模拟失重对成骨样细胞细胞周期变化的影响
模拟失重对成骨样细胞细胞周期变化的影响
张晓铀 汪恭质 丁柏 李莹辉 谭映军
摘要 目的：探讨空间骨丢失的机理，研究模拟失重时人成骨样细胞细胞周期的变化。方法： 利用回转器模拟失重，观察测定了成骨样细胞增殖、周期的变化及其恢复作用和中药三花接骨散对细胞周期的影响。结果： 模拟失重作用后，成骨细胞增殖受到明显抑制，G1期细胞显著增多，S与G2+M期细胞显著减少。模拟失重12 h后再经12 h以上正常生长，细胞周期可恢复至对照水平。三花接骨散能促进G1期细胞减少，S与G2+M期细胞增多，具有对抗失重效应，促进成骨细胞增殖的功效。结论：模拟失重抑制成骨样细胞增殖，抑制细胞G1期向S期的转化；模拟失重作用后细胞周期有一定的恢复作用；药物可以刺激细胞周期对抗模拟失重的效应。
, http://www.100md.com
关键词：骨丢失 模拟失重 回转器 成骨细胞 细胞周期
在长期载人航天飞行中，航天员所面临的一个重要问题就是骨质脱钙。对于失重条件下骨质脱钙的机理，主要是从骨形成和骨吸收的两个方面考虑。从目前飞行及地面实验结果看，倾向于认为骨形成受到抑制是其主要原因，特别是成骨细胞数目的减少和活性的降低[1,2]。我们实验室也发现在模拟失重状态下成骨细胞的增殖活性受到了抑制。因此，阐述成骨细胞在失重条件下的结构和功能的变化就成为航天医学的一个重要任务。本实验利用水平式回转
器模拟失重[3,4]，研究了OS-732细胞增殖及其周期的变化，以进一步阐明空间骨丢失的机理。
材料与方法
一、材料与模型制作与分组
, 百拇医药
人成骨样细胞(OS-732)，由积水潭医院提供。接种OS-732细胞30瓶(20 ml)，密度2×105/瓶，加入5 ml 1640培养基(含8%灭活小牛血清，100 U/ml的双抗，5%碳酸氢钠，调pH至7.0～7.2)。12 h后，瓶中灌满培养基后，将其随机分为两组，每组各15瓶。一组放置在回转器(MG3型，生物物理所研制，转速30 r/min,37℃)中培养，另一组正常生长作为对照。
二、方法
1.细胞生长曲线：模拟失重作用后取细胞，用pH 7.0磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)清洗,2.5%戊二醛固定30 min以上,PBS清洗后，1%亚甲基兰染色10 min,用pH 8.4 酮酸缓冲液漂洗,0.01 mol/L盐酸溶液洗30 min,723型分光光度计比色测定，波长662 nm[5]。
, 百拇医药 2.细胞周期的测定：分别在模拟失重6 h、12 h、24 h、36 h和48 h后，两组各取3瓶细胞，以0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)消化后离心收集细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml，悬于0.1 ml PBS中迅速注入1 ml 70%冷乙醇后，放在4℃冰箱中保存至少24 h。测定时，将细胞离心(1 500 r/min，5 min)收集，用PBS清洗两次后悬细胞于0.5 ml PBS中，加入核糖核酸酶(ribonuclease, RNase) A(10 mg/ml)20 μl，37℃水浴孵育30 min，立即放入冰浴，中止RNase的作用。加入PI(50 μg/ml)染色，在流式细胞仪(美国Becton-Dickison公司，FACS-440型)上进行细胞周期测定，以氩离子激光器作激发光源，输出功率200 mW，激发波长488 nm，荧光测量用585滤片。
3.细胞周期的恢复作用：模拟失重作用细胞6 h、12 h、24 h和36 h后，将细胞放置于静止状态继续培养12 h，观察细胞周期的恢复情况。
, 百拇医药
4.三花接骨散对细胞周期的作用：在细胞培养液中加入100 μg/ml的三花接骨散，观察细胞周期的变化。
结果
一、模拟失重对细胞增殖的影响
经统计分析，6 h后，模拟失重组细胞增殖就有低于正常对照组的趋势，但尚不显著；作用24 h后，就显著低于对照组(P<0.01)；作用更长时间后，始终显著低于对照组(P<0.01)，见表1。
二、模拟失重对细胞周期的影响
经统计分析，模拟失重6 h后，G1期细胞比对照组显著增多(P<0.01)，而S期与G2+M期细胞比对照组显著减少(P<0.05)。随着作用时间的增加，对照组G1期细胞呈持续下降趋势，而模拟失重下G1期细胞的变化趋势不是很明显，但始终显著高于对照组(P<0.01)，而S与G2+M期细胞一直显著低于对照组(P<0.01)，见表2。
, 百拇医药
三、模拟失重作用后细胞周期的恢复
统计分析结果表明，在模拟失重作用6 h后，再经12 h的恢复生长, 细胞周期中G1与S期仍保持模拟失重效应，即G1期细胞多于对照组，S期细胞少于对照组(P<0.01)，而G2+M期已恢复至对照水平；在模拟失重作用12 h后，再经12 h的恢复生长，细胞周期各时相即基本恢复至对照水平;当模拟失重作用更长时间后，经12 h的恢复生长，细胞周期仍保持模拟失重效应，见表3。
四、中药三花接骨散对细胞周期的影响
表1 模拟失重作用下成骨样细胞的增殖(x±s)
组别 Group
6 h
, 百拇医药 12 h
24 h
36 h
48 h
对照组 Control group
0.799±0.073
0.820±0.089
1.043±0.018
1.820±0.124
2.612±0.180
回转组 Rotating group
0.779±0.092
, http://www.100md.com
0.809±0.066
0.742±0.088**
1.647±0.185**
2.282±0.430**
*P<0.05，**P<0.01
表2 模拟失重作用下的成骨样细胞周期(%)
组别 Group
时相 Phase of cell cycle
6 h
12 h
, http://www.100md.com
24 h
36 h
48 h
对照组 Control group
G1
54.4
50.2
48.5
48.1
44.0
S
40.5
23.6
, 百拇医药
16.5
25.7
29.2
G2+M
5.1
44.2
35.0
26.2
26.8
回转组 Rotating group
G1
61.8**
, http://www.100md.com
56.9**
59.6**
57.9**
67.6**
S
34.9**
11.0**
13.1**
25.4**
9.0**
, 百拇医药
G2+M
3.4**
34.1**
27.3**
25.4**
23.5**
**P<0.01表3 模拟失重作用后细胞周期的恢复结果(%)
组别 Group
时相 Phase of cell cycle
6 h
, 百拇医药
12 h
24 h
36 h
对照组 Control group
G1
42.3
45.9
53.4
48.1
S
29.9
31.2
31.0
, 百拇医药
29.2
G2+M
27.8
22.9
15.6
22.7
回转组 Rotating group
G1
53.2**
43.4
56.0*
57.9**
, 百拇医药
S
19.2**
34.3
14.3**
25.4**
G2+M
27.6
22.3
29.7**
16.6**
*P<0.05,**P<0.01
, 百拇医药
经统计分析，24 h内三花接骨散对细胞周期无明显影响，回转加药组仍呈现明显的失重效应，G1期增多，S期减少(P<0.01)；36 h后，正常加药组可见G1期细胞减少，而S期与G2+M期细胞增多(P<0.01)，与模拟失重对细胞周期的影响完全相反，回转加药组细胞周期中G1期细胞也显著减少，S期与G2+M期细胞则基本恢复至对照水平，呈现与单纯模拟失重效应相反的变化，见表4。
表4 三花接骨散作用下的成骨样细胞周期(%)
组别
Group
时 相
Phase of
cell cycle
, 百拇医药
12 h
24 h
36 h
正常对照组
G1
37.6
41.2
54.6
Normal control
S
37.0
22.3
24.6
, 百拇医药
group
G2+M
25.4
36.5
20.8
正常加药组
G1
37.9
42.1
48.8**
Sanhua
S
, 百拇医药
30.5**
24.8
26.7
group
G2+M
31.6**
32.9*
24.5*
回转加药组
G1
43.5**
, 百拇医药
44.1*
54.1
Sanhua+rotating
S
32.8**
17.8**
25.0
group
G2+M
23.7
38.1
20.9
, http://www.100md.com
*P<0.05,**P<0.01
讨论
从结果可见，在模拟失重下成骨细胞增殖受到抑制，G1期细胞显著增多，最多可比对照组增加55%，而S期细胞则显著减少，相应地，G2+M期的细胞也明显少于对照组。因此，我们推测在模拟失重下，成骨细胞细胞周期的正常转化受到一定的影响，使一部分细胞停滞在G1期，延迟了向S期的转化，使S期细胞的数目始终呈下降趋势，并进一步导致细胞延迟进入G2+M期，具体则表现为细胞的增殖受到了抑制，这一点同空间失重实验中成骨细胞数目减少的现象是一致的。而陈雅等[6]研究回转器对鸡胚脑细胞细胞周期时相的影响时也发现，旋转后的脑细胞S期比例明显较少，而G1期细胞也是明显增多。由此我们认为，在微重力环境下细胞周期直接受到微重力的作用发生改变，由于S期是DNA合成的关键时期，因此微重力抑制细胞从G1期进入S期，就会导致细胞的增殖能力下降，这可能是造成空间骨丢失的一个重要原因。
, 百拇医药
模拟失重后的细胞周期具有恢复功能，提示我们，航天员在航天飞行中可采用人工重力场的办法来改善骨丢失的状况。但是这一恢复作用与模拟失重作用与恢复时间的长短有关，说明细胞自身的恢复能力是有限的。我们前期工作已发现三花接骨散具有促进成骨细胞增殖的功效，本实验进一步发现它对细胞周期的作用在于能促进细胞G1期向S期的转化，表明它具有对抗失重效应的功效，这不仅可运用于航天飞行的医学防护领域，对骨质疏松症等临床医学问题也具有一定的应用价值，需要我们继续深入研究。
作者单位：张晓铀(100094 北京，航天医学工程研究所)
汪恭质(100094 北京，航天医学工程研究所)
丁 柏(100094 北京，航天医学工程研究所)
李莹辉 谭映军(100094 北京，航天医学工程研究所)
, 百拇医药
参考文献
1 Vico LD，Chappard S，Palle AV，et al. Trabecular bone remodeling after seven days of weightlessness exposure(BIOCOSMOS 1667).Am J Physiol，1998，255(24):R243-247.
2 Wronski TJ, Morey ER，Holton SB. Effects of spaceflight on periosteal bone formation in rats.Am J Physiol，1983，244(13): R305-309.
3 江丕栋，傅世密，郑克.在地面进行微重力生物学实验模拟用的回转器.生物化学与生物物理进展，1990，17(7)：14.
4 Cogoti T, Mariaune L, Zurich E. The fast rotating clinostat-a history of its use in gravitational biology and a comparison of ground-based and flight experiment results. ASGSB Bulletin，1992，5(2)：59-67.
5 Genty G,Palle S,Vanelle L,et al.Colorimetric evalution of cultured osteoblast-like cells(ROS 17/2.8) Biotech Histochem,1994,69(2):160-164.
6 陈雅，沈宏略，于文斗，等.回转器旋转对不同发育阶段的鸡胚脑细胞周期时相分布的医学.生物物理学报，1997，13(1)：107-109., 百拇医药
张晓铀 汪恭质 丁柏 李莹辉 谭映军
摘要 目的：探讨空间骨丢失的机理，研究模拟失重时人成骨样细胞细胞周期的变化。方法： 利用回转器模拟失重，观察测定了成骨样细胞增殖、周期的变化及其恢复作用和中药三花接骨散对细胞周期的影响。结果： 模拟失重作用后，成骨细胞增殖受到明显抑制，G1期细胞显著增多，S与G2+M期细胞显著减少。模拟失重12 h后再经12 h以上正常生长，细胞周期可恢复至对照水平。三花接骨散能促进G1期细胞减少，S与G2+M期细胞增多，具有对抗失重效应，促进成骨细胞增殖的功效。结论：模拟失重抑制成骨样细胞增殖，抑制细胞G1期向S期的转化；模拟失重作用后细胞周期有一定的恢复作用；药物可以刺激细胞周期对抗模拟失重的效应。
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关键词：骨丢失 模拟失重 回转器 成骨细胞 细胞周期
在长期载人航天飞行中，航天员所面临的一个重要问题就是骨质脱钙。对于失重条件下骨质脱钙的机理，主要是从骨形成和骨吸收的两个方面考虑。从目前飞行及地面实验结果看，倾向于认为骨形成受到抑制是其主要原因，特别是成骨细胞数目的减少和活性的降低[1,2]。我们实验室也发现在模拟失重状态下成骨细胞的增殖活性受到了抑制。因此，阐述成骨细胞在失重条件下的结构和功能的变化就成为航天医学的一个重要任务。本实验利用水平式回转
器模拟失重[3,4]，研究了OS-732细胞增殖及其周期的变化，以进一步阐明空间骨丢失的机理。
材料与方法
一、材料与模型制作与分组
, 百拇医药
人成骨样细胞(OS-732)，由积水潭医院提供。接种OS-732细胞30瓶(20 ml)，密度2×105/瓶，加入5 ml 1640培养基(含8%灭活小牛血清，100 U/ml的双抗，5%碳酸氢钠，调pH至7.0～7.2)。12 h后，瓶中灌满培养基后，将其随机分为两组，每组各15瓶。一组放置在回转器(MG3型，生物物理所研制，转速30 r/min,37℃)中培养，另一组正常生长作为对照。
二、方法
1.细胞生长曲线：模拟失重作用后取细胞，用pH 7.0磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)清洗,2.5%戊二醛固定30 min以上,PBS清洗后，1%亚甲基兰染色10 min,用pH 8.4 酮酸缓冲液漂洗,0.01 mol/L盐酸溶液洗30 min,723型分光光度计比色测定，波长662 nm[5]。
, 百拇医药 2.细胞周期的测定：分别在模拟失重6 h、12 h、24 h、36 h和48 h后，两组各取3瓶细胞，以0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)消化后离心收集细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml，悬于0.1 ml PBS中迅速注入1 ml 70%冷乙醇后，放在4℃冰箱中保存至少24 h。测定时，将细胞离心(1 500 r/min，5 min)收集，用PBS清洗两次后悬细胞于0.5 ml PBS中，加入核糖核酸酶(ribonuclease, RNase) A(10 mg/ml)20 μl，37℃水浴孵育30 min，立即放入冰浴，中止RNase的作用。加入PI(50 μg/ml)染色，在流式细胞仪(美国Becton-Dickison公司，FACS-440型)上进行细胞周期测定，以氩离子激光器作激发光源，输出功率200 mW，激发波长488 nm，荧光测量用585滤片。
3.细胞周期的恢复作用：模拟失重作用细胞6 h、12 h、24 h和36 h后，将细胞放置于静止状态继续培养12 h，观察细胞周期的恢复情况。
, 百拇医药
4.三花接骨散对细胞周期的作用：在细胞培养液中加入100 μg/ml的三花接骨散，观察细胞周期的变化。
结果
一、模拟失重对细胞增殖的影响
经统计分析，6 h后，模拟失重组细胞增殖就有低于正常对照组的趋势，但尚不显著；作用24 h后，就显著低于对照组(P<0.01)；作用更长时间后，始终显著低于对照组(P<0.01)，见表1。
二、模拟失重对细胞周期的影响
经统计分析，模拟失重6 h后，G1期细胞比对照组显著增多(P<0.01)，而S期与G2+M期细胞比对照组显著减少(P<0.05)。随着作用时间的增加，对照组G1期细胞呈持续下降趋势，而模拟失重下G1期细胞的变化趋势不是很明显，但始终显著高于对照组(P<0.01)，而S与G2+M期细胞一直显著低于对照组(P<0.01)，见表2。
, 百拇医药
三、模拟失重作用后细胞周期的恢复
统计分析结果表明，在模拟失重作用6 h后，再经12 h的恢复生长, 细胞周期中G1与S期仍保持模拟失重效应，即G1期细胞多于对照组，S期细胞少于对照组(P<0.01)，而G2+M期已恢复至对照水平；在模拟失重作用12 h后，再经12 h的恢复生长，细胞周期各时相即基本恢复至对照水平;当模拟失重作用更长时间后，经12 h的恢复生长，细胞周期仍保持模拟失重效应，见表3。
四、中药三花接骨散对细胞周期的影响
表1 模拟失重作用下成骨样细胞的增殖(x±s)
组别 Group
6 h
, 百拇医药 12 h
24 h
36 h
48 h
对照组 Control group
0.799±0.073
0.820±0.089
1.043±0.018
1.820±0.124
2.612±0.180
回转组 Rotating group
0.779±0.092
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0.809±0.066
0.742±0.088**
1.647±0.185**
2.282±0.430**
*P<0.05，**P<0.01
表2 模拟失重作用下的成骨样细胞周期(%)
组别 Group
时相 Phase of cell cycle
6 h
12 h
, http://www.100md.com
24 h
36 h
48 h
对照组 Control group
G1
54.4
50.2
48.5
48.1
44.0
S
40.5
23.6
, 百拇医药
16.5
25.7
29.2
G2+M
5.1
44.2
35.0
26.2
26.8
回转组 Rotating group
G1
61.8**
, http://www.100md.com
56.9**
59.6**
57.9**
67.6**
S
34.9**
11.0**
13.1**
25.4**
9.0**
, 百拇医药
G2+M
3.4**
34.1**
27.3**
25.4**
23.5**
**P<0.01表3 模拟失重作用后细胞周期的恢复结果(%)
组别 Group
时相 Phase of cell cycle
6 h
, 百拇医药
12 h
24 h
36 h
对照组 Control group
G1
42.3
45.9
53.4
48.1
S
29.9
31.2
31.0
, 百拇医药
29.2
G2+M
27.8
22.9
15.6
22.7
回转组 Rotating group
G1
53.2**
43.4
56.0*
57.9**
, 百拇医药
S
19.2**
34.3
14.3**
25.4**
G2+M
27.6
22.3
29.7**
16.6**
*P<0.05,**P<0.01
, 百拇医药
经统计分析，24 h内三花接骨散对细胞周期无明显影响，回转加药组仍呈现明显的失重效应，G1期增多，S期减少(P<0.01)；36 h后，正常加药组可见G1期细胞减少，而S期与G2+M期细胞增多(P<0.01)，与模拟失重对细胞周期的影响完全相反，回转加药组细胞周期中G1期细胞也显著减少，S期与G2+M期细胞则基本恢复至对照水平，呈现与单纯模拟失重效应相反的变化，见表4。
表4 三花接骨散作用下的成骨样细胞周期(%)
组别
Group
时 相
Phase of
cell cycle
, 百拇医药
12 h
24 h
36 h
正常对照组
G1
37.6
41.2
54.6
Normal control
S
37.0
22.3
24.6
, 百拇医药
group
G2+M
25.4
36.5
20.8
正常加药组
G1
37.9
42.1
48.8**
Sanhua
S
, 百拇医药
30.5**
24.8
26.7
group
G2+M
31.6**
32.9*
24.5*
回转加药组
G1
43.5**
, 百拇医药
44.1*
54.1
Sanhua+rotating
S
32.8**
17.8**
25.0
group
G2+M
23.7
38.1
20.9
, http://www.100md.com
*P<0.05,**P<0.01
讨论
从结果可见，在模拟失重下成骨细胞增殖受到抑制，G1期细胞显著增多，最多可比对照组增加55%，而S期细胞则显著减少，相应地，G2+M期的细胞也明显少于对照组。因此，我们推测在模拟失重下，成骨细胞细胞周期的正常转化受到一定的影响，使一部分细胞停滞在G1期，延迟了向S期的转化，使S期细胞的数目始终呈下降趋势，并进一步导致细胞延迟进入G2+M期，具体则表现为细胞的增殖受到了抑制，这一点同空间失重实验中成骨细胞数目减少的现象是一致的。而陈雅等[6]研究回转器对鸡胚脑细胞细胞周期时相的影响时也发现，旋转后的脑细胞S期比例明显较少，而G1期细胞也是明显增多。由此我们认为，在微重力环境下细胞周期直接受到微重力的作用发生改变，由于S期是DNA合成的关键时期，因此微重力抑制细胞从G1期进入S期，就会导致细胞的增殖能力下降，这可能是造成空间骨丢失的一个重要原因。
, 百拇医药
模拟失重后的细胞周期具有恢复功能，提示我们，航天员在航天飞行中可采用人工重力场的办法来改善骨丢失的状况。但是这一恢复作用与模拟失重作用与恢复时间的长短有关，说明细胞自身的恢复能力是有限的。我们前期工作已发现三花接骨散具有促进成骨细胞增殖的功效，本实验进一步发现它对细胞周期的作用在于能促进细胞G1期向S期的转化，表明它具有对抗失重效应的功效，这不仅可运用于航天飞行的医学防护领域，对骨质疏松症等临床医学问题也具有一定的应用价值，需要我们继续深入研究。
作者单位：张晓铀(100094 北京，航天医学工程研究所)
汪恭质(100094 北京，航天医学工程研究所)
丁 柏(100094 北京，航天医学工程研究所)
李莹辉 谭映军(100094 北京，航天医学工程研究所)
, 百拇医药
参考文献
1 Vico LD，Chappard S，Palle AV，et al. Trabecular bone remodeling after seven days of weightlessness exposure(BIOCOSMOS 1667).Am J Physiol，1998，255(24):R243-247.
2 Wronski TJ, Morey ER，Holton SB. Effects of spaceflight on periosteal bone formation in rats.Am J Physiol，1983，244(13): R305-309.
3 江丕栋，傅世密，郑克.在地面进行微重力生物学实验模拟用的回转器.生物化学与生物物理进展，1990，17(7)：14.
4 Cogoti T, Mariaune L, Zurich E. The fast rotating clinostat-a history of its use in gravitational biology and a comparison of ground-based and flight experiment results. ASGSB Bulletin，1992，5(2)：59-67.
5 Genty G,Palle S,Vanelle L,et al.Colorimetric evalution of cultured osteoblast-like cells(ROS 17/2.8) Biotech Histochem,1994,69(2):160-164.
6 陈雅，沈宏略，于文斗，等.回转器旋转对不同发育阶段的鸡胚脑细胞周期时相分布的医学.生物物理学报，1997，13(1)：107-109., 百拇医药