炎症因子及益肾活血泄浊汤对大鼠肾小球系膜细胞生长的影响
楚非 魏民 王谦 张悦 严京
内容提要 目的：探讨部分炎症因子及益肾活血泄浊汤对体外培养大鼠肾小球系膜细胞生长的影响。方法：应用脂多糖(LPS)及白细胞介素6(IL-6)作为刺激因子，观察其促系膜细胞增殖的作用；并采用血清药理学方法，提取动物的含药血清作用于上述受刺激的系膜细胞，观察益肾活血泄浊汤对系膜细胞增殖的影响。结果：LPS和IL-6具有明显促进系膜细胞增殖的作用，并呈一定的量效和时效关系；而益肾活血泄浊汤可显著拮抗LPS和IL-6的促细胞增殖作用。结论：系膜细胞是益肾活血泄浊汤发挥治疗作用的重要靶细胞，这可能是该方防治慢性肾小球肾炎发展的机制之一。
关键词：益肾活血泄浊汤 系膜细胞 脂多糖 白细胞介素6
1983年，Lovett等(1)首次观察到白细胞介素1(IL-1)能够刺激体外培养的大鼠系膜细胞(mesangial cells, MCs)增殖后，大量研究又相继发现了有多种细胞因子可通过自分泌或旁分泌的方式作用于系膜细胞，使其肥大、增殖及合成细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增多。而研究证明，系膜细胞的异常增殖及系膜外基质增多是多种肾小球疾病的共同病理特征(2)。因此，本研究通过观察不同刺激因子对系膜细胞的影响以及含中药血清对其增殖的抑制情况，为研究细胞因子对系膜细胞增殖的影响及其补肾方药的作用机制奠定了初步理论基础。
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材料与方法
1 大鼠系膜细胞的培养与鉴定 取雄性SD大鼠4只〔(180±20)g，北京市实验动物中心提供〕，断头处死，取出双肾，将肾皮质剪碎成1mm×1mm×1mm大小后移至不同大小孔径筛网过滤，经Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)消化，置于含20%胎牛血清(fetal calf serum, FCS)的 RPMI-1640培养液中培养。3天后可见上皮细胞生长，以后逐渐消失，约在第3周被梭形细胞取代，经转种传代后为均一的梭形细胞。免疫组化显示结蛋白和肌动蛋白阳性而角蛋白阴性，结合形态学及功能学观察结果证实为MCs。本实验所用的细胞均为2～5代的MCs。
2 含益肾活血泄浊汤大鼠血清制备 益肾活血泄浊汤由黄芪30g 川芎10g 灵芝30g 大黄10g 党参30g 泽泻20g 当归30g等组成，购自北京中医药大学附属东直门医院，水煎并浓缩至含生药4g/ml，每只SD大鼠(体重、来源同前)每日灌服药液3ml，连续14天，于末次灌胃2h后取血，离心取血清，灭活补体后0.22u无菌滤器过滤，分装冻存。正常大鼠血清取自上述未灌服中药前的大鼠，采用尾静脉取血法，处理方法同上。
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3 脂多糖(LPS)和白细胞介素6(IL-6)对MCs DNA合成的影响
3.1 剂量效应 取密度为5×104/ml的MCs种于96孔板，48h后，用2.5% FCS RPMI-1640营养液培养24h使细胞同步化，换用2.5%FCS RPMI-1640稀释LPS(Sigma公司产品)为1、10、20、40μg/ml；IL-6(北京邦定公司产品)为10、50、250、1000u/ml。以2.5%FCS RPMI-1640液作为对照组(下同)，每组设复孔6个。LPS组继续培养24h、IL-6组继续培养48h后。于最后6～8h加入生理盐水稀释的3H-TdR(中国原子能科学研究院提供)，最后用多头微量细胞收集器收集细胞于49型玻璃纤维滤纸上，蒸馏水充分洗涤，滤纸干燥后放入液闪瓶中，加入闪烁液，用液闪计数器测量放射性。全部数据以每分钟脉冲数(cpm)表示。
3.2 时间效应 同步化后的细胞分别加入2.5%FCS RPMI-1640稀释的LPS 20μg/ml、IL-6 250u/ml，以2.5%FCS RPMI-1640液为对照组，每组设复孔6个，LPS组于加样后9、18、24、48h；IL-6组于加样后18、24、32、48h收集细胞，测定3H-TdR值。
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4 含中药血清对MCs增生的抑制作用
4.1 不同浓度(v/v，下同)药物血清对MCs的影响 细胞同步化后按以下组别加入：Ⅰ组：2.5%FCS RPMI-1640；Ⅱ组：10%正常血清；Ⅲ组：5%药物血清；Ⅳ组：10%药物血清；Ⅴ组：20%药物血清；Ⅵ组：40%药物血清。每组设复孔6个，继续培养48h，按前述方法收集细胞，测定cpm值。
4.2 含中药血清对LPS、IL-6诱导的MCs DNA合成的抑制作用 细胞同步化后按以下组别加入：Ⅰ组：2.5%FCS RPMI-1640；Ⅱ组：10%正常血清；Ⅲ组：LPS 20μg/ml；Ⅳ组：IL-6 250u/ml；Ⅴ组：LPS加5%药物血清；Ⅵ组：LPS加10%药物血清；Ⅶ组：LPS加20%药物血清；Ⅷ组：IL-6加5%药物血清；Ⅸ组：IL-6加10%药物血清；Ⅹ组：IL-6加20%药物血清。每组设复孔6个，继续培养48h，按前述方法收集细胞，测定cpm值。
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5 中药血清对LPS刺激下MCs合成ECM胶原的影响 将MCs转种于24孔培养板内，同步化后按下列分组分别加入：Ⅰ组：2.5%FCS RPMI-1640；Ⅱ组：LPS 20μg/ml；Ⅲ组：LPS加5%药物血清；Ⅳ组：LPS加10%药物血清；Ⅴ组：LPS加20%药物血清。每组设复孔4个，继续培养72h后，用0.25%Ⅳ型胶原酶消化细胞，取上清按下述方法测定羟脯氨酸的含量。(1)水解：取上清500μl置于试管内，加入6mol/L盐酸1.5ml，高压15磅30min后取出放至室温；(2)中和：加入10mol/L氢氧化钠0.9ml，调其pH值至5～7，然后加入蒸馏水至5ml；(3)氧化：取两只试管，分别标号甲、乙，各加入上述反应液1.0ml后，再加入以下试剂：甲管为柠檬酸—醋酸盐缓冲液0.5ml，氯胺T 1.0ml；乙管为柠檬酸—醋酸盐缓冲液0.5ml，甲醇1ml；(4)显色：加入10%对二甲氨基苯甲醛1ml，煮沸2min，取出后冷却，然后用721分光光度计，测定560nm处的吸光度；(5)标准管测试：各管加入0.5ml羟脯氨酸应用液(10μg/ml)，补足蒸馏水至1ml，其余步骤同(3)、(4)，加入柠檬酸—醋酸盐缓冲液，氯胺T溶液，过氯酸终止氧化及显色，一同比色按下列公式测定结果：〔(甲管吸光度-乙管吸光度)/标准管吸光度〕×5×10μg/ml。
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6 统计学方法 数据以X±s表示，采用t检验。
结果
1 LPS和IL-6对MCs DNA合成的影响
1.1 LPS和IL-6对MCs的剂量效应 见表1。LPS在1μg/ml时MCs 3 H-TdR值即开始升高，随着浓度增加，cpm值也不断增加，但在40μg/ml时，cpm值有所下降，20μg/ml达到高峰。10μg/ml以上各剂量与对照组比较均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)；与LPS不同的是，IL-6则呈现典型的剂量效应，50u/ml以上的剂量组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。50u/ml与250u/ml及1000u/ml比较组间有统计学差异(P<0.05)，而后两者间无明显差异(P>0.05)。
表1 LPS及IL-6对MCs作用的剂量效应 (X±s)
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组别
n
cpm值
对 照
2.5%FCS RPMI-1640
6
521.67±21.63
LPS 1μg/ml
6
565.79±76.45
10μg/ml
6
, http://www.100md.com 781.67±96.17*
20μg/ml
6
891.83±88.29**
40μg/ml
6
760.17±51.31*
IL-6 10u/ml
6
540.13±69.06
50u/ml
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6
604.50±77.12*
250u/ml
6
1011.83±76.97**△
1000u/ml
6
1132.54±136.39**△
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与本组50u/ml剂量比较，△P<0.05
, http://www.100md.com 1.2 LPS和IL-6对MCs DNA的时间效应影响见表2。以20μg/ml的LPS作用于MCs，结果表明MCs的3H-TdR掺入率随时间延长而增加，与对照组比较，9h时cpm即升高，但无统计学意义，18h开始有显著性差异(P<0.05，P<0.01)；18h与24、48h组间差别有统计学意义(P<0.05)，24h组与48h组比较无明显差异(P>0.05)；以250u/ml的IL-6作用于MCs，3H-TdR的掺入率随时间延长而逐渐升高，18h以上各组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)；各组间比较也有统计学意义。
表2 LPS及IL-6对MCs作用的时间效应 (X±s)
组别
n
cpm值
对照48h
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6
521.67±21.63
LPS 9h
6
577.87±89.72
18h
6
703.17±63.86*
24h
6
891.83±88.29**△
48h
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6
930.27±66.37**△
IL-6 18h
6
698.78±64.58*▲▲
24h
6
856.89±56.69**▲
32h
6
958.67±98.78**▲
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48h
6
1011.83±76.97**
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与本组18h比较，△P<0.05；与本组48h比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01
2 含中药血清对MCs DNA合成的影响
2.1 不同浓度中药血清对MCs的影响 见表3。各剂量药物血清组对MCs的增殖均有不同程度的抑制作用；与Ⅰ组比较，Ⅳ、Ⅴ组有统计学意义(P<0.05)；与Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组均有统计学意义(P<0.05)；与Ⅳ组比较，Ⅲ、Ⅵ组有显著性差异(P<0.05)。
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表3 不同浓度药物血清对MCs的影响 (X±s)
组别
n
cpm值
Ⅰ
2.5% FCSRPMI-1640
6
521.67±21.63
Ⅱ
10%正常血清
6
557.86±87.24
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Ⅲ
5%药物血清
6
498.35±79.61△▲
Ⅳ
10%药物血清
6
418.76±123.15*△
Ⅴ
20%药物血清
6
452.48±69.53*△
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Ⅵ
40%药物血清
6
530.28±92.67▲
注：与Ⅰ组比较，*P<0.05；与Ⅱ组比较，△P<0.05；与Ⅳ组比较，▲P<0.05
2.2 含中药血清对LPS、IL-6诱导的MCs DNA合成的抑制作用 见表4。6个加药物血清组(Ⅴ～Ⅹ组)对LPS及IL-6导致MCs DNA合成增加均有明显的抑制(P<0.05，P<0.01)，其中尤以Ⅵ、Ⅸ组作用最为显著；与Ⅵ、Ⅸ组比较，Ⅴ、Ⅷ组有统计学意义(P<0.05)，而Ⅶ、Ⅹ组无显著性差异。
表4 药物血清对LPS及IL-6诱导的MCs DNA
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合成的影响作用 (X±s)
组别
n
cpm值
Ⅰ
2.5% FCSRPMI-1640
6
521.67±21.63
Ⅱ
10%正常血清
6
557.86±87.24
, http://www.100md.com Ⅲ
LPS 20μg/ml
6
891.83±88.29
Ⅳ
IL-6 250u/ml
6
1011.83±76.97
Ⅴ
LPS加5%药物血清
6
756.32±44.33*▲
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Ⅵ
LPS加10%药物血清
6
636.17±104.05**
Ⅶ
LPS加20%药物血清
6
723.57±68.67*
Ⅷ
IL-6加5%药物血清
6
886.44±93.84△○
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Ⅸ
IL-6加10%药物血清
6
701.17±53.69△△
Ⅹ
IL-6加20%药物血清
6
774.68±121.18△△
注：与Ⅲ组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Ⅳ组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与Ⅵ组比较，▲P<0.05；与Ⅸ组比较，○P<0.05
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3 含中药血清对LPS刺激下MCs合成ECM胶原的影响 见表5。羟脯氨酸测定结果显示，各剂量含中药血清组(Ⅲ～Ⅴ组)对LPS刺激MCs合成ECM增多有不同程度的抑制作用，尤以Ⅳ组最为明显，但组间无明显差异。
表5 药物血清对LPS刺激下MCs合成
细胞外基质胶原的影响 (X±s)
组别
n
羟脯氨酸含量(μg/ml)
Ⅰ
2.5% FCSRPMI-1640
4
5.64±0.55**
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Ⅱ
LPS 20μg/ml
4
18.85±6.13
Ⅲ
LPS加5%药物血清
4
13.52±4.93*
Ⅳ
LPS加10%药物血清
4
9.63±2.79**
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Ⅴ
LPS加20%药物血清
4
11.45±1.48**
注：与Ⅱ组比较，*P<0.05，**P<0.01
讨论
MCs是肾小球中功能最活跃的细胞，具有多种功能。正常情况下MCs不发生增殖状况，但在各种生物因子的作用下，MCs往往发生异常的增殖活动，同时伴随着ECM合成增加，持续下去，最终导致肾小球硬化(2)。所以从MCs生物学行为的研究来阐明肾小球肾炎和肾小球硬化的发病机制是近年来肾脏病理研究的热门课题。
目前已证实，有多种生物因子包括各种细胞因子、活化因子等可刺激体外培养的MCs DNA合成(3)。本研究选定致炎因子LPS、细胞因子IL-6作为攻击因子，观察它们对MCs的促增殖作用。我们对这两种攻击因子分别进行了剂量和时间效应观察，同时还观察了LPS对MCs ECM的影响。结果显示不同浓度的LPS对MCs的促进增殖作用表现出双相效应，在1～20μg/ml时，LPS对MCs DNA合成为剂量依赖式促进作用；而在20～40μg/ml浓度范围内，随着浓度的增高，MCs 3 H-TdR掺入率反而降低，其原因可能与过量的刺激反馈性地使MCs分裂周期抑制或刺激MCs产生能抑制其分裂的TGF-β有关。以20μg/ml LPS观察了作用时间对MCs DNA合成的影响，结果发现随着时间的延长，MCs的3H-TdR掺入率也随之增加；而羟脯氨酸含量测定结果表明LPS亦可显著促进MCs ECM的合成，由此可知，LPS不仅能够明显刺激MCs的增殖，而且还能进一步促进MCs分泌 ECM增加。同样IL-6对MCs的作用也呈现出了明显的剂量效应和时间效应。已知MCs具有吞噬、合成ECM等多种功能，而IL-6又与机体的炎症过程有关，因此，IL-6促进MCs的DNA合成可能在肾小球肾炎早期具有修复的意义(4)。
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我们在以前的动物实验研究中了解到，益肾活血泄浊汤对大鼠系膜增殖性肾炎具有显著的治疗作用，为进一步探讨其作用机制，本实验在细胞水平上研究了益肾活血泄浊汤对MCs的影响，结果发现，药物血清对MCs的DNA合成有明显的抑制作用，同时对LPS、IL-6导致MCs增殖亦有显著的抑制作用，亦即其具有拮抗LPS和IL-6的促增殖活性的作用。随后，我们在对LPS刺激MCs合成基质胶原的影响中发现，该药物血清对MCs合成ECM胶原均有不同程度的抑制作用，尤以中剂量(10%)浓度的药物血清作用最为显著。
分析益肾活血泄浊汤的作用机制，我们认为主要有以下几点：(1)方中的大黄是我国常用的中草药，其对慢性肾功能衰竭有较好的治疗作用。大黄被吸收后，在体内可转化成大黄素、大黄酸等，有研究(5)发现，大黄素能够直接抑制MCs生长，拮抗IL-6、LPS等对MCs的刺激作用，并能抑制细胞外基质的合成；(2)方中含有活血化瘀功效的川芎，研究(6，7)发现，川芎的有效成分川芎嗪对体外培养的血管平滑肌细胞具有明显的抑制生长分裂作用；并且川芎嗪可明显抑制血管平滑肌细胞的Ⅰ、Ⅲ型前胶原α-1(Ⅰ)、α-1(Ⅲ)基因的mRNA的表达。而MCs的来源其一就是血管平滑肌样细胞，故川芎嗪抑制MCs的DNA合成和胶原分泌的机理可能与之相似。孙林等(8)还发现川芎嗪能够通过降低MCs分泌IL-6而抑制MCs的增生，其拮抗LPS、IL-6促进MCs DNA合成的机理可能与抑制炎症因子的释放有关；(3)方中的灵芝与黄芪的有效成分是灵芝多糖和黄芪多糖，中药药理研究发现它们具有调节机体免疫的功能；灵芝多糖、黄芪多糖可促进单核巨噬细胞、淋巴细胞分裂增殖，增强单核巨噬细胞的吞噬功能，从而增强机体的免疫能力。另外两者还有一定的免疫抑制作用，对超敏反应具有抑制作用。因此，其能够拮抗LPS的促DNA合成的胶原的分泌可能与其免疫抑制作用有关。
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总结本实验结果表明：益肾活血泄浊汤具有显著抑制系膜细胞增殖的作用，提示MCs是益肾活血泄浊汤发挥治疗作用的重要靶细胞。而通过抑制各种刺激因子的促MCs增殖的作用可能是该方药防治肾小球硬化发生、发展的重要环节之一。
本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39570893)
楚非(北京医科大学病理学系 北京 100083)
魏民(北京中医药大学病理教研室)
王谦(北京中医药大学病理教研室)
张悦(北京中医药大学病理教研室)
严京(北京中医药大学病理教研室)
参考文献
, 百拇医药
1.Lovett DH, Ryan JR, Sterzel RB. Stimulation of rat mesangial cell proliferation by macrophage interleukin 1. J Immunol 1983；131∶2830—2836.
2.Shultz PJ, Raij L. The glomerular mesangium: role in initation and progression of renal injury. Am J Kidney Dis 1991；17(suppl)∶8—14.
3.魏 民，张月娥，张泰和.肾脏病理学回顾与展望.中华病理学杂志 1995；24(4)∶115—118.
4.Coleman DL, Reuf C. Interleukin-6: an autocrine regulator of mesangial cell growth. Kidney Int 1992；41∶604—606.
, 百拇医药
5.胡伟新，刘志红，黎磊石.炎症因子对人肾小球系膜细胞生长的影响及大黄素的抑制作用.金陵医院学报 1993；6(1)∶64—67.
6.唐利龙，汪丽蕙，朱国英.川芎嗪和肝素对原代培养血管平滑肌细胞生长分裂的影响.中国中西医结合杂志 1995；15(1)∶38—39.
7.唐利龙，汪丽蕙，张均华.川芎嗪对原代培养血管平滑肌细胞的胶原基因表达的影响.中国中西医结合杂志 1995；15(11)∶666—669.
8.孙 林，易著文，虞佩兰.川芎嗪对人胎肾小球系膜细胞的增殖的影响及其机理的探讨.中国中西医结合杂志 1995；15(3)∶134—136., 百拇医药
内容提要 目的：探讨部分炎症因子及益肾活血泄浊汤对体外培养大鼠肾小球系膜细胞生长的影响。方法：应用脂多糖(LPS)及白细胞介素6(IL-6)作为刺激因子，观察其促系膜细胞增殖的作用；并采用血清药理学方法，提取动物的含药血清作用于上述受刺激的系膜细胞，观察益肾活血泄浊汤对系膜细胞增殖的影响。结果：LPS和IL-6具有明显促进系膜细胞增殖的作用，并呈一定的量效和时效关系；而益肾活血泄浊汤可显著拮抗LPS和IL-6的促细胞增殖作用。结论：系膜细胞是益肾活血泄浊汤发挥治疗作用的重要靶细胞，这可能是该方防治慢性肾小球肾炎发展的机制之一。
关键词：益肾活血泄浊汤 系膜细胞 脂多糖 白细胞介素6
1983年，Lovett等(1)首次观察到白细胞介素1(IL-1)能够刺激体外培养的大鼠系膜细胞(mesangial cells, MCs)增殖后，大量研究又相继发现了有多种细胞因子可通过自分泌或旁分泌的方式作用于系膜细胞，使其肥大、增殖及合成细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增多。而研究证明，系膜细胞的异常增殖及系膜外基质增多是多种肾小球疾病的共同病理特征(2)。因此，本研究通过观察不同刺激因子对系膜细胞的影响以及含中药血清对其增殖的抑制情况，为研究细胞因子对系膜细胞增殖的影响及其补肾方药的作用机制奠定了初步理论基础。
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材料与方法
1 大鼠系膜细胞的培养与鉴定 取雄性SD大鼠4只〔(180±20)g，北京市实验动物中心提供〕，断头处死，取出双肾，将肾皮质剪碎成1mm×1mm×1mm大小后移至不同大小孔径筛网过滤，经Ⅳ型胶原酶(Sigma公司)消化，置于含20%胎牛血清(fetal calf serum, FCS)的 RPMI-1640培养液中培养。3天后可见上皮细胞生长，以后逐渐消失，约在第3周被梭形细胞取代，经转种传代后为均一的梭形细胞。免疫组化显示结蛋白和肌动蛋白阳性而角蛋白阴性，结合形态学及功能学观察结果证实为MCs。本实验所用的细胞均为2～5代的MCs。
2 含益肾活血泄浊汤大鼠血清制备 益肾活血泄浊汤由黄芪30g 川芎10g 灵芝30g 大黄10g 党参30g 泽泻20g 当归30g等组成，购自北京中医药大学附属东直门医院，水煎并浓缩至含生药4g/ml，每只SD大鼠(体重、来源同前)每日灌服药液3ml，连续14天，于末次灌胃2h后取血，离心取血清，灭活补体后0.22u无菌滤器过滤，分装冻存。正常大鼠血清取自上述未灌服中药前的大鼠，采用尾静脉取血法，处理方法同上。
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3 脂多糖(LPS)和白细胞介素6(IL-6)对MCs DNA合成的影响
3.1 剂量效应 取密度为5×104/ml的MCs种于96孔板，48h后，用2.5% FCS RPMI-1640营养液培养24h使细胞同步化，换用2.5%FCS RPMI-1640稀释LPS(Sigma公司产品)为1、10、20、40μg/ml；IL-6(北京邦定公司产品)为10、50、250、1000u/ml。以2.5%FCS RPMI-1640液作为对照组(下同)，每组设复孔6个。LPS组继续培养24h、IL-6组继续培养48h后。于最后6～8h加入生理盐水稀释的3H-TdR(中国原子能科学研究院提供)，最后用多头微量细胞收集器收集细胞于49型玻璃纤维滤纸上，蒸馏水充分洗涤，滤纸干燥后放入液闪瓶中，加入闪烁液，用液闪计数器测量放射性。全部数据以每分钟脉冲数(cpm)表示。
3.2 时间效应 同步化后的细胞分别加入2.5%FCS RPMI-1640稀释的LPS 20μg/ml、IL-6 250u/ml，以2.5%FCS RPMI-1640液为对照组，每组设复孔6个，LPS组于加样后9、18、24、48h；IL-6组于加样后18、24、32、48h收集细胞，测定3H-TdR值。
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4 含中药血清对MCs增生的抑制作用
4.1 不同浓度(v/v，下同)药物血清对MCs的影响 细胞同步化后按以下组别加入：Ⅰ组：2.5%FCS RPMI-1640；Ⅱ组：10%正常血清；Ⅲ组：5%药物血清；Ⅳ组：10%药物血清；Ⅴ组：20%药物血清；Ⅵ组：40%药物血清。每组设复孔6个，继续培养48h，按前述方法收集细胞，测定cpm值。
4.2 含中药血清对LPS、IL-6诱导的MCs DNA合成的抑制作用 细胞同步化后按以下组别加入：Ⅰ组：2.5%FCS RPMI-1640；Ⅱ组：10%正常血清；Ⅲ组：LPS 20μg/ml；Ⅳ组：IL-6 250u/ml；Ⅴ组：LPS加5%药物血清；Ⅵ组：LPS加10%药物血清；Ⅶ组：LPS加20%药物血清；Ⅷ组：IL-6加5%药物血清；Ⅸ组：IL-6加10%药物血清；Ⅹ组：IL-6加20%药物血清。每组设复孔6个，继续培养48h，按前述方法收集细胞，测定cpm值。
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5 中药血清对LPS刺激下MCs合成ECM胶原的影响 将MCs转种于24孔培养板内，同步化后按下列分组分别加入：Ⅰ组：2.5%FCS RPMI-1640；Ⅱ组：LPS 20μg/ml；Ⅲ组：LPS加5%药物血清；Ⅳ组：LPS加10%药物血清；Ⅴ组：LPS加20%药物血清。每组设复孔4个，继续培养72h后，用0.25%Ⅳ型胶原酶消化细胞，取上清按下述方法测定羟脯氨酸的含量。(1)水解：取上清500μl置于试管内，加入6mol/L盐酸1.5ml，高压15磅30min后取出放至室温；(2)中和：加入10mol/L氢氧化钠0.9ml，调其pH值至5～7，然后加入蒸馏水至5ml；(3)氧化：取两只试管，分别标号甲、乙，各加入上述反应液1.0ml后，再加入以下试剂：甲管为柠檬酸—醋酸盐缓冲液0.5ml，氯胺T 1.0ml；乙管为柠檬酸—醋酸盐缓冲液0.5ml，甲醇1ml；(4)显色：加入10%对二甲氨基苯甲醛1ml，煮沸2min，取出后冷却，然后用721分光光度计，测定560nm处的吸光度；(5)标准管测试：各管加入0.5ml羟脯氨酸应用液(10μg/ml)，补足蒸馏水至1ml，其余步骤同(3)、(4)，加入柠檬酸—醋酸盐缓冲液，氯胺T溶液，过氯酸终止氧化及显色，一同比色按下列公式测定结果：〔(甲管吸光度-乙管吸光度)/标准管吸光度〕×5×10μg/ml。
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6 统计学方法 数据以X±s表示，采用t检验。
结果
1 LPS和IL-6对MCs DNA合成的影响
1.1 LPS和IL-6对MCs的剂量效应 见表1。LPS在1μg/ml时MCs 3 H-TdR值即开始升高，随着浓度增加，cpm值也不断增加，但在40μg/ml时，cpm值有所下降，20μg/ml达到高峰。10μg/ml以上各剂量与对照组比较均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)；与LPS不同的是，IL-6则呈现典型的剂量效应，50u/ml以上的剂量组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05，P<0.01)。50u/ml与250u/ml及1000u/ml比较组间有统计学差异(P<0.05)，而后两者间无明显差异(P>0.05)。
表1 LPS及IL-6对MCs作用的剂量效应 (X±s)
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组别
n
cpm值
对 照
2.5%FCS RPMI-1640
6
521.67±21.63
LPS 1μg/ml
6
565.79±76.45
10μg/ml
6
, http://www.100md.com 781.67±96.17*
20μg/ml
6
891.83±88.29**
40μg/ml
6
760.17±51.31*
IL-6 10u/ml
6
540.13±69.06
50u/ml
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6
604.50±77.12*
250u/ml
6
1011.83±76.97**△
1000u/ml
6
1132.54±136.39**△
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与本组50u/ml剂量比较，△P<0.05
, http://www.100md.com 1.2 LPS和IL-6对MCs DNA的时间效应影响见表2。以20μg/ml的LPS作用于MCs，结果表明MCs的3H-TdR掺入率随时间延长而增加，与对照组比较，9h时cpm即升高，但无统计学意义，18h开始有显著性差异(P<0.05，P<0.01)；18h与24、48h组间差别有统计学意义(P<0.05)，24h组与48h组比较无明显差异(P>0.05)；以250u/ml的IL-6作用于MCs，3H-TdR的掺入率随时间延长而逐渐升高，18h以上各组与对照组比较均有显著性差异(P<0.05)；各组间比较也有统计学意义。
表2 LPS及IL-6对MCs作用的时间效应 (X±s)
组别
n
cpm值
对照48h
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6
521.67±21.63
LPS 9h
6
577.87±89.72
18h
6
703.17±63.86*
24h
6
891.83±88.29**△
48h
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6
930.27±66.37**△
IL-6 18h
6
698.78±64.58*▲▲
24h
6
856.89±56.69**▲
32h
6
958.67±98.78**▲
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48h
6
1011.83±76.97**
注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与本组18h比较，△P<0.05；与本组48h比较，▲P<0.05，▲▲P<0.01
2 含中药血清对MCs DNA合成的影响
2.1 不同浓度中药血清对MCs的影响 见表3。各剂量药物血清组对MCs的增殖均有不同程度的抑制作用；与Ⅰ组比较，Ⅳ、Ⅴ组有统计学意义(P<0.05)；与Ⅱ组比较，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组均有统计学意义(P<0.05)；与Ⅳ组比较，Ⅲ、Ⅵ组有显著性差异(P<0.05)。
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表3 不同浓度药物血清对MCs的影响 (X±s)
组别
n
cpm值
Ⅰ
2.5% FCSRPMI-1640
6
521.67±21.63
Ⅱ
10%正常血清
6
557.86±87.24
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Ⅲ
5%药物血清
6
498.35±79.61△▲
Ⅳ
10%药物血清
6
418.76±123.15*△
Ⅴ
20%药物血清
6
452.48±69.53*△
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Ⅵ
40%药物血清
6
530.28±92.67▲
注：与Ⅰ组比较，*P<0.05；与Ⅱ组比较，△P<0.05；与Ⅳ组比较，▲P<0.05
2.2 含中药血清对LPS、IL-6诱导的MCs DNA合成的抑制作用 见表4。6个加药物血清组(Ⅴ～Ⅹ组)对LPS及IL-6导致MCs DNA合成增加均有明显的抑制(P<0.05，P<0.01)，其中尤以Ⅵ、Ⅸ组作用最为显著；与Ⅵ、Ⅸ组比较，Ⅴ、Ⅷ组有统计学意义(P<0.05)，而Ⅶ、Ⅹ组无显著性差异。
表4 药物血清对LPS及IL-6诱导的MCs DNA
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合成的影响作用 (X±s)
组别
n
cpm值
Ⅰ
2.5% FCSRPMI-1640
6
521.67±21.63
Ⅱ
10%正常血清
6
557.86±87.24
, http://www.100md.com Ⅲ
LPS 20μg/ml
6
891.83±88.29
Ⅳ
IL-6 250u/ml
6
1011.83±76.97
Ⅴ
LPS加5%药物血清
6
756.32±44.33*▲
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Ⅵ
LPS加10%药物血清
6
636.17±104.05**
Ⅶ
LPS加20%药物血清
6
723.57±68.67*
Ⅷ
IL-6加5%药物血清
6
886.44±93.84△○
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Ⅸ
IL-6加10%药物血清
6
701.17±53.69△△
Ⅹ
IL-6加20%药物血清
6
774.68±121.18△△
注：与Ⅲ组比较，*P<0.05，**P<0.01；与Ⅳ组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与Ⅵ组比较，▲P<0.05；与Ⅸ组比较，○P<0.05
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3 含中药血清对LPS刺激下MCs合成ECM胶原的影响 见表5。羟脯氨酸测定结果显示，各剂量含中药血清组(Ⅲ～Ⅴ组)对LPS刺激MCs合成ECM增多有不同程度的抑制作用，尤以Ⅳ组最为明显，但组间无明显差异。
表5 药物血清对LPS刺激下MCs合成
细胞外基质胶原的影响 (X±s)
组别
n
羟脯氨酸含量(μg/ml)
Ⅰ
2.5% FCSRPMI-1640
4
5.64±0.55**
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Ⅱ
LPS 20μg/ml
4
18.85±6.13
Ⅲ
LPS加5%药物血清
4
13.52±4.93*
Ⅳ
LPS加10%药物血清
4
9.63±2.79**
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Ⅴ
LPS加20%药物血清
4
11.45±1.48**
注：与Ⅱ组比较，*P<0.05，**P<0.01
讨论
MCs是肾小球中功能最活跃的细胞，具有多种功能。正常情况下MCs不发生增殖状况，但在各种生物因子的作用下，MCs往往发生异常的增殖活动，同时伴随着ECM合成增加，持续下去，最终导致肾小球硬化(2)。所以从MCs生物学行为的研究来阐明肾小球肾炎和肾小球硬化的发病机制是近年来肾脏病理研究的热门课题。
目前已证实，有多种生物因子包括各种细胞因子、活化因子等可刺激体外培养的MCs DNA合成(3)。本研究选定致炎因子LPS、细胞因子IL-6作为攻击因子，观察它们对MCs的促增殖作用。我们对这两种攻击因子分别进行了剂量和时间效应观察，同时还观察了LPS对MCs ECM的影响。结果显示不同浓度的LPS对MCs的促进增殖作用表现出双相效应，在1～20μg/ml时，LPS对MCs DNA合成为剂量依赖式促进作用；而在20～40μg/ml浓度范围内，随着浓度的增高，MCs 3 H-TdR掺入率反而降低，其原因可能与过量的刺激反馈性地使MCs分裂周期抑制或刺激MCs产生能抑制其分裂的TGF-β有关。以20μg/ml LPS观察了作用时间对MCs DNA合成的影响，结果发现随着时间的延长，MCs的3H-TdR掺入率也随之增加；而羟脯氨酸含量测定结果表明LPS亦可显著促进MCs ECM的合成，由此可知，LPS不仅能够明显刺激MCs的增殖，而且还能进一步促进MCs分泌 ECM增加。同样IL-6对MCs的作用也呈现出了明显的剂量效应和时间效应。已知MCs具有吞噬、合成ECM等多种功能，而IL-6又与机体的炎症过程有关，因此，IL-6促进MCs的DNA合成可能在肾小球肾炎早期具有修复的意义(4)。
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我们在以前的动物实验研究中了解到，益肾活血泄浊汤对大鼠系膜增殖性肾炎具有显著的治疗作用，为进一步探讨其作用机制，本实验在细胞水平上研究了益肾活血泄浊汤对MCs的影响，结果发现，药物血清对MCs的DNA合成有明显的抑制作用，同时对LPS、IL-6导致MCs增殖亦有显著的抑制作用，亦即其具有拮抗LPS和IL-6的促增殖活性的作用。随后，我们在对LPS刺激MCs合成基质胶原的影响中发现，该药物血清对MCs合成ECM胶原均有不同程度的抑制作用，尤以中剂量(10%)浓度的药物血清作用最为显著。
分析益肾活血泄浊汤的作用机制，我们认为主要有以下几点：(1)方中的大黄是我国常用的中草药，其对慢性肾功能衰竭有较好的治疗作用。大黄被吸收后，在体内可转化成大黄素、大黄酸等，有研究(5)发现，大黄素能够直接抑制MCs生长，拮抗IL-6、LPS等对MCs的刺激作用，并能抑制细胞外基质的合成；(2)方中含有活血化瘀功效的川芎，研究(6，7)发现，川芎的有效成分川芎嗪对体外培养的血管平滑肌细胞具有明显的抑制生长分裂作用；并且川芎嗪可明显抑制血管平滑肌细胞的Ⅰ、Ⅲ型前胶原α-1(Ⅰ)、α-1(Ⅲ)基因的mRNA的表达。而MCs的来源其一就是血管平滑肌样细胞，故川芎嗪抑制MCs的DNA合成和胶原分泌的机理可能与之相似。孙林等(8)还发现川芎嗪能够通过降低MCs分泌IL-6而抑制MCs的增生，其拮抗LPS、IL-6促进MCs DNA合成的机理可能与抑制炎症因子的释放有关；(3)方中的灵芝与黄芪的有效成分是灵芝多糖和黄芪多糖，中药药理研究发现它们具有调节机体免疫的功能；灵芝多糖、黄芪多糖可促进单核巨噬细胞、淋巴细胞分裂增殖，增强单核巨噬细胞的吞噬功能，从而增强机体的免疫能力。另外两者还有一定的免疫抑制作用，对超敏反应具有抑制作用。因此，其能够拮抗LPS的促DNA合成的胶原的分泌可能与其免疫抑制作用有关。
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总结本实验结果表明：益肾活血泄浊汤具有显著抑制系膜细胞增殖的作用，提示MCs是益肾活血泄浊汤发挥治疗作用的重要靶细胞。而通过抑制各种刺激因子的促MCs增殖的作用可能是该方药防治肾小球硬化发生、发展的重要环节之一。
本课题为国家自然科学基金资助项目(No.39570893)
楚非(北京医科大学病理学系 北京 100083)
魏民(北京中医药大学病理教研室)
王谦(北京中医药大学病理教研室)
张悦(北京中医药大学病理教研室)
严京(北京中医药大学病理教研室)
参考文献
, 百拇医药
1.Lovett DH, Ryan JR, Sterzel RB. Stimulation of rat mesangial cell proliferation by macrophage interleukin 1. J Immunol 1983；131∶2830—2836.
2.Shultz PJ, Raij L. The glomerular mesangium: role in initation and progression of renal injury. Am J Kidney Dis 1991；17(suppl)∶8—14.
3.魏 民，张月娥，张泰和.肾脏病理学回顾与展望.中华病理学杂志 1995；24(4)∶115—118.
4.Coleman DL, Reuf C. Interleukin-6: an autocrine regulator of mesangial cell growth. Kidney Int 1992；41∶604—606.
, 百拇医药
5.胡伟新，刘志红，黎磊石.炎症因子对人肾小球系膜细胞生长的影响及大黄素的抑制作用.金陵医院学报 1993；6(1)∶64—67.
6.唐利龙，汪丽蕙，朱国英.川芎嗪和肝素对原代培养血管平滑肌细胞生长分裂的影响.中国中西医结合杂志 1995；15(1)∶38—39.
7.唐利龙，汪丽蕙，张均华.川芎嗪对原代培养血管平滑肌细胞的胶原基因表达的影响.中国中西医结合杂志 1995；15(11)∶666—669.
8.孙 林，易著文，虞佩兰.川芎嗪对人胎肾小球系膜细胞的增殖的影响及其机理的探讨.中国中西医结合杂志 1995；15(3)∶134—136., 百拇医药