应用SoftLinkTM Soft Release Avidin树脂亲和层析纯化融合IL-16蛋白
作者：曹廷兵 甘立霞
单位：曹廷兵(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，重庆 400038)；甘立霞(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，重庆 400038)
关键词：IL-16；融合蛋白；表达与纯化
第三军医大学学报000728 提 要： 目的 分离、纯化大肠杆菌中表达的融合IL-16蛋白。方法 采用SoftLinkTM Soft Release Avidin Resin亲合树酯分离、纯化由大肠杆菌产生的生物素化融合IL-16蛋白。结果 融合IL-16蛋白成功地在该系统中被分离、纯化，每升细菌培养物可获得1.4 mg重组融合蛋白。纯化蛋白经SDS-PAGE和毛细管电泳检测均为1条蛋白质带。结论 此系统纯化IL-16融合蛋白操作方便、快捷，所得蛋白纯度和产率高。
中图法分类号： R392.11 文献标识码： B
, 百拇医药
文章编号：1000-5404(2000)07-0703-02
Purification of fusion IL-16 by SoftLinkTM Soft Release Avidin Resin affinity chromatograph
白细胞介素-16(Interleukin-16，IL-16)是近年来报道的一个新的细胞因子，其C端130个氨基酸的分泌型IL-16广泛地参与了体内的免疫调节及炎症反应，并且具有抑制HIV复制等多种功能[1，2]。SoftLinkTM Soft Release Avidin Resin纯化系统是专为生物素化的原核表达系统PinpointTM Xa载体而设计的。本系统是利用生物素与亲和素结合原理纯化生物素化的蛋白质。生物素和亲和素结合迅速，洗脱时采用游离生物素竞争取代以解离被Avidin吸咐的生物素化融合蛋白，洗脱条件温和，不需在变性条件下进行。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 主要试剂 PinpointTM Xa融合表达系统及纯化系统购自美国Promega公司。
1.2 IL-16 cDNA在融合表达载体PinpointTM Xa上的克隆
将含IL-16的重组质粒PEGM-3ZF(+)-IL-16及PinpontTM Xa表达载体按融合表达的要求进行酶切、连接、转化、鉴定等按常规方法进行[3，4]。
1.3 IL-16融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化
挑取克隆质粒PinpointTM Xa-IL-16于含100 μg/ml AP, 200 μmol/L生物素的20 ml LB液中，37 ℃振荡过夜培养，第2天按2%的比例以相同条件转接于1.5 L的LB液中，培养至D600≈0.6～0.8时，加入100 μmol/L IPTG诱导表达4 h，诱导完毕置于4 ℃冷却20 min后，8 000×g离心10 min，4 ℃，离心收菌。
, http://www.100md.com
按每克湿菌体10 ml加入50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6～8.0)50 mmol/L NaCl和5%甘油的细菌裂解液，以下操作均在冰浴或4 ℃冷柜中进行。悬浮细菌后加入1 mg/ml溶菌酶，搅拌20 min后加入10% Triton X-100至终浓度为0.1%，继续搅拌5 min，此时溶液变粘稠，然后加入DNase Ⅰ粉末少许，再搅拌10 min，直至粘稠完全消失。然后把上述溶液10 000×g 4 ℃离心15 min，取上清于灭菌的烧杯中，置冰浴准备上柱纯化。加上述样品于预处理和再生的5 ml PinpointTM Xa亲和层析柱上，以0.5 ml/min流速进行上样。上样完毕后以5倍柱体积裂解缓冲液洗柱，直至记录仪指针回到基线，然后用含5 mmol/L生物素的裂解缓冲液洗脱，当1/2柱体积洗脱液进入柱子后，关闭流出阀，让生物素充分交换出生物素化的融合IL-16蛋白，15 min后，再进行正常洗脱，洗脱流速仍为0.5 ml/min，以每管1 ml收集洗脱峰。
2 结果
, 百拇医药
2.1 亲和层析纯化产物的SDS-PAGE鉴定
收集上述亲和层析洗脱峰流出液，每管1ml，分别取3管收集液进行15% SDS-PAGE电泳。用考马斯亮蓝G-250染色后，可见在33×103处出现了与预期相符的重组蛋白分子量完全相同的蛋白带[4～6]，见图1。
2.2 重组蛋白免疫印迹
用羊抗人IL-16的多抗对融合IL-16进行免疫学鉴定，图2为Western印迹结果，可以看出重组蛋白体中的确有能与抗IL-16抗体反应的融合蛋白带(33×103位置)，而在PinpointTM Xa的对照质粒中的相应位置则没有特异性的抗原抗体复合物条带出现[4]。
2.3 重组蛋白的纯度检测
, http://www.100md.com
取15 μg亲和层析纯化产物，进行毛细管电泳检测其纯度，电泳结果，只有一个蛋白峰出现，见图3。
图1 亲和纯化的融合IL-16蛋白15% SDS-PAGE电泳图谱
1：标准蛋白分子量；2～4:收集洗脱峰的3个部份
图2 融合IL-16蛋白的Western blotting分析
1：产生4×104生物素化的融合蛋白的对照质粒；2：产生3.3×104特异生物素化的融合IL-16蛋白的PinpointTM Xa-IL-16质粒；3：产生22.5×103内源性蛋白的宿主菌JM109；4：标准蛋白分子量
, 百拇医药
图3 亲和纯化融合IL-16蛋白毛细管电泳图谱
3 讨论
在蛋白质的纯化过程中，最容易出现的问题就是蛋白质被水解和失去生物活性，我们在纯化过程中也遇到细菌裂解不好以及蛋白被水解等问题，经过反复摸索，我们较好地解决了采用该纯化系统时应注意的问题，并积累了一些有益的经验。在用Soft LinkTM Soft Release Avidin亲和树酯分离、纯化重组IL-16时我们认为下述3个方面的问题应特别注意：①温度问题，在整个操作过程中，从离心收集菌体开始，一定要在冰浴或4°C冷柜中进行，否则蛋白被水解后得率明显降低。②蛋白抑制剂问题，在裂解细菌时，不宜加苯甲磺酰氟(PMSF)和EDTA，若在细菌裂解前加入了PMSF，则溶菌酶不能有效发挥裂解细菌的作用，若在细菌裂解时加入了EDTA，虽有一定的抑制蛋白水解酶作用，但对后续DNase Ⅰ的作用有较大的影响。所以整个操作过程一定要在冰浴或4°C冷柜中进行，蛋白是不会被水解和失去生物活性的。③溶液的pH值，裂解菌体时，溶液的pH值不能低于pH 7.5，溶菌酶发挥作用要求在pH 8.0以上，因此pH在7.5～8.0比较合适。
, 百拇医药
我室经过几年的研究，已得到了重组IL-16蛋白，这为今后IL-16蛋白活性和功能的研究打下了坚实的基础。
基金项目：全军“九五”医药卫生基金资助项目(99-6-3)及重庆市攻关项目
作者简介：曹廷兵(1968-)，男，重庆市璧山县人，实验师，主要从事真核基因表达调控方面的研究。电话：(023)68752261
参考文献：
[1] Baier M, Werner A, Bannert N, et al. HIV suppression by interleukin-16[J]. Nature,1995,378(6 557):563.
[2] Center D M, Kornfeld H, Cruikshank W W. Interleukin 16 and its function as a CD4 ligand[J]. Immunology Today,1996,17(10):476-481.
, 百拇医药
[3] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning:A labo-ratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.26-28.
[4] 甘立霞，曹廷兵，钟小林.IL-16C端cDNA的克隆表达及初步鉴定[J].中国生物化学与分子生物学报，1999，15(4)：530-536.
[5] Zhang Y, Center D M, Wu D M, et al. Processing and activation of pro-interleukin 16 by caspase-3[J]. J Biol Chem,1998,273(2):1 144-1 149.
[6] Krautwald S. IL-16 activates the SAPK signaling pathway in CD+4 Macrophages[J]. J Immunol,1998,160(12):5 874-5 879.
收稿日期：1999-11-01；修回日期：2000-03-03, http://www.100md.com
单位：曹廷兵(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，重庆 400038)；甘立霞(第三军医大学基础医学部生物化学与分子生物学教研室，重庆 400038)
关键词：IL-16；融合蛋白；表达与纯化
第三军医大学学报000728 提 要： 目的 分离、纯化大肠杆菌中表达的融合IL-16蛋白。方法 采用SoftLinkTM Soft Release Avidin Resin亲合树酯分离、纯化由大肠杆菌产生的生物素化融合IL-16蛋白。结果 融合IL-16蛋白成功地在该系统中被分离、纯化，每升细菌培养物可获得1.4 mg重组融合蛋白。纯化蛋白经SDS-PAGE和毛细管电泳检测均为1条蛋白质带。结论 此系统纯化IL-16融合蛋白操作方便、快捷，所得蛋白纯度和产率高。
中图法分类号： R392.11 文献标识码： B
, 百拇医药
文章编号：1000-5404(2000)07-0703-02
Purification of fusion IL-16 by SoftLinkTM Soft Release Avidin Resin affinity chromatograph
白细胞介素-16(Interleukin-16，IL-16)是近年来报道的一个新的细胞因子，其C端130个氨基酸的分泌型IL-16广泛地参与了体内的免疫调节及炎症反应，并且具有抑制HIV复制等多种功能[1，2]。SoftLinkTM Soft Release Avidin Resin纯化系统是专为生物素化的原核表达系统PinpointTM Xa载体而设计的。本系统是利用生物素与亲和素结合原理纯化生物素化的蛋白质。生物素和亲和素结合迅速，洗脱时采用游离生物素竞争取代以解离被Avidin吸咐的生物素化融合蛋白，洗脱条件温和，不需在变性条件下进行。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 主要试剂 PinpointTM Xa融合表达系统及纯化系统购自美国Promega公司。
1.2 IL-16 cDNA在融合表达载体PinpointTM Xa上的克隆
将含IL-16的重组质粒PEGM-3ZF(+)-IL-16及PinpontTM Xa表达载体按融合表达的要求进行酶切、连接、转化、鉴定等按常规方法进行[3，4]。
1.3 IL-16融合蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化
挑取克隆质粒PinpointTM Xa-IL-16于含100 μg/ml AP, 200 μmol/L生物素的20 ml LB液中，37 ℃振荡过夜培养，第2天按2%的比例以相同条件转接于1.5 L的LB液中，培养至D600≈0.6～0.8时，加入100 μmol/L IPTG诱导表达4 h，诱导完毕置于4 ℃冷却20 min后，8 000×g离心10 min，4 ℃，离心收菌。
, http://www.100md.com
按每克湿菌体10 ml加入50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.6～8.0)50 mmol/L NaCl和5%甘油的细菌裂解液，以下操作均在冰浴或4 ℃冷柜中进行。悬浮细菌后加入1 mg/ml溶菌酶，搅拌20 min后加入10% Triton X-100至终浓度为0.1%，继续搅拌5 min，此时溶液变粘稠，然后加入DNase Ⅰ粉末少许，再搅拌10 min，直至粘稠完全消失。然后把上述溶液10 000×g 4 ℃离心15 min，取上清于灭菌的烧杯中，置冰浴准备上柱纯化。加上述样品于预处理和再生的5 ml PinpointTM Xa亲和层析柱上，以0.5 ml/min流速进行上样。上样完毕后以5倍柱体积裂解缓冲液洗柱，直至记录仪指针回到基线，然后用含5 mmol/L生物素的裂解缓冲液洗脱，当1/2柱体积洗脱液进入柱子后，关闭流出阀，让生物素充分交换出生物素化的融合IL-16蛋白，15 min后，再进行正常洗脱，洗脱流速仍为0.5 ml/min，以每管1 ml收集洗脱峰。
2 结果
, 百拇医药
2.1 亲和层析纯化产物的SDS-PAGE鉴定
收集上述亲和层析洗脱峰流出液，每管1ml，分别取3管收集液进行15% SDS-PAGE电泳。用考马斯亮蓝G-250染色后，可见在33×103处出现了与预期相符的重组蛋白分子量完全相同的蛋白带[4～6]，见图1。
2.2 重组蛋白免疫印迹
用羊抗人IL-16的多抗对融合IL-16进行免疫学鉴定，图2为Western印迹结果，可以看出重组蛋白体中的确有能与抗IL-16抗体反应的融合蛋白带(33×103位置)，而在PinpointTM Xa的对照质粒中的相应位置则没有特异性的抗原抗体复合物条带出现[4]。
2.3 重组蛋白的纯度检测
, http://www.100md.com
取15 μg亲和层析纯化产物，进行毛细管电泳检测其纯度，电泳结果，只有一个蛋白峰出现，见图3。
图1 亲和纯化的融合IL-16蛋白15% SDS-PAGE电泳图谱
1：标准蛋白分子量；2～4:收集洗脱峰的3个部份
图2 融合IL-16蛋白的Western blotting分析
1：产生4×104生物素化的融合蛋白的对照质粒；2：产生3.3×104特异生物素化的融合IL-16蛋白的PinpointTM Xa-IL-16质粒；3：产生22.5×103内源性蛋白的宿主菌JM109；4：标准蛋白分子量
, 百拇医药
图3 亲和纯化融合IL-16蛋白毛细管电泳图谱
3 讨论
在蛋白质的纯化过程中，最容易出现的问题就是蛋白质被水解和失去生物活性，我们在纯化过程中也遇到细菌裂解不好以及蛋白被水解等问题，经过反复摸索，我们较好地解决了采用该纯化系统时应注意的问题，并积累了一些有益的经验。在用Soft LinkTM Soft Release Avidin亲和树酯分离、纯化重组IL-16时我们认为下述3个方面的问题应特别注意：①温度问题，在整个操作过程中，从离心收集菌体开始，一定要在冰浴或4°C冷柜中进行，否则蛋白被水解后得率明显降低。②蛋白抑制剂问题，在裂解细菌时，不宜加苯甲磺酰氟(PMSF)和EDTA，若在细菌裂解前加入了PMSF，则溶菌酶不能有效发挥裂解细菌的作用，若在细菌裂解时加入了EDTA，虽有一定的抑制蛋白水解酶作用，但对后续DNase Ⅰ的作用有较大的影响。所以整个操作过程一定要在冰浴或4°C冷柜中进行，蛋白是不会被水解和失去生物活性的。③溶液的pH值，裂解菌体时，溶液的pH值不能低于pH 7.5，溶菌酶发挥作用要求在pH 8.0以上，因此pH在7.5～8.0比较合适。
, 百拇医药
我室经过几年的研究，已得到了重组IL-16蛋白，这为今后IL-16蛋白活性和功能的研究打下了坚实的基础。
基金项目：全军“九五”医药卫生基金资助项目(99-6-3)及重庆市攻关项目
作者简介：曹廷兵(1968-)，男，重庆市璧山县人，实验师，主要从事真核基因表达调控方面的研究。电话：(023)68752261
参考文献：
[1] Baier M, Werner A, Bannert N, et al. HIV suppression by interleukin-16[J]. Nature,1995,378(6 557):563.
[2] Center D M, Kornfeld H, Cruikshank W W. Interleukin 16 and its function as a CD4 ligand[J]. Immunology Today,1996,17(10):476-481.
, 百拇医药
[3] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning:A labo-ratory manual[M]. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989.26-28.
[4] 甘立霞，曹廷兵，钟小林.IL-16C端cDNA的克隆表达及初步鉴定[J].中国生物化学与分子生物学报，1999，15(4)：530-536.
[5] Zhang Y, Center D M, Wu D M, et al. Processing and activation of pro-interleukin 16 by caspase-3[J]. J Biol Chem,1998,273(2):1 144-1 149.
[6] Krautwald S. IL-16 activates the SAPK signaling pathway in CD+4 Macrophages[J]. J Immunol,1998,160(12):5 874-5 879.
收稿日期：1999-11-01；修回日期：2000-03-03, http://www.100md.com