培养人视网膜色素上皮细胞的免疫细胞化学特征
刘洪雷 王雨生 惠延年 苏映军
摘 要 目的：观察体外培养人视网膜色素上皮细胞(RPE)免疫组化特征.方法：取第1代、第3～6代RPE，以间接免疫荧光方法比较角蛋白、波形蛋白、肌动蛋白、VⅢ因子和GFAP,HAM45等6种蛋白表达的特征.结果：与对照组相比，传代培养的人RPE角蛋白、波形蛋白表达呈阳性；随传代次数增多，角蛋白表达强度无明显变化，波形蛋白表达逐渐增强；肌动蛋白、VⅢ因子、神经纤维酸性蛋白(GFAP)、HMB45呈阴性.结论:体外培养可获得纯化、活性好的RPE.本中心建立的人RPE有限细胞系稳定表达角蛋白，并可表达波形蛋白.
关键词：色素上皮 眼 细胞，培养的 中间丝 免疫荧光技术，间接
0 引言
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞为眼内最重要的一种细胞，行使多样的生理功能，多种视网膜疾病的病因为RPE最初起源[1].RPE增生可引起增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)；RPE萎缩或功能减退与视网膜色素变性、老年黄斑变性密切相关[2～4].因此，体外培养纯化的RPE细胞对基础研究和临床应用具有十分重要的价值.细胞骨架中的中间丝，为多数细胞的重要蛋白质成分，其分布具有组织特异性，并且比较稳定，依此可判定正常和肿瘤组织的胚胎起源.我们以中间丝为主，采用间接免疫荧光方法对我中心建立的RPE细胞有限细胞系的纯度及数种蛋白表达的免疫组化特性进行了观察.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 RPE细胞的培养：从意外死亡的健康成年男性获取供体眼球,于死亡后12h内进行分离、培养RPE[5]，方法是：将眼球角膜向上置于特制的眼球托上，自赤道部环形剪开眼球壁，去掉眼前节及部分玻璃体.体视显微镜下仔细分离视网膜神经上皮层，于视盘周围将其剪除，制成RPE杯.D-Hanks液漂洗RPE杯2次，加入2.5mL/L胰蛋白酶和0.2mL/LEDTA混合液，37℃消化1h.用吸管轻轻吹打使细胞脱落，将含RPE细胞的消化液移入预先加有200mL/L小牛血清DMEM培养液(另含D-葡萄糖4500mg/L和庆大霉素10×104U/L，pH7.2～7.4)的离心管中，终止胰酶作用.重复消化1～2次，将RPE细胞悬液离心8min，1000r/min.弃上清，用培养液调整细胞密度至5×107/L后，接种于培养瓶，37℃,50mL/LCO2培养箱培养.RPE传代培养同文献[6]，选第1代、第3～6代细胞用于实验.人角朊细胞、成纤维细胞培养参见参考文献[7，8].兔抗人细胞角蛋白多克隆抗体，兔抗人VⅢ因子多克隆抗体，兔抗人GFAP多克隆抗体及鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体为Dako公司产品；鼠抗人波形蛋白单克隆抗体为Sigma公司产品，鼠抗人HMB45单克隆抗体为Zymed公司产品，羊抗兔、羊抗鼠IgG荧光抗体为SantaCruz公司产品.
, 百拇医药
1.2 方法 18mm×18mm的盖玻片平铺于直径10cm的培养皿中，将200μL、密度为4×107/LRPE细胞悬液滴于盖片中央，于培养箱培养，4h～5h后补足培养液.细胞近满时，将盖片捞出，PBS漂洗2～3次，冰丙酮固定10min～15min，自然干燥后于4℃密闭保存.细胞爬片经PBS漂洗后入甲醇3mL/LH2O230min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS漂洗2次后，入0.3mL/LTritonX-10015min；PBS漂洗，加入1∶50稀释的一抗，湿盒4℃过夜；PBS漂洗，加1∶50稀释的荧光抗体，于室温湿盒孵育5h，PBS漂洗，荧光显微镜观察.用PBS代替第一抗体作阴性对照，并作自发荧光试验.人角朊细胞爬片，人成纤维细胞爬片分别作为角蛋白、波形蛋白阳性对照.
2 结果
刚分离的hRPE细胞呈圆形,大小均一，充满黑色素粒，看不见细胞核.2d～4d后，大部分细胞贴壁变扁平，呈多边形；细胞伸出伪足，呈集落样生长；多数细胞显露清晰透明的细胞核，并见双核或多核细胞.14d～28d细胞铺满，呈致密排列的六边形或多边形(Fig1).传代培养的RPE细胞形态不很规则，呈梭形或不规则形，HE染色显示胞核内核仁丰富(Fig2).透射电镜观察细胞周围可见大量绒毛，胞膜完整.核膜双层结构清楚，有1～3个核仁.染色较深的小块状异染色质主要分布于核膜内侧及核仁周围；常染色质位于核中央，染色浅.胞浆内线粒体、内质网及高尔基体等细胞器丰富，偶见黑色素粒(Fig3).
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图 1 原代培养的hRPE细胞铺满期光镜观察
Fig 1 Confluent primary cultured hRPE cells under light microscope ×100
图 2 第4次传代培养hRPE细胞铺满期光镜(上)/HE染色(下)
Fig 2 4-passage confluent hRPE cells ×100 (upper)/HE ×200 (lower)
图 3 第3次传代培养hRPE细胞透射电镜观察
, 百拇医药
Fig 3 3-passage hRPE cells under transmission EM ×4 000
第1代、第3～6代RPE细胞角蛋白表达呈强阳性，荧光遍及胞质；阳性对照人角朊细胞为强阳性；第1代RPE细胞波形蛋白表达为阴性或弱阳性，表现为模糊的细胞轮廓或微弱的黄绿色荧光着染，第3～6代RPE细胞波形蛋白表达为阳性，在胞质中略呈网状，核周呈浓集荧光，阳性对照人成纤维细胞波形蛋白表达为强阳性，可见致密黄绿色荧光遍布胞质，部分为网状着染.hRPE细胞肌动蛋白、VⅢ因子、GFAP,HMB45表达均为阴性(Fig4～9,Tab1).
图 4 第4次传代培养hRPE细胞角蛋白阳性表达
Fig 4 Keratin of IMF in 4-passage hRPE cells: moderate staining in cytoplasm ×400
, 百拇医药
图 5 传代培养人角朊细胞角蛋白阳性表达
Fig 5 Keratin of IMF in subcultured human keratinocytes ×400
图 6 第4次传代培养hRPE细胞波形蛋白阳性表达
Fig 6 Vimentin of IMF in 4-passage hRPE:obvious reticulate fibre in cytoplasm ×400
图 7 传代培养人成纤维细胞波形蛋白阳性表达
, http://www.100md.com
Fig 7 Vimentin of IMF in human fiberblast: intensive and marked fluorescence in cytoplasm ×400
图 8 第1代培养hRPE细胞波形蛋白弱阳性
Fig 8 Vimentin of IMF in 1-passage hRPE cells: trace staining ×400
图 9 传代培养人角朊细胞波形蛋白阳性表达
Fig 9 IMF in subcultured human keratinocytes ×400
, 百拇医药
表 1 RPE和对照细胞标记强度
Antibody
RPE
First passage
RPE
3～6 passage
Keratinocytes
subcultured
Fibroblast
Keratin
卄
卄
, 百拇医药
卄
-
Vimentin
-/+
卄
卄
Actin
-
-
-
GFAP
, http://www.100md.com -
-
-
factor VⅢ
-
-
-
HMB45
-
-
-
Staining -：No；+：Trace； 卄：Moderate；：Intense.
, 百拇医药
3 讨论
hRPE细胞为眼后节致盲性眼病的主要效应细胞,体外培养纯化RPE细胞为多种眼病发病机制的研究以及RPE移植提供可靠的细胞来源.由于从哺乳动物获取并保持单纯RPE细胞培养十分困难，直到本世纪70年代初才由Alberts等成功完成hRPE细胞培养[9]，我们自90年代以来进行了hRPE细胞的培养，取得成熟的培养方法，并获得了hRPE细胞有限细胞系.本实验采用特异性好、反应灵敏的间接免疫荧光方法，研究本中心建立的hRPE有限细胞系的免疫组化特性，进一步鉴定其纯化程度.
中间丝与维持细胞和细胞器的形态及完整性有关，并参与调节细胞和细胞内的运动[10].不同组织细胞中间丝表达有差异，角蛋白分布于上皮和上皮来源细胞，波形蛋白主要存在于成纤维细胞和巨噬细胞等，GFAP存在于不同类型的神经胶质细胞，例如星形胶质细胞，肌动蛋白存在于肌细胞和肌成纤维细胞内；VⅢ因子可存在于血管内皮细胞.中间丝不仅分布有组织特异性，而且比较稳定，因而用于对细胞起源和肿瘤细胞的鉴别诊断.我们根据RPE细胞及其解剖毗邻的细胞成分，如成纤维细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等，可能混杂于分离的RPE过程中而造成RPE细胞纯度降低，采用角蛋白、波形蛋白、GFAP、肌动蛋白以及VⅢ因子等鉴定RPE细胞及其纯化程度.研究结果表明，培养的hRPE细胞始终可稳定表达角蛋白.第1代RPE细胞波形蛋白为弱阳性或阴性，第3～6代细胞则表达波形蛋白阳性，而第VⅢ因子、GFAP，HMB45、肌动蛋白均呈阴性表达.对于传代培养hRPE表达波形蛋白.Virtanen等[11]认为，就神经胶质细胞、上皮细胞而言，原代培养的大多数细胞仅表现为一种组织特异类型的中间丝蛋白，分别为GFAP和角蛋白.在这些细胞模型中，但由原代培养而来的增生细胞以及建立的相应细胞系则包含组织特异性中间丝和波形蛋白中间丝.Franke等[12]认为至少在组织水平上，免疫荧光方法均显示上皮细胞仅表现出细胞角蛋白特异的荧光.Mclellan等[13]在犬类RPE细胞体内、体外研究中也证实传代培养的RPE细胞显示为波形蛋白强阳性.以上结果均显示波形蛋白的出现为细胞适应组织培养条件而出现表型改变.
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实验证实传代培养的hRPE细胞可同时表达角蛋白及波形蛋白中间丝，表明本中心建立的hRPE有限细胞系为单纯的RPE细胞，可以作为基础研究及临床应用的细胞来源.
基金项目：国家自然科学基金资助项目 No.39700154
作者简介：刘洪雷，男，1970-01-04生，黑龙江齐齐哈尔市人，汉族.硕士研究生，导师惠延年.电话:(029)3375375
作者单位：第四军医大学西京医院：眼科中心 2烧伤外科，陕西西安710033
参考文献
1 American Academy of Ophthalmology. Basic and clinical science course (1989- 1990 ). Section 1. San Francisco: American Academy of Ophthalmology,1990:198-203
, 百拇医药
2 Nagasaki H, Shinagawa K，Mochizuki M. Risk factors for proliferative vitreoretinopathy. Prog Retin Eye Res, 1998; 17(1): 77-98
3 Hinton DR, He S, Lopez PF. Apoptosis in surgically excised choroidal neovascular membranes in age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol, 1998; 116(2): 203-209
4 Gartner S, Hendkind P. Pathology of retinitis pigmentosa. Ophthalmology, 1982;89(5):1425-1432
5 王雨生,严 密. 可见光对原代培养人视网膜色素上皮细胞的光化学损伤.中华眼底病杂志,1996;12(3):174-176
, http://www.100md.com
6 王 琳, 惠延年，王雨生. 人视网膜色素上皮细胞的冻存与复苏培养. 中华眼底病杂志,1997;13(3):157-159
7 Rheinwad JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratino cytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell, 1975; 6(3) 331-344
8 Eisinger M, Sudan S, Silver IA et al. Growth regulation of skin cells by epidermal cell-derived factors: implication for wound healing. Proc Natl Acad Sci USA, 1988; 85(6): 1937-1941
, 百拇医药
9 王雨生，严 密，杨抚华. 视网膜上皮细胞培养技术及应用. 中华眼底病杂志,1994;6(2):124-128
10 谢锦玉主编.现代细胞化学技术及其在中西医药中的应用,第1版,北京:中医古籍出版社,1998:196-204
11 Virtanen I, Lehto VP, Lehtonen E et al. Expression of intermediate filaments in cultured cells. J Cell Sci, 1981; 50(1):45-63
12 Franke WW, Schmid E, Winter S et al. Widespread occurrence of intermediate sized filaments of the vimentin-type in cultured cells from diverse vertebrates. Expl cell Res， 1979;123(1):25-46
13 Mclellan GJ, Bedford PG. The cytoskeletal intermediated filaments of canine retinal pigment epithelial cells in vivo and in vitro， Res Vet Sci， 1997;63(3):245-251, http://www.100md.com
摘 要 目的：观察体外培养人视网膜色素上皮细胞(RPE)免疫组化特征.方法：取第1代、第3～6代RPE，以间接免疫荧光方法比较角蛋白、波形蛋白、肌动蛋白、VⅢ因子和GFAP,HAM45等6种蛋白表达的特征.结果：与对照组相比，传代培养的人RPE角蛋白、波形蛋白表达呈阳性；随传代次数增多，角蛋白表达强度无明显变化，波形蛋白表达逐渐增强；肌动蛋白、VⅢ因子、神经纤维酸性蛋白(GFAP)、HMB45呈阴性.结论:体外培养可获得纯化、活性好的RPE.本中心建立的人RPE有限细胞系稳定表达角蛋白，并可表达波形蛋白.
关键词：色素上皮 眼 细胞，培养的 中间丝 免疫荧光技术，间接
0 引言
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞为眼内最重要的一种细胞，行使多样的生理功能，多种视网膜疾病的病因为RPE最初起源[1].RPE增生可引起增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)；RPE萎缩或功能减退与视网膜色素变性、老年黄斑变性密切相关[2～4].因此，体外培养纯化的RPE细胞对基础研究和临床应用具有十分重要的价值.细胞骨架中的中间丝，为多数细胞的重要蛋白质成分，其分布具有组织特异性，并且比较稳定，依此可判定正常和肿瘤组织的胚胎起源.我们以中间丝为主，采用间接免疫荧光方法对我中心建立的RPE细胞有限细胞系的纯度及数种蛋白表达的免疫组化特性进行了观察.
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 材料 RPE细胞的培养：从意外死亡的健康成年男性获取供体眼球,于死亡后12h内进行分离、培养RPE[5]，方法是：将眼球角膜向上置于特制的眼球托上，自赤道部环形剪开眼球壁，去掉眼前节及部分玻璃体.体视显微镜下仔细分离视网膜神经上皮层，于视盘周围将其剪除，制成RPE杯.D-Hanks液漂洗RPE杯2次，加入2.5mL/L胰蛋白酶和0.2mL/LEDTA混合液，37℃消化1h.用吸管轻轻吹打使细胞脱落，将含RPE细胞的消化液移入预先加有200mL/L小牛血清DMEM培养液(另含D-葡萄糖4500mg/L和庆大霉素10×104U/L，pH7.2～7.4)的离心管中，终止胰酶作用.重复消化1～2次，将RPE细胞悬液离心8min，1000r/min.弃上清，用培养液调整细胞密度至5×107/L后，接种于培养瓶，37℃,50mL/LCO2培养箱培养.RPE传代培养同文献[6]，选第1代、第3～6代细胞用于实验.人角朊细胞、成纤维细胞培养参见参考文献[7，8].兔抗人细胞角蛋白多克隆抗体，兔抗人VⅢ因子多克隆抗体，兔抗人GFAP多克隆抗体及鼠抗人肌动蛋白单克隆抗体为Dako公司产品；鼠抗人波形蛋白单克隆抗体为Sigma公司产品，鼠抗人HMB45单克隆抗体为Zymed公司产品，羊抗兔、羊抗鼠IgG荧光抗体为SantaCruz公司产品.
, 百拇医药
1.2 方法 18mm×18mm的盖玻片平铺于直径10cm的培养皿中，将200μL、密度为4×107/LRPE细胞悬液滴于盖片中央，于培养箱培养，4h～5h后补足培养液.细胞近满时，将盖片捞出，PBS漂洗2～3次，冰丙酮固定10min～15min，自然干燥后于4℃密闭保存.细胞爬片经PBS漂洗后入甲醇3mL/LH2O230min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS漂洗2次后，入0.3mL/LTritonX-10015min；PBS漂洗，加入1∶50稀释的一抗，湿盒4℃过夜；PBS漂洗，加1∶50稀释的荧光抗体，于室温湿盒孵育5h，PBS漂洗，荧光显微镜观察.用PBS代替第一抗体作阴性对照，并作自发荧光试验.人角朊细胞爬片，人成纤维细胞爬片分别作为角蛋白、波形蛋白阳性对照.
2 结果
刚分离的hRPE细胞呈圆形,大小均一，充满黑色素粒，看不见细胞核.2d～4d后，大部分细胞贴壁变扁平，呈多边形；细胞伸出伪足，呈集落样生长；多数细胞显露清晰透明的细胞核，并见双核或多核细胞.14d～28d细胞铺满，呈致密排列的六边形或多边形(Fig1).传代培养的RPE细胞形态不很规则，呈梭形或不规则形，HE染色显示胞核内核仁丰富(Fig2).透射电镜观察细胞周围可见大量绒毛，胞膜完整.核膜双层结构清楚，有1～3个核仁.染色较深的小块状异染色质主要分布于核膜内侧及核仁周围；常染色质位于核中央，染色浅.胞浆内线粒体、内质网及高尔基体等细胞器丰富，偶见黑色素粒(Fig3).
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图 1 原代培养的hRPE细胞铺满期光镜观察
Fig 1 Confluent primary cultured hRPE cells under light microscope ×100
图 2 第4次传代培养hRPE细胞铺满期光镜(上)/HE染色(下)
Fig 2 4-passage confluent hRPE cells ×100 (upper)/HE ×200 (lower)
图 3 第3次传代培养hRPE细胞透射电镜观察
, 百拇医药
Fig 3 3-passage hRPE cells under transmission EM ×4 000
第1代、第3～6代RPE细胞角蛋白表达呈强阳性，荧光遍及胞质；阳性对照人角朊细胞为强阳性；第1代RPE细胞波形蛋白表达为阴性或弱阳性，表现为模糊的细胞轮廓或微弱的黄绿色荧光着染，第3～6代RPE细胞波形蛋白表达为阳性，在胞质中略呈网状，核周呈浓集荧光，阳性对照人成纤维细胞波形蛋白表达为强阳性，可见致密黄绿色荧光遍布胞质，部分为网状着染.hRPE细胞肌动蛋白、VⅢ因子、GFAP,HMB45表达均为阴性(Fig4～9,Tab1).
图 4 第4次传代培养hRPE细胞角蛋白阳性表达
Fig 4 Keratin of IMF in 4-passage hRPE cells: moderate staining in cytoplasm ×400
, 百拇医药
图 5 传代培养人角朊细胞角蛋白阳性表达
Fig 5 Keratin of IMF in subcultured human keratinocytes ×400
图 6 第4次传代培养hRPE细胞波形蛋白阳性表达
Fig 6 Vimentin of IMF in 4-passage hRPE:obvious reticulate fibre in cytoplasm ×400
图 7 传代培养人成纤维细胞波形蛋白阳性表达
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Fig 7 Vimentin of IMF in human fiberblast: intensive and marked fluorescence in cytoplasm ×400
图 8 第1代培养hRPE细胞波形蛋白弱阳性
Fig 8 Vimentin of IMF in 1-passage hRPE cells: trace staining ×400
图 9 传代培养人角朊细胞波形蛋白阳性表达
Fig 9 IMF in subcultured human keratinocytes ×400
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表 1 RPE和对照细胞标记强度
Antibody
RPE
First passage
RPE
3～6 passage
Keratinocytes
subcultured
Fibroblast
Keratin
卄
卄
, 百拇医药
卄
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Vimentin
-/+
卄
卄
Actin
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GFAP
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factor VⅢ
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HMB45
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Staining -：No；+：Trace； 卄：Moderate；
：Intense., 百拇医药
3 讨论
hRPE细胞为眼后节致盲性眼病的主要效应细胞,体外培养纯化RPE细胞为多种眼病发病机制的研究以及RPE移植提供可靠的细胞来源.由于从哺乳动物获取并保持单纯RPE细胞培养十分困难，直到本世纪70年代初才由Alberts等成功完成hRPE细胞培养[9]，我们自90年代以来进行了hRPE细胞的培养，取得成熟的培养方法，并获得了hRPE细胞有限细胞系.本实验采用特异性好、反应灵敏的间接免疫荧光方法，研究本中心建立的hRPE有限细胞系的免疫组化特性，进一步鉴定其纯化程度.
中间丝与维持细胞和细胞器的形态及完整性有关，并参与调节细胞和细胞内的运动[10].不同组织细胞中间丝表达有差异，角蛋白分布于上皮和上皮来源细胞，波形蛋白主要存在于成纤维细胞和巨噬细胞等，GFAP存在于不同类型的神经胶质细胞，例如星形胶质细胞，肌动蛋白存在于肌细胞和肌成纤维细胞内；VⅢ因子可存在于血管内皮细胞.中间丝不仅分布有组织特异性，而且比较稳定，因而用于对细胞起源和肿瘤细胞的鉴别诊断.我们根据RPE细胞及其解剖毗邻的细胞成分，如成纤维细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等，可能混杂于分离的RPE过程中而造成RPE细胞纯度降低，采用角蛋白、波形蛋白、GFAP、肌动蛋白以及VⅢ因子等鉴定RPE细胞及其纯化程度.研究结果表明，培养的hRPE细胞始终可稳定表达角蛋白.第1代RPE细胞波形蛋白为弱阳性或阴性，第3～6代细胞则表达波形蛋白阳性，而第VⅢ因子、GFAP，HMB45、肌动蛋白均呈阴性表达.对于传代培养hRPE表达波形蛋白.Virtanen等[11]认为，就神经胶质细胞、上皮细胞而言，原代培养的大多数细胞仅表现为一种组织特异类型的中间丝蛋白，分别为GFAP和角蛋白.在这些细胞模型中，但由原代培养而来的增生细胞以及建立的相应细胞系则包含组织特异性中间丝和波形蛋白中间丝.Franke等[12]认为至少在组织水平上，免疫荧光方法均显示上皮细胞仅表现出细胞角蛋白特异的荧光.Mclellan等[13]在犬类RPE细胞体内、体外研究中也证实传代培养的RPE细胞显示为波形蛋白强阳性.以上结果均显示波形蛋白的出现为细胞适应组织培养条件而出现表型改变.
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实验证实传代培养的hRPE细胞可同时表达角蛋白及波形蛋白中间丝，表明本中心建立的hRPE有限细胞系为单纯的RPE细胞，可以作为基础研究及临床应用的细胞来源.
基金项目：国家自然科学基金资助项目 No.39700154
作者简介：刘洪雷，男，1970-01-04生，黑龙江齐齐哈尔市人，汉族.硕士研究生，导师惠延年.电话:(029)3375375
作者单位：第四军医大学西京医院：眼科中心 2烧伤外科，陕西西安710033
参考文献
1 American Academy of Ophthalmology. Basic and clinical science course (1989- 1990 ). Section 1. San Francisco: American Academy of Ophthalmology,1990:198-203
, 百拇医药
2 Nagasaki H, Shinagawa K，Mochizuki M. Risk factors for proliferative vitreoretinopathy. Prog Retin Eye Res, 1998; 17(1): 77-98
3 Hinton DR, He S, Lopez PF. Apoptosis in surgically excised choroidal neovascular membranes in age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol, 1998; 116(2): 203-209
4 Gartner S, Hendkind P. Pathology of retinitis pigmentosa. Ophthalmology, 1982;89(5):1425-1432
5 王雨生,严 密. 可见光对原代培养人视网膜色素上皮细胞的光化学损伤.中华眼底病杂志,1996;12(3):174-176
, http://www.100md.com
6 王 琳, 惠延年，王雨生. 人视网膜色素上皮细胞的冻存与复苏培养. 中华眼底病杂志,1997;13(3):157-159
7 Rheinwad JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratino cytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell, 1975; 6(3) 331-344
8 Eisinger M, Sudan S, Silver IA et al. Growth regulation of skin cells by epidermal cell-derived factors: implication for wound healing. Proc Natl Acad Sci USA, 1988; 85(6): 1937-1941
, 百拇医药
9 王雨生，严 密，杨抚华. 视网膜上皮细胞培养技术及应用. 中华眼底病杂志,1994;6(2):124-128
10 谢锦玉主编.现代细胞化学技术及其在中西医药中的应用,第1版,北京:中医古籍出版社,1998:196-204
11 Virtanen I, Lehto VP, Lehtonen E et al. Expression of intermediate filaments in cultured cells. J Cell Sci, 1981; 50(1):45-63
12 Franke WW, Schmid E, Winter S et al. Widespread occurrence of intermediate sized filaments of the vimentin-type in cultured cells from diverse vertebrates. Expl cell Res， 1979;123(1):25-46
13 Mclellan GJ, Bedford PG. The cytoskeletal intermediated filaments of canine retinal pigment epithelial cells in vivo and in vitro， Res Vet Sci， 1997;63(3):245-251, http://www.100md.com