ分子变异分为3类，即发生在反应中心位点的变异(reactive site,RS)，肝素连接位点的变异(heparin binding site,HBS),多效性变异(pleiotropic effect,PE)[21,22]。
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RS型变异是发生在RCL上的单一氨基酸替代变异。发生在RCL上的变异主要是发生在反应中心和RCL氨基羰的折叠保护区。反应中心Arg393的变异包括Arg393His,Arg393Cys,Arg393Pro变异。3个变异AT-Ⅲ表现为目标酶识别异常[23]。Ser394是AT-Ⅲ反应中被目标酶识别的另一个氨基酸，Ser394Leu-AT-Ⅲ由Serpin特性转变成为目标酶底物特性[14]。Gly392Asp是紧邻反应中心Arg393位置发生的替代变异，变异后的AT-Ⅲ缺乏对凝血酶的抑制功能。
Ala382，Ala384位于RCL的氨基端的P12、P10，处于RCL的折叠位置。P12、P10折叠部位的可迁移性是保证s4A向A-β-折叠插入的基础，对形成的AT-Ⅲ——目标酶中间体的稳定性极端重要。当P12、P10的Ala被极性大分子氨基酸替代后，影响了AT-Ⅲ目标酶中间体的稳定性，导致变异性AT-Ⅲ由Serpin特性向底物特性转化，目标酶抑制活性异常。P10位的变异包括Ala384Ser、Ala384Pro。P12的变异为Ala382Thr[14]。
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HBS型变异是发生在AT-Ⅲ的N-末端肝素亲和结合区的单一氨基酸点变异。变异后的氨基酸侧链基团影响了AT-Ⅲ的空间结构和电荷，改变了AT-Ⅲ对肝素的亲和力。HBS型变异包括He7Asn,Arg24Cys,Pro41 Leu,Arg47Cys,Arg47His,Arg47Ser,Leu99Phe,Arg129Gln[24,25]。
PE型变异是发生在PCL和HBS以外的氨基酸替代变异。变异结构通过AT-Ⅲ的二级结构的变化，影响到AT-Ⅲ的肝素结合位点和目标酶结合位点的空间结构，导致AT-Ⅲ功能异常。PE型变异主要发生在肽链402～409之间，位于二级结构的s1C→s4B之间。此肽段靠近RCL，其变异导致的空间结构异常通过s1C直接影响到RCL与目标酶的结合。同时此肽段内，有氢键与HBS连接，因而PE型变异也通过氢键作用，间接影响到HBS的空间结构，导致肝素结合能力异常。发生在s1C→s4B间的变异包括Phe402Cys，Phe402Ser，Phe402Leu，Ala404Thr，Asn405Lys，Arg406Met,Pro407Leu,Pro407Thr[14，26]。此外，还有发生在C-末端429位的氨基酸替代变异Pro429Leu[14],以及发生在349位的变异Ser349Pro[14]。
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参考文献
1 Turk B et al.Biochemistry,1997,36:6682
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17 Bayston TA,Lane DA.Thromb Haemost,1997;78:399
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26 Lane DA et al.J Clin Invest,1992:90:2422, http://www.100md.com
吴强 成都生物制品研究所(成都，610063)
摘 要 AT-Ⅲ是人血浆中重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂，由9个α-螺旋结构，3个β-折叠，一个反应中心环组成。天然AT-Ⅲ与肝素结合使半掩埋的RCL排出分子表面，AT-Ⅲ分子处于高抑制活性构象。AT-Ⅲ基因位于1q23-25，长度为19kb。外显子I前后的DNA序列调控AT-Ⅲ基因的表达。基因的缺失， 变异将导致AT-Ⅲ分子在血浆中的浓度低下或功能异常，引发血栓性疾病。
关键词 ： 抗凝血酶因子Ⅲ
1 AT-Ⅲ的基本特征和生理功能
, 百拇医药 抗凝血酶因子Ⅲ(antithrombin Ⅲ,AT-Ⅲ)是正常人血浆中最重要的丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine proteinase inhibitor,Serpin)。它通过抑制凝血酶(FⅡa)、FXa等活化凝血因子的活性来调节凝血活性，维持血凝平衡[1]。
AT-Ⅲ为单肽链糖蛋白，肽链由432个氨基酸残基组成。肽链中有3对二硫键，分别为Cys8-Cys128、Cys21-Cys95、Cys247-Cys430连接。AT-Ⅲ分子的糖含量为13.4%%，由4个寡聚糖链组成，寡聚糖链分别连接肽链第96、135、155、192位的Asn上。血浆 AT-Ⅲ中约有10%为亚糖基化 AT-Ⅲ(β- AT-Ⅲ)，肽连Asn135上缺乏寡聚糖链。完整的 AT-Ⅲ分子量为58kD，等电点pI=4.8[1,2]。
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2 AT-Ⅲ分子结构特征
作为Serpin家族中的一员， AT-Ⅲ分子具有与其它Serpin相似的空间结构。 AT-Ⅲ分子主要由9个α-螺旋结构(A-至I-螺旋)、3个β-折叠(A-至C-β-折叠)、1个反应中心环(reactive center loop,RCL)共同组成一个大小约75-100A的球状分子。在 AT-Ⅲ分子表面分布有两个活性区，一个为蛋白酶抑制活性区，另一个为肝素亲和结合区[3]。
蛋白酶抑制活性区由 AT-Ⅲ分子的C-末端氨基酸组成，主要分布在A-β折叠和C-β折叠结构区之间。天然 AT-Ⅲ分子的A-β-折叠结构由5条肽段组成，分别为肽段168-174(s1A)、139-149(s2A)、212-225(s3A)、360-378(s5A)、319-330(s6A)。C-β-折叠由4条肽段组成。s5A与s1C(肽段398～402)间相连接的肽段379～397约有20个氨基酸长度的肽段在 AT-Ⅲ分子表面向外伸展形成RCL。RCL的空间结构与FXa、凝血酶等目标酶的活性位点的底物结合槽的空间结构互补。 AT-Ⅲ的反应中心Arg393-Ser394位于RCL上。与Serpin家族中的其它成员相比， AT-Ⅲ分子的RCL在分子表面处于一种半掩埋状态，RCL的氨基酸端P14、P15折入A-β-折叠的s3A、s5A间的间隙，成为A-β的不完全第4肽段(s4A')[4]。围绕半掩埋的RCL有7个氢键网络维持其稳定，P13(Glu381)的侧链基团与Tyr220侧链基团形成的氢键进一步稳定半掩埋的RCL[5，6]。
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AT-Ⅲ分子的肝素亲和结合区主要由 AT-Ⅲ分子的N-末端不同位置的碱性氨基酸组成，分布在D-螺旋和A-螺旋的氨基端区域内。形成肝素亲和结合区的氨基酸残基包括Arg24、Arg47、Lys107、Lys114、Lys125、Arg129、Lys136[7]。不同位置的碱性氨基酸通过二硫键、α-螺旋结构而聚集在一起，排列在 AT-Ⅲ分子表面D-螺旋结构而聚集在一起，排列在 AT-Ⅲ分子表面D-螺旋和A-螺旋间一长50A的长槽上，形成一个阳离子聚集区，与肝素多聚糖链中一个五聚已糖顺序连接[5～7]。此外，Arg132、Lys133是 AT-Ⅲ与肝素五糖以外的额外连接有关[6]。
3 AT-Ⅲ的蛋白酶抑制作用机理
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AT-Ⅲ抑制目标酶的作用原理与其它Serpin抑制其目标酶的作用原理相同，是一种自毁模式的蛋白酶抑制过程。AT-Ⅲ在抑制FXa、凝血酶等目标酶的过程中，自身亦被裂解灭活[8]。
AT-Ⅲ抑制凝血酶或FXa的过程中，RCL捕获目标酶，形成AT-Ⅲ-目标酶复合物。AT-Ⅲ的反应中心被目标酶的底物结合位点识别，Arg393-Ser394间的肽键被酶解，RCL的氨基端约15个氨基酸长度的肽段向s3A、s5A间间隙插入成为A-β-折叠结构的新的中心肽段s4A，A-β-折叠膨胀，AT-Ⅲ-目标酶复合物成为相对稳定的中间复合体。最后，新产生的羧基将蛋白酶活性中心的氨基酸残基酰化，形成稳定的1：1共价复合物，使蛋白酶失去活性。同时，AT-Ⅲ因RCL的裂解而失去蛋白酶抑制活性[8,9]。s4A在A-β-折叠的插入，使AT-Ⅲ的反应中心发生了30A距离的迁移。s4A的迁移使分子构像发生了一系列的改变。肽段342-347由分子内部向外迁移形成新的抗原决定簇便是构像变化之一[10]。
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缺乏肝素时，由于RCL处于半掩埋状态，AT-Ⅲ仅具备缓慢的目标酶抑制活笥。肝素的亲和结合使AT-Ⅲ分子的D-螺旋、E-螺旋、F-螺旋、以及s1A、s2A、s3A作为一个结构块与AT-Ⅲ分子的另外部分分离，暴露出A-β-折叠s3A、s5A间的间隙。同时因AT-Ⅲ分子结构块的迁移，破坏了P13与 Tyr220的氢键，P14、P15向分子外迁移，半掩埋的RCL向分子表面排出，RCL结构恢复至Serpin的RCL典型结构，从而加速了AT-Ⅲ对目标酶的抑制活性[4,6,11]。
图1 人AT-Ⅲ合成全过程示意图
4 AT-Ⅲ的基因与调节
人类AT-Ⅲ的基因位于1q23-25,长度约19kb，由7个外显子和6个内含子组成[12]。外显子I(exon I,ex I)长度为354bp，编码信息肽的前14个氨基酸顺序；exⅡ长度439bp，编码122个氨基酸顺序，包括信号肽的剩余18个氨基酸残基；exⅢa长度为330 bp，编码72个氨基酸顺序；exⅢb长度为233bp，编码46个氨基酸顺序；exⅣ长度为505bp，编码131个氨基酸顺序；exⅤ长度为178bp，编码21个氨基酸顺序；exⅥ长度为206bp，编码58个氨基酸顺序[13,14]。从AT-Ⅲ基因转录的mRNA含1392bp，其中96bp编码32个氨基酸长度的信号肽，其余1296bp编码AT-Ⅲ全长432个氨基酸顺序[12]。
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AT-Ⅲ的启动基因位于ex I前的核苷酸序列-150～+68中。ex I及其两侧相邻DNA序列调控人AT-Ⅲ基因的表达[15,16]。
Tremp[15]及其同事在重组人Apo AT-Ⅱ转基因鼠的研究中，根据共同转基因的人AT-Ⅲ启动基因(ph AT-Ⅲ)对Apo A-Ⅱ表达的调节作用，证明ph AT-Ⅲ起调节作用的DNA序列为核苷酸顺序-67～-90，以及一123～-138。前者与肝脏富含的HNF4反应，后者与HNF3反应从而调节人AT-Ⅲ基因的器官特异性表达。
Fernandez-Rachubinski[16]及其同事将AT-Ⅲ基因的包括ex I及其两侧相邻DNA序列在内的DNA片段重组到HepG2、COS1、BSC40等细胞中，通过ex I及两侧相邻的DNA顺序对其下基因表达的增进作用，证明ex I及两侧的DNA片段调节人AT-Ⅲ基因的基本表达。起到调控作用的DNA片段为ex I两侧的两个DNA片段，一个片段为ex I5’端前核苷酸序列-150～+68，为AT-Ⅲ基因转录的起动基因；另一个片段为内含子I中核苷酸序列+300～+700，其调控作用与启动基因的调控作用相反，抑制或降低启动基因的转录活性。核苷酸序列-150-+68的调节活性主要由3个基本单元组成，单元A；核苷酸-92至-68；单元B：核苷酸-14至+37；以及单元C；核苷酸-126至-100[16]。Fernandez-Rachubinski[16]及其同事的研究证明，单元A可与HNF4、TRα、RXRα等反应，单元B可与C/EBPa反应，单元C可与HNF4反应。这些基因转录因子通过对核苷酸序列-150～+68中3个基本单元的作用调节人AT-Ⅲ基因的表达。
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5 AT-Ⅲ的遗传与变异
遗传性AT-Ⅲ缺陷为常染色体显性遗传，主要是AT-Ⅲ异常基因与正常基因的杂合子遗传型。AT-Ⅲ遗传缺陷的类型分为两大类型：I型(数量缺陷性变异)和Ⅱ(质量异常性变异)[14,17]。
I型AT-Ⅲ遗传缺陷为数量性遗传缺陷，血浆中的AT-Ⅲ抗原含量和功能水平皆较正常水平低50%[14,18～20]。引起I型AT-Ⅲ遗传缺陷的原因在于：①号染色体长臂缺失所致AT-Ⅲ基因的完全性缺失[18]；②部分基因的缺失[18]；③单一碱基的缺失、插入导致基因转录和翻译的缺陷[19]；④单一碱基对变异导致异常AT-Ⅲ的加工、分泌异常或细胞内外迅速的降解引发的缺陷[20]。
Ⅱ型AT-Ⅲ变异为质量异常性变异，临床表现为血浆中有略低、正常或略高的AT-Ⅲ抗原浓度，但血浆中出现了功能异常性AT-Ⅲ，因而AT-Ⅲ的活性低于正常水平。Ⅱ型变异AT-Ⅲ在遗传基因中发生了单一碱基对的变异，导致合成的AT-Ⅲ分子出现单一氨基酸替换，成为功能和结构异常性AT-Ⅲ。根据变异对AT-Ⅲ功能的影响方式将Ⅱ型AT-Ⅲ分子变异分为3类，即发生在反应中心位点的变异(reactive site,RS)，肝素连接位点的变异(heparin binding site,HBS),多效性变异(pleiotropic effect,PE)[21,22]。
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RS型变异是发生在RCL上的单一氨基酸替代变异。发生在RCL上的变异主要是发生在反应中心和RCL氨基羰的折叠保护区。反应中心Arg393的变异包括Arg393His,Arg393Cys,Arg393Pro变异。3个变异AT-Ⅲ表现为目标酶识别异常[23]。Ser394是AT-Ⅲ反应中被目标酶识别的另一个氨基酸，Ser394Leu-AT-Ⅲ由Serpin特性转变成为目标酶底物特性[14]。Gly392Asp是紧邻反应中心Arg393位置发生的替代变异，变异后的AT-Ⅲ缺乏对凝血酶的抑制功能。
Ala382，Ala384位于RCL的氨基端的P12、P10，处于RCL的折叠位置。P12、P10折叠部位的可迁移性是保证s4A向A-β-折叠插入的基础，对形成的AT-Ⅲ——目标酶中间体的稳定性极端重要。当P12、P10的Ala被极性大分子氨基酸替代后，影响了AT-Ⅲ目标酶中间体的稳定性，导致变异性AT-Ⅲ由Serpin特性向底物特性转化，目标酶抑制活性异常。P10位的变异包括Ala384Ser、Ala384Pro。P12的变异为Ala382Thr[14]。
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HBS型变异是发生在AT-Ⅲ的N-末端肝素亲和结合区的单一氨基酸点变异。变异后的氨基酸侧链基团影响了AT-Ⅲ的空间结构和电荷，改变了AT-Ⅲ对肝素的亲和力。HBS型变异包括He7Asn,Arg24Cys,Pro41 Leu,Arg47Cys,Arg47His,Arg47Ser,Leu99Phe,Arg129Gln[24,25]。
PE型变异是发生在PCL和HBS以外的氨基酸替代变异。变异结构通过AT-Ⅲ的二级结构的变化，影响到AT-Ⅲ的肝素结合位点和目标酶结合位点的空间结构，导致AT-Ⅲ功能异常。PE型变异主要发生在肽链402～409之间，位于二级结构的s1C→s4B之间。此肽段靠近RCL，其变异导致的空间结构异常通过s1C直接影响到RCL与目标酶的结合。同时此肽段内，有氢键与HBS连接，因而PE型变异也通过氢键作用，间接影响到HBS的空间结构，导致肝素结合能力异常。发生在s1C→s4B间的变异包括Phe402Cys，Phe402Ser，Phe402Leu，Ala404Thr，Asn405Lys，Arg406Met,Pro407Leu,Pro407Thr[14，26]。此外，还有发生在C-末端429位的氨基酸替代变异Pro429Leu[14],以及发生在349位的变异Ser349Pro[14]。
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