克罗卡林及优降糖对实验性急性心肌梗死的影响
何建新 邱健 向定成
摘 要：目的：研究克罗卡林及优降糖对心肌梗死面积及梗死部位心肌细胞三磷酸腺苷(ATP)含量的影响。方法：以Wistar大鼠为模型，开胸安置缺血-再灌注装置，将大鼠分为4组：A组未作特殊处理；B组阻断冠状动脉(冠脉)1小时，再灌注2小时；C组冠脉阻断前0.5小时静注克罗卡林100 μg/kg；D组冠脉阻断前0.5小时静注克罗卡林100 μg/kg，接着予优降糖0.3 mg/kg。各组动物经上述处理后，抽股静脉血测肌酸激酶浓度，随后B、C、D组各分成2个亚组，一亚组摘取心脏测梗死面积，另一亚组测梗死部位心肌ATP含量 。结果：缺血后血浆肌酸激酶含量升高，局部ATP浓度下降；克罗卡林缩小心肌梗死面积，降低血浆肌酸激酶浓度，减轻梗死部位心肌细胞ATP的消耗(C组与B组比较，各指标P值均<0.01)；优降糖对克罗卡林的上述效应有拮抗作用。结论：克罗卡林对缺血心肌有明显的保护作用；其机制可能与激活心肌细胞膜ATP敏感性钾通道有关；优降糖对克罗卡林的上述效应有拮抗作用。
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关键词：克罗卡林 优降糖 大鼠 心肌梗死，急性
三磷酸腺苷(ATP)敏感性钾通道的主要特性及其特异性激动剂克罗卡林、特异性抑制剂优降糖的作用正日益受到重视〔16〕。但由于实验动物模型不同，实验结论差异较大。本研究在同一动物模型研究克罗卡林及优降糖对心肌梗死面积及梗死部位心肌细胞内ATP含量的影响，并探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料：Wistar大鼠(第一军医大学实验动物室提供)，体重200～350 g，雌雄不拘。仪器：小动物呼吸机(DHG30浙江医科大学实验仪器厂)，万分之一电子分析天平(西德)，Z360K型低温离心机(西德)，LKB1251发光分析仪(瑞典)。药品：克罗卡林、优降糖(美国Sigma公司)，氯化硝基四氮唑蓝(上海前进制药厂)，ATP标准品(德国Boehirnger Mannheim Gmbh公司)，虫荧光素酶(上海第二军医大学)，肌酸激酶片状试剂(南京普医化试剂公司)。
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1.2 动物模型：按Himori等〔7〕的方法建立。简言之，乌拉坦麻醉大鼠，建立气道，设置潮气量4～6 ml/200 g，呼吸频率50～60次/min，开胸安放冠状动脉(冠脉)阻断与再通装置于冠状动脉主干，关闭胸腔，撤除呼吸机，恢复自主呼吸。
1.3 分组：大鼠84只分4组：A组：12只，未作特殊处理，直接抽血测肌酸激酶浓度，然后摘取心脏，测定正常心肌ATP含量；B组(缺血-再灌注组)：24只，持续阻断冠脉1小时，再灌注2小时；C组(克罗卡林组)：24只，阻断冠脉前0.5小时静注克罗卡林100 μg/kg，余同B组；D组(克罗卡林+优降糖组)：24只，阻断冠脉前0.5小时静注克罗卡林100 μg/kg，接着予静注优降糖0.3 mg/kg，余同B组。经上述处理后，各组抽股静脉血测肌酸激酶浓度，之后各分成2个亚组，每亚组12只，一亚组用于测定梗死面积，另一亚组用于测定心肌细胞ATP含量。
1.4 测定指标：①肌酸激酶：各处理组持续缺血-再灌注后，立刻抽股静脉血，离心分离血浆，测定该酶浓度；②梗死面积百分比：各亚组大鼠抽血后，立即取出心脏，称重，置-20 ℃冰箱1小时，切片(1 mm)氯化硝基四氮唑蓝染色，梗死心肌呈淡蓝色，非梗死区心肌呈深蓝色，以称重法算出心肌梗死区的百分比；③心肌细胞ATP含量：各亚组大鼠抽血后，立即取缺血区全层组织10～30 mg，置于液氮中保存，测定时经匀浆、低温离心、调节pH值后，取上清液用虫荧光素酶测定心肌细胞ATP含量。
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1.5 统计学方法：计量数据以均数±标准差(X±s)表示，各组间差异比较用方差分析。P<0.05表示差异具有显著性。
2 结 果
各实验组测定指标值见表1。可看出，缺血后心肌细胞内ATP含量下降，血浆肌酸激酶浓度升高；克罗卡林明显减少梗死面积，降低血浆肌酸激酶浓度，降低梗死部位心肌细胞内ATP消耗的速度；而优降糖对克罗卡林的上述效应有拮抗作用。
表1 克罗卡林及优降糖对梗死面积、肌酸激酶
浓度及心肌细胞ATP含量的影响(X±s)
组别
动物数
(只)
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心肌梗死面积
(%)
血浆肌酸激酶
(U/L)
ATP含量
(μmol/g)
A组
12
0
103.54± 11.50
6.23±0.55
B组
12
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37.83±5.56
1 540.76±189.14*
2.15±0.78*
C组
12
16.35±3.83△
581.79± 96.73△
4.26±0.74△
D组
12
25.16±5.11
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936.90±110.45
2.95±0.56
注：与A组比较：*P<0.01；与B、D组比较：△P<0.01
3 讨 论
近年来，心肌细胞膜ATP敏感性钾通道的主要特性及其病理生理意义正日益受到重视〔16〕。由于通道活动受细胞代谢水平即细胞内ATP浓度的调控，而通道的活动又直接影响细胞的膜电位即影响细胞的兴奋性，因此，ATP敏感性钾通道被认为是细胞代谢和细胞兴奋性之间的联系环节。由于该通道存在特异性激动剂如克罗卡林及特异性抑制剂如优降糖，使得对通道的研究成为可能。Cole等〔1〕证实，克罗卡林能显著减轻心肌缺血及再灌注损伤，改善再灌注心肌功能。作者前阶段工作显示，克罗卡林可降低缺血-再灌注时细胞内钙的超载〔2〕及自由基损伤〔3〕，同时明显减少缺血-再灌注时心律失常的发生〔4〕。但也有相反的结论，如Pail等〔5〕 、Robert等〔6〕实验结果显示，通道拮抗剂优降糖对心脏有保护作用，且主要表现在减少心律失常发生方面。Robert等〔6〕推测结论差异可能是由于实验动物不同所造成的。本实验在在体心脏建立缺血-再灌注模型，研究克罗卡林及优降糖对急性心肌梗死的影响，结果显示克罗卡林能缩小心肌梗死面积、减少梗死部位心肌细胞内ATP的消耗、降低血浆肌酸激酶的浓度，而通道特异性拮抗剂优降糖能明显减轻克罗卡林的上述作用。本研究结论与Cole等〔1〕结果相似。
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克罗卡林激活ATP敏感性钾通道后发挥心脏保护作用的可能机制〔16〕：①增加外向电流，缩短单相动作电位时间，因而降低电压依赖性Ca2+通道的活性，减少Ca2+内流；同时增加Na+Ca2+交换时间，使Ca2+外流增加，因而使心肌细胞内Ca2+浓度下降，心肌收缩力减弱，局部ATP消耗速度下降；②稳定细胞膜，保护线粒体的完整功能，减少自由基的产生；③通过抑制中性粒细胞的聚集，减少由于后者引起的氧自由基的产生。
本实验的意义：①为临床应用克罗卡林减轻缺血心肌的损伤提供了实验依据和参考；② 长期以来，一直应用硫脲类药物通过阻断胰腺β细胞上的ATP敏感性钾通道来治疗非胰岛素依赖性糖尿病，该类患者中冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的发病率很高，由于阻断ATP敏感性钾通道对缺血性心脏病是不利的，这就对该治疗方法的合理性提出了质疑。Meinert〔8〕临床调查也表明，优降糖明显提高了该类患者冠心病的发生率及死亡率。确切的结论还有待临床进一步的研究与证实。
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作者简介：何建新(1965-)，男(汉族)，广东揭阳人，硕士，主治医师。获全军科技进步三等奖、四等奖各1项，发表论文10余篇。
作者单位：何建新(广州军区广州总医院心内科，广东 广州 510010)
邱健(广州军区广州总医院心内科，广东 广州 510010)
向定成(广州军区广州总医院心内科，广东 广州 510010)
参考文献：
[1]Cole W C,Mcpherson C D,Sontag D.ATPregulated K+ channels protect the myocardium against ischemia/reperfusion damage.Circ Res,1991,69:571-574.
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[2]何建新，赖世忠，刘伊丽.Cromakalin对心肌细胞内游离钙的影响.中华心血管病杂志，1996，24(4)：302-304.
[3]何建新，黄洋浩，吴兴泉，等.克罗卡林抗脂质过氧化损伤的实验研究.中国循环杂志，1998，13(1)：48-49.
[4]何建新，赖世忠，刘伊丽，等.克罗卡林预防实验性心肌缺血-再灌注中触发性心律失常.中国循环杂志，1996，11(7)：411-414.
[5]Pail F,Kantor P F.Reduction of ischemic K+loss and arrhythmias in rat hearts.Circulation research,1990,66:478-480.
[6]Robert J,Hariman.Regional changes in blood flow,extracellular potassium and conduction during myocardial and ischemia and reperfusion.J Am Coll Cardiol,1993,21:798-803.
[7]Himori N,Matsuura A.A simple technique for occlusion and reperfusion of coronary artery in conscious rats.Am J Physiol,1989,256:H1719-H1725.
[8]Meinert C.A study of the effects of hypoglycemic agents on vascular complications in patients with adultonset diabetes.Diabetes,1970,15(6):747-752., 百拇医药
摘 要：目的：研究克罗卡林及优降糖对心肌梗死面积及梗死部位心肌细胞三磷酸腺苷(ATP)含量的影响。方法：以Wistar大鼠为模型，开胸安置缺血-再灌注装置，将大鼠分为4组：A组未作特殊处理；B组阻断冠状动脉(冠脉)1小时，再灌注2小时；C组冠脉阻断前0.5小时静注克罗卡林100 μg/kg；D组冠脉阻断前0.5小时静注克罗卡林100 μg/kg，接着予优降糖0.3 mg/kg。各组动物经上述处理后，抽股静脉血测肌酸激酶浓度，随后B、C、D组各分成2个亚组，一亚组摘取心脏测梗死面积，另一亚组测梗死部位心肌ATP含量 。结果：缺血后血浆肌酸激酶含量升高，局部ATP浓度下降；克罗卡林缩小心肌梗死面积，降低血浆肌酸激酶浓度，减轻梗死部位心肌细胞ATP的消耗(C组与B组比较，各指标P值均<0.01)；优降糖对克罗卡林的上述效应有拮抗作用。结论：克罗卡林对缺血心肌有明显的保护作用；其机制可能与激活心肌细胞膜ATP敏感性钾通道有关；优降糖对克罗卡林的上述效应有拮抗作用。
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关键词：克罗卡林 优降糖 大鼠 心肌梗死，急性
三磷酸腺苷(ATP)敏感性钾通道的主要特性及其特异性激动剂克罗卡林、特异性抑制剂优降糖的作用正日益受到重视〔16〕。但由于实验动物模型不同，实验结论差异较大。本研究在同一动物模型研究克罗卡林及优降糖对心肌梗死面积及梗死部位心肌细胞内ATP含量的影响，并探讨其可能机制。
1 材料与方法
1.1 材料：Wistar大鼠(第一军医大学实验动物室提供)，体重200～350 g，雌雄不拘。仪器：小动物呼吸机(DHG30浙江医科大学实验仪器厂)，万分之一电子分析天平(西德)，Z360K型低温离心机(西德)，LKB1251发光分析仪(瑞典)。药品：克罗卡林、优降糖(美国Sigma公司)，氯化硝基四氮唑蓝(上海前进制药厂)，ATP标准品(德国Boehirnger Mannheim Gmbh公司)，虫荧光素酶(上海第二军医大学)，肌酸激酶片状试剂(南京普医化试剂公司)。
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1.2 动物模型：按Himori等〔7〕的方法建立。简言之，乌拉坦麻醉大鼠，建立气道，设置潮气量4～6 ml/200 g，呼吸频率50～60次/min，开胸安放冠状动脉(冠脉)阻断与再通装置于冠状动脉主干，关闭胸腔，撤除呼吸机，恢复自主呼吸。
1.3 分组：大鼠84只分4组：A组：12只，未作特殊处理，直接抽血测肌酸激酶浓度，然后摘取心脏，测定正常心肌ATP含量；B组(缺血-再灌注组)：24只，持续阻断冠脉1小时，再灌注2小时；C组(克罗卡林组)：24只，阻断冠脉前0.5小时静注克罗卡林100 μg/kg，余同B组；D组(克罗卡林+优降糖组)：24只，阻断冠脉前0.5小时静注克罗卡林100 μg/kg，接着予静注优降糖0.3 mg/kg，余同B组。经上述处理后，各组抽股静脉血测肌酸激酶浓度，之后各分成2个亚组，每亚组12只，一亚组用于测定梗死面积，另一亚组用于测定心肌细胞ATP含量。
1.4 测定指标：①肌酸激酶：各处理组持续缺血-再灌注后，立刻抽股静脉血，离心分离血浆，测定该酶浓度；②梗死面积百分比：各亚组大鼠抽血后，立即取出心脏，称重，置-20 ℃冰箱1小时，切片(1 mm)氯化硝基四氮唑蓝染色，梗死心肌呈淡蓝色，非梗死区心肌呈深蓝色，以称重法算出心肌梗死区的百分比；③心肌细胞ATP含量：各亚组大鼠抽血后，立即取缺血区全层组织10～30 mg，置于液氮中保存，测定时经匀浆、低温离心、调节pH值后，取上清液用虫荧光素酶测定心肌细胞ATP含量。
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1.5 统计学方法：计量数据以均数±标准差(X±s)表示，各组间差异比较用方差分析。P<0.05表示差异具有显著性。
2 结 果
各实验组测定指标值见表1。可看出，缺血后心肌细胞内ATP含量下降，血浆肌酸激酶浓度升高；克罗卡林明显减少梗死面积，降低血浆肌酸激酶浓度，降低梗死部位心肌细胞内ATP消耗的速度；而优降糖对克罗卡林的上述效应有拮抗作用。
表1 克罗卡林及优降糖对梗死面积、肌酸激酶
浓度及心肌细胞ATP含量的影响(X±s)
组别
动物数
(只)
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心肌梗死面积
(%)
血浆肌酸激酶
(U/L)
ATP含量
(μmol/g)
A组
12
0
103.54± 11.50
6.23±0.55
B组
12
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37.83±5.56
1 540.76±189.14*
2.15±0.78*
C组
12
16.35±3.83△
581.79± 96.73△
4.26±0.74△
D组
12
25.16±5.11
, http://www.100md.com
936.90±110.45
2.95±0.56
注：与A组比较：*P<0.01；与B、D组比较：△P<0.01
3 讨 论
近年来，心肌细胞膜ATP敏感性钾通道的主要特性及其病理生理意义正日益受到重视〔16〕。由于通道活动受细胞代谢水平即细胞内ATP浓度的调控，而通道的活动又直接影响细胞的膜电位即影响细胞的兴奋性，因此，ATP敏感性钾通道被认为是细胞代谢和细胞兴奋性之间的联系环节。由于该通道存在特异性激动剂如克罗卡林及特异性抑制剂如优降糖，使得对通道的研究成为可能。Cole等〔1〕证实，克罗卡林能显著减轻心肌缺血及再灌注损伤，改善再灌注心肌功能。作者前阶段工作显示，克罗卡林可降低缺血-再灌注时细胞内钙的超载〔2〕及自由基损伤〔3〕，同时明显减少缺血-再灌注时心律失常的发生〔4〕。但也有相反的结论，如Pail等〔5〕 、Robert等〔6〕实验结果显示，通道拮抗剂优降糖对心脏有保护作用，且主要表现在减少心律失常发生方面。Robert等〔6〕推测结论差异可能是由于实验动物不同所造成的。本实验在在体心脏建立缺血-再灌注模型，研究克罗卡林及优降糖对急性心肌梗死的影响，结果显示克罗卡林能缩小心肌梗死面积、减少梗死部位心肌细胞内ATP的消耗、降低血浆肌酸激酶的浓度，而通道特异性拮抗剂优降糖能明显减轻克罗卡林的上述作用。本研究结论与Cole等〔1〕结果相似。
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克罗卡林激活ATP敏感性钾通道后发挥心脏保护作用的可能机制〔16〕：①增加外向电流，缩短单相动作电位时间，因而降低电压依赖性Ca2+通道的活性，减少Ca2+内流；同时增加Na+Ca2+交换时间，使Ca2+外流增加，因而使心肌细胞内Ca2+浓度下降，心肌收缩力减弱，局部ATP消耗速度下降；②稳定细胞膜，保护线粒体的完整功能，减少自由基的产生；③通过抑制中性粒细胞的聚集，减少由于后者引起的氧自由基的产生。
本实验的意义：①为临床应用克罗卡林减轻缺血心肌的损伤提供了实验依据和参考；② 长期以来，一直应用硫脲类药物通过阻断胰腺β细胞上的ATP敏感性钾通道来治疗非胰岛素依赖性糖尿病，该类患者中冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的发病率很高，由于阻断ATP敏感性钾通道对缺血性心脏病是不利的，这就对该治疗方法的合理性提出了质疑。Meinert〔8〕临床调查也表明，优降糖明显提高了该类患者冠心病的发生率及死亡率。确切的结论还有待临床进一步的研究与证实。
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作者简介：何建新(1965-)，男(汉族)，广东揭阳人，硕士，主治医师。获全军科技进步三等奖、四等奖各1项，发表论文10余篇。
作者单位：何建新(广州军区广州总医院心内科，广东 广州 510010)
邱健(广州军区广州总医院心内科，广东 广州 510010)
向定成(广州军区广州总医院心内科，广东 广州 510010)
参考文献：
[1]Cole W C,Mcpherson C D,Sontag D.ATPregulated K+ channels protect the myocardium against ischemia/reperfusion damage.Circ Res,1991,69:571-574.
, 百拇医药
[2]何建新，赖世忠，刘伊丽.Cromakalin对心肌细胞内游离钙的影响.中华心血管病杂志，1996，24(4)：302-304.
[3]何建新，黄洋浩，吴兴泉，等.克罗卡林抗脂质过氧化损伤的实验研究.中国循环杂志，1998，13(1)：48-49.
[4]何建新，赖世忠，刘伊丽，等.克罗卡林预防实验性心肌缺血-再灌注中触发性心律失常.中国循环杂志，1996，11(7)：411-414.
[5]Pail F,Kantor P F.Reduction of ischemic K+loss and arrhythmias in rat hearts.Circulation research,1990,66:478-480.
[6]Robert J,Hariman.Regional changes in blood flow,extracellular potassium and conduction during myocardial and ischemia and reperfusion.J Am Coll Cardiol,1993,21:798-803.
[7]Himori N,Matsuura A.A simple technique for occlusion and reperfusion of coronary artery in conscious rats.Am J Physiol,1989,256:H1719-H1725.
[8]Meinert C.A study of the effects of hypoglycemic agents on vascular complications in patients with adultonset diabetes.Diabetes,1970,15(6):747-752., 百拇医药