影响淋巴细胞共刺激作用的体外实验研究
作者：周建华 苏燎原 童建 薛莲
单位：周建华 苏燎原(苏州医学院放射医学系，苏州，215007)；童建 薛莲(苏州医学院放射医学系，苏州，215007)
关键词：CD3单抗；CD28单抗；辐射；共刺激；淋巴细胞；增殖
苏州医学院学报000707 摘要 目的 观察CD3单抗、CD28单抗、PHA和低剂量辐射对淋巴细胞增殖的影响，探讨影响T淋巴细胞信号转导的因素。方法 分别以CD3单抗、CD28单抗、PHA和低剂量辐射作为作用因素，用3H-TdR掺入法观察在这些因素作用下，淋巴细胞增殖反应情况。结果 CD3单抗和CD28单抗联合刺激、PHA和低剂量辐射单独或联合处理，均可使淋巴细胞明显增殖。但CD3单抗和CD28单抗单独刺激，淋巴细胞增殖不明显。结论 CD3单抗和CD28单抗联合作用可使淋巴细胞有效增殖，PHA和低剂量辐射具有相似作用，对细胞免疫调节有重要意义。
, 百拇医药
中图法分类号 R811.5
Influence Factors of Human T Lymphocyte Costimulatory Effect in Vitro
Zhou Jianhua,Su Liaoyuan,Tong Jian,et al
(Department of Radiation Medical,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective Effects of CD3 McAb,CD28 McAb,PHA and low-dose γ-ray irradiation on T lymphocytes were investigated to explore factors of influencing T cell signals transduction.Method Using CD3 McAb and CD28 McAb minicking as the first and the second signals,and using PHA and low dose γ-rays irradiation as sitimulatory factors in T cell activation,the influences of these factors and the two signals on human lymphocyte proliferation response were studied with 3 H-thymidin incorporation.Results Lymphocyte proliferation response occurred when the two signals were treated costimulaneously or within certain intervals (within 40h).PHA and 10cGy γ-rays irradiation can also activate lymphocytes to proliferate.However,each of the two signals alone did not activate lymphocytes to proliferatc.Conclusion CD3 McAb,CD28 McAb,PHA and low-dose γ-rays irradiation could stimulate T lymphocyte proliferation,which is an important aspect in cellular immune regulation.
, 百拇医药
Key words CD3 McAb;CD28 McAb;irradiation;costimulation;lymphocyte;proliferation
T淋巴细胞的激活需要有两个转导信号，第一信号由T细胞表面特异性抗原受体(TCR)传递，它由TCRαβ(或γδ)、CD3复合物共同构成。TCR与抗原-主要组织相溶性复合体(MHC)结合后，由与TCR相连的CD3复合物把激活的信号传递到细胞内部，从而刺激T细胞产生一系列的生化反应[1，2]。随着TCR与抗原的结合，T细胞的存活很大程度上取决于第二信号，这信号由共刺激分子提供。B7.1是重要的共刺激分子，它与T淋巴细胞表面受体CD28相互作用，阻止T细胞凋亡，使被第一信号激活的T细胞继续增殖和分泌细胞因子[3～5]。我们在体外实验中用CD3和CD28单克隆抗体模拟第一和第二信号，诱导静止的淋巴细胞产生增殖反应。此外，用植物血凝素(PHA)和低剂量辐射进行了相应的研究。结果报道如下。
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1 材料与方法
1.1 材料 CD3单克隆抗体(IgG1,18.4mg/ml)，购自丹麦DAKO公司。CD28单克隆抗体(IgG1,1mg/ml),购自美国Exalpha公司。PHA(1mg/ml)购自上海医药公司。
1.2 方法
1.2.1 外周血淋巴细胞分离 无菌抽取正常人外周血，肝素抗凝。用淋巴细胞分离液离心分离单个核细胞，培养于含10%人AB血清的RPMI 1640培养液中。
1.2.2 CD3单抗、CD28单抗、PHA对淋巴细胞增殖的影响 在24孔培养板内，每孔加入淋巴细胞(106/ml)0.5ml,分别加入CD3单抗(1mg/ml)0.1ml、CD28单抗(1mg/ml)0.1ml、PHA(1mg/ml)0.1ml，37℃、5%CO2条件下培养至96h，在培养终止前16h加入3H-TdR 20μl(18.5×103Bq)，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，液体闪烁仪(Pharmacia,Swedin)测定每分衰变数(Dpm)[6]。
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1.2.3 CD3单抗、CD28单抗双信号对淋巴细胞的共刺激作用 24孔板内加入淋巴细胞5×105，先每孔加入CD3单抗(终浓度5μg/ml)，然后培养至不同时间(5h、10h、20h、40h)，洗去多余的CD3单抗后，加入CD28单抗(终浓度5μg/ml)，37℃、5%CO2条件下培养至96h，终止培养前16h加入3H-TdR 20μl(18.5×103Bq)，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，液体闪烁仪测定Dpm。
1.2.4 低剂量γ射线照射 24孔板内，每孔加入淋巴细胞5×105，分别加入CD3单抗、CD28单抗或PHA，置37℃培养箱内，同时用226Ra γ射线照射10h，培养板置于木制支架上，距辐射源16cm，剂量率1 cGy/h。照射后取出培养板置37℃、5%CO2条件下培养96h，终止培养前16h加入3H-TdR 20μl(18.5×103Bq)，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，液体闪烁仪测定Dpm。
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实验均重复3次。用Office软件统计分析。
2 结果
2.1 CD3单抗、CD28单抗对淋巴细胞增殖的影响 CD3单抗刺激后，淋巴细胞虽有增殖，但不明显(P>0.05)，CD28单抗刺激后也出现类似反应(P>0.05)。而CD3单抗和CD28单抗在不同时间共刺激后，淋巴细胞增殖增加10倍多。见图1。
图1 CD3单抗、CD28单抗对淋巴细胞增殖的影响
2.2 CD3单抗和CD28单抗在不同时间共刺激后对淋巴细胞增殖的影响 见图2。第一信号CD3单抗刺激后5h、10h、20h、40h接受第二信号CD28单抗刺激，均可使淋巴细胞增殖明显增加。虽40h接受第二信号刺激对淋巴细胞的增殖作用与前3个时点比已有所下降,但还是明显高于对照组(P<0.01)。
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图2 CD3单抗、CD28单抗不同时间共刺激后
对淋巴细胞增殖的影响
2.3 PHA、低剂量γ射线照射与CD3单抗、CD28单抗对淋巴细胞的联合作用 PHA、低剂量γ射线照射单独刺激可使淋巴细胞明显增殖。PHA和CD3单抗联合刺激，淋巴细胞增殖增加1.9倍。低剂量γ射线照射与CD3单抗联合刺激，也可使淋巴细胞增殖。但PHA和低剂量γ射线照射与CD28联合刺激，淋巴细胞的增殖反而降低。见图3。
图3 PHA、γ射线和CD3单抗或CD28单抗对淋巴细胞
增殖的影响
3 讨论
本实验结果证实了淋巴细胞激活和有效增殖需要两个信号的共同参与，与国内外报道[7～9]一致。仅有第一信号(CD3单抗)或第二信号(CD28单抗)均不能使淋巴细胞产生免疫应答。只有当T细胞接受了第一信号TCR/CD3复合物，并与抗原-MHC复合物结合后，又得到B7/CD28相互作用产生的共刺激信号，才能激活、增殖，产生免疫应答。共刺激相互转导的机制尚待研究。
, 百拇医药
从第一信号和第二信号刺激的时间先后来看，在先接受CD3单抗作用后的淋巴细胞，在20h内能得到第二信号(CD28单抗)的共刺激，其增殖反应将保持在较高水平，如果第二信号的刺激超过40h，则T细胞增殖将降低。这表明两个信号之间的传递是有时间程序的。T细胞的激活过程包括一系列的细胞生理生化反应。T细胞上的TCR与其配体结合后，抗原信息经CD3转导至细胞内。通过G蛋白的调节作用活化磷酸酯酶C，进而水解磷酯酰肌醇磷酸，由此产生的酯酰甘油(DAG)和肌醇磷酸(IP3)作为第二信使可激发两个平行而协调的信使链。IP3促使胞内钙离子浓度增加，进而使蛋白质磷酸化。DAG活化蛋白激酶C(PKC)，从而使诸多蛋白质磷酸化，信号依次得到转导[10，11]。如果这时细胞表面存在B7，则B7与CD28相互作用产生刺激信号，使细胞激活。如无B7表达，则CD4+ T细胞无能力应答抗原的刺激。
我们的实验结果还显示，丝裂原和低剂量辐射能增强CD3单抗的刺激效应，加快细胞内信号转导。这与刘树铮等[12]的结果类似。但丝裂原和低剂量辐射与CD28共同作用，不能使淋巴细胞产生增殖效应。表明T细胞双信号转导还受其它一些因素的影响，对此有待进一步研究。
, 百拇医药
周建华,博士研究生
苏燎原,导师
童建,导师
参考文献
1，Schwartz R.A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy.Science,1990,248∶1349
2，Rudd CE,Janssen O,Cai Y.Two-step TCR/CD3-CD4 and CD28 signaling in T cells:SH2/SH3 domains,protein-tyrosine and lipidkinases.J Immunol,1994,225∶234
3，GuinanEJ,Griccen V,Boussiotis G,et al.Pivotal role of the B7:CD28 pathy in transplation tolerance and tumor immunity.Blood,1994,84∶3261
, http://www.100md.com
4，Bluestone J.New perspectives of CD28-B7-mediaed T cell costimulation.Immunity,1995,2∶555
5，Walker LSK,Maleod JD,Boulougouris G,et al.Down-re-gulation of CD28 via Fas(CD95):influence of CD28 on T-cell apoptosis.Immunol,1998,94∶41
6，苏燎原，杜泽吉，刘克良，等.应用脂多糖激活人血B淋巴细胞亚群功能的研究.免疫学杂志，1996，12(4)∶247
7，王顺友，孙 雨，马宝骊.抗CD3、CD28单抗对T淋巴细胞共刺激作用的影响因素.上海免疫学杂志，1999，19(4)∶229
8，Abe R,Vandenberghe P,Craighead N,et al.Distinct sibnal transduction in mouse CD4+ and CD8+ splenic T cells after CD28 receptor ligation.J Immunol,1995,154∶985
, 百拇医药
9，Sansom DM,Wilson A ,Boshell M,et al.B7/CD28 but not LFA-3/CD2 interactions can provide thirdparty costimulation for human T-cell activation.Immunol,1993,80∶242
10，Ward SG,June CH,Olive D.PI 3-kinase:a pivotal pathway in T-cell activation?Immunol Today,1996,17∶187
11，Szamel M,Appel A,Schwinzer R,et al.Different protein kinase C isoenzymes regulate IL-2 receptor expression or IL-2 synthesis in human lymphocytes stimulated via the TCR.J Immunol,1998,160∶2207
12，刘树铮，苏 旭，张迎春.小剂量X射线全身照射后淋巴细胞TCR/CD3表达和Ca2+的变化。辐射研究与辐射工艺学报，1994，12∶61
收稿：2000-02-24, http://www.100md.com
单位：周建华 苏燎原(苏州医学院放射医学系，苏州，215007)；童建 薛莲(苏州医学院放射医学系，苏州，215007)
关键词：CD3单抗；CD28单抗；辐射；共刺激；淋巴细胞；增殖
苏州医学院学报000707 摘要 目的 观察CD3单抗、CD28单抗、PHA和低剂量辐射对淋巴细胞增殖的影响，探讨影响T淋巴细胞信号转导的因素。方法 分别以CD3单抗、CD28单抗、PHA和低剂量辐射作为作用因素，用3H-TdR掺入法观察在这些因素作用下，淋巴细胞增殖反应情况。结果 CD3单抗和CD28单抗联合刺激、PHA和低剂量辐射单独或联合处理，均可使淋巴细胞明显增殖。但CD3单抗和CD28单抗单独刺激，淋巴细胞增殖不明显。结论 CD3单抗和CD28单抗联合作用可使淋巴细胞有效增殖，PHA和低剂量辐射具有相似作用，对细胞免疫调节有重要意义。
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中图法分类号 R811.5
Influence Factors of Human T Lymphocyte Costimulatory Effect in Vitro
Zhou Jianhua,Su Liaoyuan,Tong Jian,et al
(Department of Radiation Medical,Suzhou Medical College,Suzhou,215007)
Abstract Objective Effects of CD3 McAb,CD28 McAb,PHA and low-dose γ-ray irradiation on T lymphocytes were investigated to explore factors of influencing T cell signals transduction.Method Using CD3 McAb and CD28 McAb minicking as the first and the second signals,and using PHA and low dose γ-rays irradiation as sitimulatory factors in T cell activation,the influences of these factors and the two signals on human lymphocyte proliferation response were studied with 3 H-thymidin incorporation.Results Lymphocyte proliferation response occurred when the two signals were treated costimulaneously or within certain intervals (within 40h).PHA and 10cGy γ-rays irradiation can also activate lymphocytes to proliferate.However,each of the two signals alone did not activate lymphocytes to proliferatc.Conclusion CD3 McAb,CD28 McAb,PHA and low-dose γ-rays irradiation could stimulate T lymphocyte proliferation,which is an important aspect in cellular immune regulation.
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Key words CD3 McAb;CD28 McAb;irradiation;costimulation;lymphocyte;proliferation
T淋巴细胞的激活需要有两个转导信号，第一信号由T细胞表面特异性抗原受体(TCR)传递，它由TCRαβ(或γδ)、CD3复合物共同构成。TCR与抗原-主要组织相溶性复合体(MHC)结合后，由与TCR相连的CD3复合物把激活的信号传递到细胞内部，从而刺激T细胞产生一系列的生化反应[1，2]。随着TCR与抗原的结合，T细胞的存活很大程度上取决于第二信号，这信号由共刺激分子提供。B7.1是重要的共刺激分子，它与T淋巴细胞表面受体CD28相互作用，阻止T细胞凋亡，使被第一信号激活的T细胞继续增殖和分泌细胞因子[3～5]。我们在体外实验中用CD3和CD28单克隆抗体模拟第一和第二信号，诱导静止的淋巴细胞产生增殖反应。此外，用植物血凝素(PHA)和低剂量辐射进行了相应的研究。结果报道如下。
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1 材料与方法
1.1 材料 CD3单克隆抗体(IgG1,18.4mg/ml)，购自丹麦DAKO公司。CD28单克隆抗体(IgG1,1mg/ml),购自美国Exalpha公司。PHA(1mg/ml)购自上海医药公司。
1.2 方法
1.2.1 外周血淋巴细胞分离 无菌抽取正常人外周血，肝素抗凝。用淋巴细胞分离液离心分离单个核细胞，培养于含10%人AB血清的RPMI 1640培养液中。
1.2.2 CD3单抗、CD28单抗、PHA对淋巴细胞增殖的影响 在24孔培养板内，每孔加入淋巴细胞(106/ml)0.5ml,分别加入CD3单抗(1mg/ml)0.1ml、CD28单抗(1mg/ml)0.1ml、PHA(1mg/ml)0.1ml，37℃、5%CO2条件下培养至96h，在培养终止前16h加入3H-TdR 20μl(18.5×103Bq)，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，液体闪烁仪(Pharmacia,Swedin)测定每分衰变数(Dpm)[6]。
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1.2.3 CD3单抗、CD28单抗双信号对淋巴细胞的共刺激作用 24孔板内加入淋巴细胞5×105，先每孔加入CD3单抗(终浓度5μg/ml)，然后培养至不同时间(5h、10h、20h、40h)，洗去多余的CD3单抗后，加入CD28单抗(终浓度5μg/ml)，37℃、5%CO2条件下培养至96h，终止培养前16h加入3H-TdR 20μl(18.5×103Bq)，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，液体闪烁仪测定Dpm。
1.2.4 低剂量γ射线照射 24孔板内，每孔加入淋巴细胞5×105，分别加入CD3单抗、CD28单抗或PHA，置37℃培养箱内，同时用226Ra γ射线照射10h，培养板置于木制支架上，距辐射源16cm，剂量率1 cGy/h。照射后取出培养板置37℃、5%CO2条件下培养96h，终止培养前16h加入3H-TdR 20μl(18.5×103Bq)，收集细胞于玻璃纤维滤纸上，液体闪烁仪测定Dpm。
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实验均重复3次。用Office软件统计分析。
2 结果
2.1 CD3单抗、CD28单抗对淋巴细胞增殖的影响 CD3单抗刺激后，淋巴细胞虽有增殖，但不明显(P>0.05)，CD28单抗刺激后也出现类似反应(P>0.05)。而CD3单抗和CD28单抗在不同时间共刺激后，淋巴细胞增殖增加10倍多。见图1。
图1 CD3单抗、CD28单抗对淋巴细胞增殖的影响
2.2 CD3单抗和CD28单抗在不同时间共刺激后对淋巴细胞增殖的影响 见图2。第一信号CD3单抗刺激后5h、10h、20h、40h接受第二信号CD28单抗刺激，均可使淋巴细胞增殖明显增加。虽40h接受第二信号刺激对淋巴细胞的增殖作用与前3个时点比已有所下降,但还是明显高于对照组(P<0.01)。
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图2 CD3单抗、CD28单抗不同时间共刺激后
对淋巴细胞增殖的影响
2.3 PHA、低剂量γ射线照射与CD3单抗、CD28单抗对淋巴细胞的联合作用 PHA、低剂量γ射线照射单独刺激可使淋巴细胞明显增殖。PHA和CD3单抗联合刺激，淋巴细胞增殖增加1.9倍。低剂量γ射线照射与CD3单抗联合刺激，也可使淋巴细胞增殖。但PHA和低剂量γ射线照射与CD28联合刺激，淋巴细胞的增殖反而降低。见图3。
图3 PHA、γ射线和CD3单抗或CD28单抗对淋巴细胞
增殖的影响
3 讨论
本实验结果证实了淋巴细胞激活和有效增殖需要两个信号的共同参与，与国内外报道[7～9]一致。仅有第一信号(CD3单抗)或第二信号(CD28单抗)均不能使淋巴细胞产生免疫应答。只有当T细胞接受了第一信号TCR/CD3复合物，并与抗原-MHC复合物结合后，又得到B7/CD28相互作用产生的共刺激信号，才能激活、增殖，产生免疫应答。共刺激相互转导的机制尚待研究。
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从第一信号和第二信号刺激的时间先后来看，在先接受CD3单抗作用后的淋巴细胞，在20h内能得到第二信号(CD28单抗)的共刺激，其增殖反应将保持在较高水平，如果第二信号的刺激超过40h，则T细胞增殖将降低。这表明两个信号之间的传递是有时间程序的。T细胞的激活过程包括一系列的细胞生理生化反应。T细胞上的TCR与其配体结合后，抗原信息经CD3转导至细胞内。通过G蛋白的调节作用活化磷酸酯酶C，进而水解磷酯酰肌醇磷酸，由此产生的酯酰甘油(DAG)和肌醇磷酸(IP3)作为第二信使可激发两个平行而协调的信使链。IP3促使胞内钙离子浓度增加，进而使蛋白质磷酸化。DAG活化蛋白激酶C(PKC)，从而使诸多蛋白质磷酸化，信号依次得到转导[10，11]。如果这时细胞表面存在B7，则B7与CD28相互作用产生刺激信号，使细胞激活。如无B7表达，则CD4+ T细胞无能力应答抗原的刺激。
我们的实验结果还显示，丝裂原和低剂量辐射能增强CD3单抗的刺激效应，加快细胞内信号转导。这与刘树铮等[12]的结果类似。但丝裂原和低剂量辐射与CD28共同作用，不能使淋巴细胞产生增殖效应。表明T细胞双信号转导还受其它一些因素的影响，对此有待进一步研究。
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周建华,博士研究生
苏燎原,导师
童建,导师
参考文献
1，Schwartz R.A cell culture model for T lymphocyte clonal anergy.Science,1990,248∶1349
2，Rudd CE,Janssen O,Cai Y.Two-step TCR/CD3-CD4 and CD28 signaling in T cells:SH2/SH3 domains,protein-tyrosine and lipidkinases.J Immunol,1994,225∶234
3，GuinanEJ,Griccen V,Boussiotis G,et al.Pivotal role of the B7:CD28 pathy in transplation tolerance and tumor immunity.Blood,1994,84∶3261
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4，Bluestone J.New perspectives of CD28-B7-mediaed T cell costimulation.Immunity,1995,2∶555
5，Walker LSK,Maleod JD,Boulougouris G,et al.Down-re-gulation of CD28 via Fas(CD95):influence of CD28 on T-cell apoptosis.Immunol,1998,94∶41
6，苏燎原，杜泽吉，刘克良，等.应用脂多糖激活人血B淋巴细胞亚群功能的研究.免疫学杂志，1996，12(4)∶247
7，王顺友，孙 雨，马宝骊.抗CD3、CD28单抗对T淋巴细胞共刺激作用的影响因素.上海免疫学杂志，1999，19(4)∶229
8，Abe R,Vandenberghe P,Craighead N,et al.Distinct sibnal transduction in mouse CD4+ and CD8+ splenic T cells after CD28 receptor ligation.J Immunol,1995,154∶985
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9，Sansom DM,Wilson A ,Boshell M,et al.B7/CD28 but not LFA-3/CD2 interactions can provide thirdparty costimulation for human T-cell activation.Immunol,1993,80∶242
10，Ward SG,June CH,Olive D.PI 3-kinase:a pivotal pathway in T-cell activation?Immunol Today,1996,17∶187
11，Szamel M,Appel A,Schwinzer R,et al.Different protein kinase C isoenzymes regulate IL-2 receptor expression or IL-2 synthesis in human lymphocytes stimulated via the TCR.J Immunol,1998,160∶2207
12，刘树铮，苏 旭，张迎春.小剂量X射线全身照射后淋巴细胞TCR/CD3表达和Ca2+的变化。辐射研究与辐射工艺学报，1994，12∶61
收稿：2000-02-24, http://www.100md.com