FⅫa受抑稀释凝血活酶试验反映凝血过程的研究
贺石林 熊石龙 贺蓉 何晓凡 刘发益 汉建忠 李俊成
摘要 目的：建立反映两阶段凝血过程的筛选试验。方法：在抑制FⅫa活性的条件下，观察不同凝血活酶浓度对不同的血浆凝固时间的影响。FⅩa活性测定采用生色底物法。结果 ①在凝血活酶浓度较高(1∶1，1∶10)时，混合正常血浆与乏FⅪ血浆的FⅫa受抑稀释凝血活酶时间(FⅫai DTT)接近；在凝血活酶浓度较低[(1∶100)～(1∶4000)]时，FⅫai DTT顺序为乏FⅧ与乏FⅨ血浆>乏FⅪ血浆>混合正常血浆。②以免疫法消耗FⅪ引起FⅫai DTT延长，向乏FⅪ血浆加入FⅪ导致FⅫai DTT缩短。③在FⅫai DTT试验的不同时间(10～80s)以水蛭素阻断α凝血酶越早，FⅩa生成量越少；在相同条件下，FⅩa生成量顺序为富血小板血浆>乏血小板血浆>乏FⅪ血浆。结论：①研究结果支持凝血过程两阶段假说，并证实FⅪ与血小板在放大阶段中的重要作用。②FⅫai DTT作为反映凝血过程的筛选试验也许是可行的。
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关键词：血液凝固 血液凝固因子 血小板
经典凝血假说认为凝血机制存在两个启动过程[1]。接触激活FⅫ启动内在途径，表达或释放组织因子(tissue factor,TF)启动外在途径。两条途径的汇合点在FⅩa形成。鉴于现在检查凝血过程的试验基本都是根据两个启动途径设计的，通常以激活的部分凝血活酶时间(APTT)反映内在途径启动的凝血过程，以凝血酶原时间(PT)反映外在途径启动的凝血过程。迄今，缺乏包含两个阶段凝血过程的试验，并且FⅪ作为两阶段衔接点也未在凝血全过程中得到直接证明。我们在本研究中探索在抑制FⅫa的基础上，以稀释凝血活酶时间作为反映两阶段凝血全过程的试验，并观察FⅪ和血小板在此试验模式中的作用。
材料和方法
1 血浆制备 采用7名健康成人的枸橼酸钠抗凝全血，经500r/min离心10min后取上层液，即富血小板血浆(PRP)；取等量抗凝全血经4000r/min离心30min后，其上清液即乏血小板血浆(PPP)。另取20名健康成人的枸橼酸钠抗凝全血，以同样条件制备PPP，然后各自取等量混合即成混合正常血浆。整个制备过程中均使用塑料管。各种血浆分装后贮于-70℃待用。
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2 主要试剂 兔脑凝血活酶来自中国医学科学院血液学研究所。乏FⅪ血浆来自George King Biomedical公司;抗人FⅪ的单克隆抗体来自Sigma公司。FⅩa生色底物S2222来自Diagnostica公司。玉米胰蛋白酶抑制物(CTI)来自Enzyme Research Lab公司。乏FⅧ、乏FⅨ人血浆与水蛭素均来自Sigma公司。纯化的FⅪ来自Haematologic Technologies公司。
3 测定方法 APTT与PT试验按李家增等主编的《血液实验学》介绍的方法[2]进行。
FⅫa受抑稀释凝血活酶时间(FⅫai DTT):将兔脑凝血活酶以盐水作不同浓度稀释[(1∶10)～(1∶4000)]。作FⅫai DTT前，向待测血浆中加入CTI以抑制FⅫa活性[3]。进行FⅫai DTT时，取100μl待测血浆，向其中加入不同稀释度的凝血活酶溶液100μl，混匀后置于37℃水浴中2min，在加入预先温育的25mmol/L CaCl2 100μl后，立即记录凝固时间。
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FⅩa生成量：以盐水将FⅩa生色底物S2222配制成12.5mmol/L。在FⅫai DTT试验的不同时间(10～80s)以EDTA中止凝血反应，再向试验溶液中加入S2222 10μl后10min，于酶标仪405nm处读取吸光度(A405)值。由于A405与FⅩa生成量成正比，故以A405代表FⅩa生成量。
4 统计学处理 量-效关系进行相关与回归分析。凝固时间与FⅩa生成量的比较进行方差分析(F检验)，若F>F0.05，则两两进行q检验比较。
结果
1 乏FⅪ、乏FⅧ与乏FⅨ血浆促凝活性的鉴定 将混合正常血浆以盐水稀释至1∶1，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160。以APTT作指标，通过双对数化建立标准曲线。以未加稀释混合正常血浆(即1∶1)的促凝活性为100%，结果乏FⅪ、乏FⅧ和乏FⅨ血浆的APTT均显著延长(P<0.001)，表明三者均存在明显的内在途径凝血障碍。由标准曲线推知乏FⅪ、乏FⅧ和乏FⅨ血浆的促凝活性分别相当于混合正常血浆的0.76%，0.64%和0.70%。
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2 CTI对不同凝血试验的影响 以混合正常血浆为底物，采用不同含量CTI(终浓度0～100mg/L)分别进行APTT、PT和稀释凝血活酶时间(DTT)试验，结果见表1。
表1 CTI对不同凝血试验凝血时间的影响(x±s)
CTI(mg/L)
n
APTT
PT
DTT
0
5
45.5±2.0
13.8±0.5
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79.0±3.8
20
5
90.4±2.2
14.2±0.3
80.8±3.6
50
5
116.8±2.8
14.5±6.4
80.0±4.0
100
5
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120.4±3.0
14.6±0.4
81.4±4.6
注：DTT的操作方法与PT相同，但凝血活酶浓度为1∶1000
由表1可知CTI对APTT具有明显的抑制作用，并有剂量浓度依赖关系(r=0.960,P<0.05)。然而CTI三个不同浓度对PT和DTT均无明显的影响(P>0.20)，因此可以认为CTI能够特异性抑制接触激活的促凝活性。
3 FⅫai DTT试验 在CTI(终浓度为50mg/L)抑制FⅫa活性时，采用不同稀释度[(1∶1)～(1∶4000)]的兔脑凝血活酶，在相同钙离子浓度(25mmol/L)条件下，观察混合正常血浆与乏FⅪ血浆的凝固时间，结果见表2。
表2 不同浓度凝血活酶对不同血浆凝固时间的影响(x±s)
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凝血活酶稀释度
n
混合正常血浆
乏FⅪ血浆
1∶1
12.0
13.5x
1∶10
2
26.0
29.0
1∶100
2
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75.0
115.0
1∶1000
2
97.0
168.0
1∶2000
2
121.0
215.0
1∶4000
2
143.0
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261.0
r值
0.984
0.986
P值
<0.01
<0.01
由表2可知，在FⅫa受到抑制时，无论混合正常血浆或乏FⅪ血浆，随着凝血活酶稀释度增大，血浆凝固时间均明显延长。在凝血活酶浓度较高条件下(1∶1，1∶10)，乏FⅪ血浆与混合正常血浆的凝固时间接近，当凝血活酶液稀释度达到1∶100以后，乏FⅪ血浆的凝固时间较混合正常血浆显著延长(P<0.01)。考虑临床实验室应用的时间效率因素，以1∶1000稀释度进行FⅫai DTT测定为宜。
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本研究中采用凝血活酶稀释度1∶1000，观察到乏FⅧ血浆与乏FⅨ血浆的FⅫai DTT均大于300s。因此可以认为FⅫai DTT试验不仅对启动阶段(组织因子途径)，而且对放大阶段(“截短”的内在途径)的凝血障碍是敏感的。
4 FⅪ在FⅫai DTT试验中的作用
4.1 血浆FⅪ消耗试验：将不同含量抗人FⅪ单克隆抗体加入100μl混合正常血浆中中和FⅪ，并用盐水调节各组体积使其相等，仍以凝血活酶稀释度为1∶1000的FⅫai DTT为指标，结果加入抗人FⅪ单克隆抗体0，1，10，100μg，FⅫai DTT分别为(86.8±4.5)，(108.0±5.2)，(121.6±5.6)，(150.2±5.4)s，表明加入抗人FⅪ单克隆抗体量愈多，FⅫai DTT越长，两者呈正相关(r=0.916,P<0.05)。由此可知，FⅪ减少可造成FⅫai DTT明显延长，提示FⅫai DTT试验可以反映反应体系中FⅪ含量的改变。
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4.2 FⅪ加入试验：以乏FⅪ人血浆为底物，加入不同含量纯化的人FⅪ，亦以盐水调节各组体积使之相等，以FⅪai DTT(凝血活酶浓度1∶1000)为指标。结果加入FⅪ终浓度为0，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00μg/L时，FⅫai DTT分别为(260.8±5.6)，(203.2±5.0)，(175.4±5.4)，(137.6±6.0)，(115.4±5.8)，(87.2±5.0)s，表明向乏FⅪ血浆加入FⅪ的量越大，FⅫai DTT缩短越显著，两者呈负相关(r=-0.900,P<0.05)。当加入FⅪ的量接近正常生理浓度(4mg/L)时，其FⅫai DTT与混合正常血浆的相应值接近(P>0.5)，从而进一步证实FⅪ在FⅫai DTT试验中的确占有重要地位。
5 凝血酶在FⅫai DTT试验早期对FⅩa生成的影响 以混合正常血浆为底物，利用水蛭素对α凝血酶的选择性抑制特性，于FⅫai DTT试验的不同反应时间(10～80s)加入水蛭素(10U/ml)，于100s时以EDTA中止反应，然后采用生色底物法测定FⅩa生成量，结果见表3。 表3 在FⅫai DTT试验中不同时间加入水蛭素对FⅩa生成的影响(x±s)
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水蛭素加入时间(s)
n
FⅩa生成量
抑制率(%)
10
5
0.054±0.006
39.1
20
5
0.086±0.008
62.3
40
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5
0.106±0.006
76.8
80
5
0.120±0.005
87.0
未加入
5
0.138±0.006
100.0
由表3可知，在FⅫai DTT试验中加入水蛭素各组的FⅩa生成量均明显低于未加水蛭素组，且加入越早，FⅩa生成量越少(r=0.987,P<0.01)。因此可以认为组织因子途径启动早期生成的凝血酶在反馈放大FⅩa生成中起着重要作用。
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6 血小板和FⅪ对FⅫai DTT试验中FⅩa生成量的影响 在FⅫai DTT试验进行80s时，以水蛭素(终浓度10U/ml)阻断α凝血酶，然后让试验在不同反应条件中继续作用3min,再以EDTA中止反应，同样以生色底物法测定FⅩa生成量，结果见表4。显示在水蛭素存在时，PRP的FⅩa生成量较PPP显著增高(P<0.01)，这表明血小板在FⅫai DTT试验中具有促进FⅩa生成作用，但与乏FⅪ血浆相比，PPP的FⅩa生成量明显为高(P<0.05)，进一步支持FⅪ在FⅫai DTT试验凝血反应反馈放大中起重要作用。 表4 血小板与FⅪ在FⅫai DTT试验中对FⅩa生成的影响(x±s)
反应条件
n
FⅩa生成量
水蛭素+PRP
7
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0.142±0.014
水蛭素+PPP
7
0.116±0.014
水蛭素+乏FⅪ血浆
3
0.093±0.007
讨 论 我们研究发现，在FⅫa活性被抑制的条件下，当凝血活酶浓度较高(1∶1，1∶10)时，混合正常血浆与乏FⅪ血浆的FⅫai DTT是接近的，说明在这种条件下，凝血过程的完成无需FⅪ参与。此时大量组织因子通过FⅦa/TF对FⅩ的激活，其促凝活性超过组织因子途径抑制物(TFPI)与抗凝血酶FⅢ的抗凝活性，纵使没有FⅨ与FⅧ参与也能在短时间内生成足量凝血酶，很快完成凝血过程。临床广泛应用的PT试验基本就是如此。近年来使用超大剂量重组人FⅦa防治血友病A与血友病B的出血倾向，也是利用这一原理。当凝血活酶高度稀释[(1∶100)～(1∶4000)]时，乏FⅪ血浆较混合正常血浆的FⅫai DTT显著延长。向乏FⅪ血浆加入FⅪ，导致FⅫai DTT剂量依赖性缩短；当加入FⅪ达到生理浓度时，FⅫai DTT非常接近混合正常血浆。反之，以免疫消耗方法降低混合正常血浆中FⅪ，引起FⅫai DTT剂量依赖性延长。这些事实表明在稀释的凝血活酶条件下，凝血过程需要FⅪ参与。这可能是由于少量的FⅦa/TF和FⅩa较快地被TFPI及抗凝血酶Ⅲ抑制，仅能生成微量凝血酶，需要通过激活FⅪ的内在途径进行放大，才能生成足量凝血酶而完成凝血过程，即在组织因子较少的情况下，FⅪ是凝血过程两阶段的重要衔接点之一。在生理性止血与大多数血栓形成中，局部组织因子浓度并不高，凝血过程需要数分钟甚至更长时间，可能类似FⅫai DTT试验这种情况。因此可以认为FⅫai DTT是一个能够反映两阶段凝血过程的试验模式。我们在本研究中观察到乏FⅪ血浆、乏FⅧ血浆和乏FⅨ血浆可以引起FⅫai DTT显著延长，从而提示以FⅫai DTT作为检查常见的凝血机制缺陷的过筛试验是可行的。至于乏FⅧ血浆和乏FⅨ血浆的FⅫai DTT延长程度远远大于FⅪ血浆，这可能与FⅦa/TF和FⅪa放大生成FⅩa均须通过激活FⅨ和FⅧ有关。
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本研究的实验结果与Mann实验室的报道[4，5]基本一致。应当认为凝血过程两阶段假说是正确的，放大阶段是通过多反馈反应完成的；在TF低浓度条件下，FⅪ激活是其中重要环节之一。新近报道，给人注入小剂量内毒素可导致凝血系统激活，此时未发现接触蛋白激活，但出现FⅪ激活[6]。由此可见，FⅪ亦参与内毒素血症时凝血系统的活化。
文献报道，凝血酶除反馈地激活血小板、FⅧ与FⅤ外，还可激活FⅪ[7，8]。实验证明水蛭素可以特异性抑制α凝血酶[9，10]。我们在本研究中观察到水蛭素能显著地降低FⅫai DTT试验中FⅩa生成量，这可能与它抑制了α凝血酶对血小板、FⅧ和FⅪ的激活有关。鉴于本实验中观察到水蛭素加入越早，FⅩa生成越少，因此可以推断早期生成的微量凝血酶在反馈放大FⅩa和凝血酶生成过程中具有重要意义。晚近报道凝血酶激活FⅪ引起大量凝血酶形成，不仅是完成凝血过程的前提，而且也是抑制纤溶的需要，因为凝血酶与凝血酶调节蛋白结合，还可激活凝血酶活化的纤溶抑制物(thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor, TAFI)[11-13]。
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我们在使用水蛭素阻断α凝血酶作用后，观察到在FⅫai DTT试验中PRP较PPP的FⅩa生成量明显为多，其原因是多方面的。首先，活化血小板提供带负电荷磷脂表面(即PF3可利用性)，这对增强活化的维生素K依赖因子(FⅨa、FⅩa、FⅦa和凝血酶原)的适宜装配和催化反应是十分重要的。其次，新近Baglia等[14]与Oliver等[15]证明在凝血酶原和Ca2+存在的条件下，活化的血小板也为凝血酶激活FⅪ提供催化表面。此外，在无磷脂条件下，中间凝血酶与α凝血酶对FⅪ均有激活作用,但在带负电荷磷脂(PS/PE/PC)存在条件下，只有中间凝血酶对FⅪ具有较强的激活作用[16]，且中间凝血酶较α凝血酶被抗凝血酶Ⅲ灭活为慢[17]。因此PRP较PPP在试验中FⅩa生成为多，也可能与中间凝血酶的生物特性有关。另外，依赖于磷脂存在的其它正反馈因素(如FⅩa对FⅨ和FⅧ的活化)在凝血反应中也有重要作用。
, http://www.100md.com 在这里我们强调的是，在低浓度TF条件下凝血过程的两阶段假说是正确的，并且在放大阶段中FⅪ起着重要作用，这也是我们设计FⅫai DTT的基本思路。应当指出，本研究是在体外进行的，在临床是否可以较好地作为凝血机制缺陷的过筛试验若可作为过筛试验，它的最佳试验条件组合如何这些问题均尚待进一步研究。
志谢：承李家增教授提出指导性意见，曹兆丰、李安国博士提供部分试剂，一并致谢
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39830180)
作者单位：贺石林(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
熊石龙(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
何晓凡(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
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刘发益(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
汉建忠(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
李俊成(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
贺 蓉(美国纽约州立大学)
参考文献
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摘要 目的：建立反映两阶段凝血过程的筛选试验。方法：在抑制FⅫa活性的条件下，观察不同凝血活酶浓度对不同的血浆凝固时间的影响。FⅩa活性测定采用生色底物法。结果 ①在凝血活酶浓度较高(1∶1，1∶10)时，混合正常血浆与乏FⅪ血浆的FⅫa受抑稀释凝血活酶时间(FⅫai DTT)接近；在凝血活酶浓度较低[(1∶100)～(1∶4000)]时，FⅫai DTT顺序为乏FⅧ与乏FⅨ血浆>乏FⅪ血浆>混合正常血浆。②以免疫法消耗FⅪ引起FⅫai DTT延长，向乏FⅪ血浆加入FⅪ导致FⅫai DTT缩短。③在FⅫai DTT试验的不同时间(10～80s)以水蛭素阻断α凝血酶越早，FⅩa生成量越少；在相同条件下，FⅩa生成量顺序为富血小板血浆>乏血小板血浆>乏FⅪ血浆。结论：①研究结果支持凝血过程两阶段假说，并证实FⅪ与血小板在放大阶段中的重要作用。②FⅫai DTT作为反映凝血过程的筛选试验也许是可行的。
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关键词：血液凝固 血液凝固因子 血小板
经典凝血假说认为凝血机制存在两个启动过程[1]。接触激活FⅫ启动内在途径，表达或释放组织因子(tissue factor,TF)启动外在途径。两条途径的汇合点在FⅩa形成。鉴于现在检查凝血过程的试验基本都是根据两个启动途径设计的，通常以激活的部分凝血活酶时间(APTT)反映内在途径启动的凝血过程，以凝血酶原时间(PT)反映外在途径启动的凝血过程。迄今，缺乏包含两个阶段凝血过程的试验，并且FⅪ作为两阶段衔接点也未在凝血全过程中得到直接证明。我们在本研究中探索在抑制FⅫa的基础上，以稀释凝血活酶时间作为反映两阶段凝血全过程的试验，并观察FⅪ和血小板在此试验模式中的作用。
材料和方法
1 血浆制备 采用7名健康成人的枸橼酸钠抗凝全血，经500r/min离心10min后取上层液，即富血小板血浆(PRP)；取等量抗凝全血经4000r/min离心30min后，其上清液即乏血小板血浆(PPP)。另取20名健康成人的枸橼酸钠抗凝全血，以同样条件制备PPP，然后各自取等量混合即成混合正常血浆。整个制备过程中均使用塑料管。各种血浆分装后贮于-70℃待用。
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2 主要试剂 兔脑凝血活酶来自中国医学科学院血液学研究所。乏FⅪ血浆来自George King Biomedical公司;抗人FⅪ的单克隆抗体来自Sigma公司。FⅩa生色底物S2222来自Diagnostica公司。玉米胰蛋白酶抑制物(CTI)来自Enzyme Research Lab公司。乏FⅧ、乏FⅨ人血浆与水蛭素均来自Sigma公司。纯化的FⅪ来自Haematologic Technologies公司。
3 测定方法 APTT与PT试验按李家增等主编的《血液实验学》介绍的方法[2]进行。
FⅫa受抑稀释凝血活酶时间(FⅫai DTT):将兔脑凝血活酶以盐水作不同浓度稀释[(1∶10)～(1∶4000)]。作FⅫai DTT前，向待测血浆中加入CTI以抑制FⅫa活性[3]。进行FⅫai DTT时，取100μl待测血浆，向其中加入不同稀释度的凝血活酶溶液100μl，混匀后置于37℃水浴中2min，在加入预先温育的25mmol/L CaCl2 100μl后，立即记录凝固时间。
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FⅩa生成量：以盐水将FⅩa生色底物S2222配制成12.5mmol/L。在FⅫai DTT试验的不同时间(10～80s)以EDTA中止凝血反应，再向试验溶液中加入S2222 10μl后10min，于酶标仪405nm处读取吸光度(A405)值。由于A405与FⅩa生成量成正比，故以A405代表FⅩa生成量。
4 统计学处理 量-效关系进行相关与回归分析。凝固时间与FⅩa生成量的比较进行方差分析(F检验)，若F>F0.05，则两两进行q检验比较。
结果
1 乏FⅪ、乏FⅧ与乏FⅨ血浆促凝活性的鉴定 将混合正常血浆以盐水稀释至1∶1，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160。以APTT作指标，通过双对数化建立标准曲线。以未加稀释混合正常血浆(即1∶1)的促凝活性为100%，结果乏FⅪ、乏FⅧ和乏FⅨ血浆的APTT均显著延长(P<0.001)，表明三者均存在明显的内在途径凝血障碍。由标准曲线推知乏FⅪ、乏FⅧ和乏FⅨ血浆的促凝活性分别相当于混合正常血浆的0.76%，0.64%和0.70%。
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2 CTI对不同凝血试验的影响 以混合正常血浆为底物，采用不同含量CTI(终浓度0～100mg/L)分别进行APTT、PT和稀释凝血活酶时间(DTT)试验，结果见表1。
表1 CTI对不同凝血试验凝血时间的影响(x±s)
CTI(mg/L)
n
APTT
PT
DTT
0
5
45.5±2.0
13.8±0.5
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79.0±3.8
20
5
90.4±2.2
14.2±0.3
80.8±3.6
50
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116.8±2.8
14.5±6.4
80.0±4.0
100
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14.6±0.4
81.4±4.6
注：DTT的操作方法与PT相同，但凝血活酶浓度为1∶1000
由表1可知CTI对APTT具有明显的抑制作用，并有剂量浓度依赖关系(r=0.960,P<0.05)。然而CTI三个不同浓度对PT和DTT均无明显的影响(P>0.20)，因此可以认为CTI能够特异性抑制接触激活的促凝活性。
3 FⅫai DTT试验 在CTI(终浓度为50mg/L)抑制FⅫa活性时，采用不同稀释度[(1∶1)～(1∶4000)]的兔脑凝血活酶，在相同钙离子浓度(25mmol/L)条件下，观察混合正常血浆与乏FⅪ血浆的凝固时间，结果见表2。
表2 不同浓度凝血活酶对不同血浆凝固时间的影响(x±s)
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凝血活酶稀释度
n
混合正常血浆
乏FⅪ血浆
1∶1
12.0
13.5x
1∶10
2
26.0
29.0
1∶100
2
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75.0
115.0
1∶1000
2
97.0
168.0
1∶2000
2
121.0
215.0
1∶4000
2
143.0
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261.0
r值
0.984
0.986
P值
<0.01
<0.01
由表2可知，在FⅫa受到抑制时，无论混合正常血浆或乏FⅪ血浆，随着凝血活酶稀释度增大，血浆凝固时间均明显延长。在凝血活酶浓度较高条件下(1∶1，1∶10)，乏FⅪ血浆与混合正常血浆的凝固时间接近，当凝血活酶液稀释度达到1∶100以后，乏FⅪ血浆的凝固时间较混合正常血浆显著延长(P<0.01)。考虑临床实验室应用的时间效率因素，以1∶1000稀释度进行FⅫai DTT测定为宜。
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本研究中采用凝血活酶稀释度1∶1000，观察到乏FⅧ血浆与乏FⅨ血浆的FⅫai DTT均大于300s。因此可以认为FⅫai DTT试验不仅对启动阶段(组织因子途径)，而且对放大阶段(“截短”的内在途径)的凝血障碍是敏感的。
4 FⅪ在FⅫai DTT试验中的作用
4.1 血浆FⅪ消耗试验：将不同含量抗人FⅪ单克隆抗体加入100μl混合正常血浆中中和FⅪ，并用盐水调节各组体积使其相等，仍以凝血活酶稀释度为1∶1000的FⅫai DTT为指标，结果加入抗人FⅪ单克隆抗体0，1，10，100μg，FⅫai DTT分别为(86.8±4.5)，(108.0±5.2)，(121.6±5.6)，(150.2±5.4)s，表明加入抗人FⅪ单克隆抗体量愈多，FⅫai DTT越长，两者呈正相关(r=0.916,P<0.05)。由此可知，FⅪ减少可造成FⅫai DTT明显延长，提示FⅫai DTT试验可以反映反应体系中FⅪ含量的改变。
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4.2 FⅪ加入试验：以乏FⅪ人血浆为底物，加入不同含量纯化的人FⅪ，亦以盐水调节各组体积使之相等，以FⅪai DTT(凝血活酶浓度1∶1000)为指标。结果加入FⅪ终浓度为0，0.25，0.50，1.00，2.00，4.00μg/L时，FⅫai DTT分别为(260.8±5.6)，(203.2±5.0)，(175.4±5.4)，(137.6±6.0)，(115.4±5.8)，(87.2±5.0)s，表明向乏FⅪ血浆加入FⅪ的量越大，FⅫai DTT缩短越显著，两者呈负相关(r=-0.900,P<0.05)。当加入FⅪ的量接近正常生理浓度(4mg/L)时，其FⅫai DTT与混合正常血浆的相应值接近(P>0.5)，从而进一步证实FⅪ在FⅫai DTT试验中的确占有重要地位。
5 凝血酶在FⅫai DTT试验早期对FⅩa生成的影响 以混合正常血浆为底物，利用水蛭素对α凝血酶的选择性抑制特性，于FⅫai DTT试验的不同反应时间(10～80s)加入水蛭素(10U/ml)，于100s时以EDTA中止反应，然后采用生色底物法测定FⅩa生成量，结果见表3。 表3 在FⅫai DTT试验中不同时间加入水蛭素对FⅩa生成的影响(x±s)
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水蛭素加入时间(s)
n
FⅩa生成量
抑制率(%)
10
5
0.054±0.006
39.1
20
5
0.086±0.008
62.3
40
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5
0.106±0.006
76.8
80
5
0.120±0.005
87.0
未加入
5
0.138±0.006
100.0
由表3可知，在FⅫai DTT试验中加入水蛭素各组的FⅩa生成量均明显低于未加水蛭素组，且加入越早，FⅩa生成量越少(r=0.987,P<0.01)。因此可以认为组织因子途径启动早期生成的凝血酶在反馈放大FⅩa生成中起着重要作用。
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6 血小板和FⅪ对FⅫai DTT试验中FⅩa生成量的影响 在FⅫai DTT试验进行80s时，以水蛭素(终浓度10U/ml)阻断α凝血酶，然后让试验在不同反应条件中继续作用3min,再以EDTA中止反应，同样以生色底物法测定FⅩa生成量，结果见表4。显示在水蛭素存在时，PRP的FⅩa生成量较PPP显著增高(P<0.01)，这表明血小板在FⅫai DTT试验中具有促进FⅩa生成作用，但与乏FⅪ血浆相比，PPP的FⅩa生成量明显为高(P<0.05)，进一步支持FⅪ在FⅫai DTT试验凝血反应反馈放大中起重要作用。 表4 血小板与FⅪ在FⅫai DTT试验中对FⅩa生成的影响(x±s)
反应条件
n
FⅩa生成量
水蛭素+PRP
7
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0.142±0.014
水蛭素+PPP
7
0.116±0.014
水蛭素+乏FⅪ血浆
3
0.093±0.007
讨 论 我们研究发现，在FⅫa活性被抑制的条件下，当凝血活酶浓度较高(1∶1，1∶10)时，混合正常血浆与乏FⅪ血浆的FⅫai DTT是接近的，说明在这种条件下，凝血过程的完成无需FⅪ参与。此时大量组织因子通过FⅦa/TF对FⅩ的激活，其促凝活性超过组织因子途径抑制物(TFPI)与抗凝血酶FⅢ的抗凝活性，纵使没有FⅨ与FⅧ参与也能在短时间内生成足量凝血酶，很快完成凝血过程。临床广泛应用的PT试验基本就是如此。近年来使用超大剂量重组人FⅦa防治血友病A与血友病B的出血倾向，也是利用这一原理。当凝血活酶高度稀释[(1∶100)～(1∶4000)]时，乏FⅪ血浆较混合正常血浆的FⅫai DTT显著延长。向乏FⅪ血浆加入FⅪ，导致FⅫai DTT剂量依赖性缩短；当加入FⅪ达到生理浓度时，FⅫai DTT非常接近混合正常血浆。反之，以免疫消耗方法降低混合正常血浆中FⅪ，引起FⅫai DTT剂量依赖性延长。这些事实表明在稀释的凝血活酶条件下，凝血过程需要FⅪ参与。这可能是由于少量的FⅦa/TF和FⅩa较快地被TFPI及抗凝血酶Ⅲ抑制，仅能生成微量凝血酶，需要通过激活FⅪ的内在途径进行放大，才能生成足量凝血酶而完成凝血过程，即在组织因子较少的情况下，FⅪ是凝血过程两阶段的重要衔接点之一。在生理性止血与大多数血栓形成中，局部组织因子浓度并不高，凝血过程需要数分钟甚至更长时间，可能类似FⅫai DTT试验这种情况。因此可以认为FⅫai DTT是一个能够反映两阶段凝血过程的试验模式。我们在本研究中观察到乏FⅪ血浆、乏FⅧ血浆和乏FⅨ血浆可以引起FⅫai DTT显著延长，从而提示以FⅫai DTT作为检查常见的凝血机制缺陷的过筛试验是可行的。至于乏FⅧ血浆和乏FⅨ血浆的FⅫai DTT延长程度远远大于FⅪ血浆，这可能与FⅦa/TF和FⅪa放大生成FⅩa均须通过激活FⅨ和FⅧ有关。
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本研究的实验结果与Mann实验室的报道[4，5]基本一致。应当认为凝血过程两阶段假说是正确的，放大阶段是通过多反馈反应完成的；在TF低浓度条件下，FⅪ激活是其中重要环节之一。新近报道，给人注入小剂量内毒素可导致凝血系统激活，此时未发现接触蛋白激活，但出现FⅪ激活[6]。由此可见，FⅪ亦参与内毒素血症时凝血系统的活化。
文献报道，凝血酶除反馈地激活血小板、FⅧ与FⅤ外，还可激活FⅪ[7，8]。实验证明水蛭素可以特异性抑制α凝血酶[9，10]。我们在本研究中观察到水蛭素能显著地降低FⅫai DTT试验中FⅩa生成量，这可能与它抑制了α凝血酶对血小板、FⅧ和FⅪ的激活有关。鉴于本实验中观察到水蛭素加入越早，FⅩa生成越少，因此可以推断早期生成的微量凝血酶在反馈放大FⅩa和凝血酶生成过程中具有重要意义。晚近报道凝血酶激活FⅪ引起大量凝血酶形成，不仅是完成凝血过程的前提，而且也是抑制纤溶的需要，因为凝血酶与凝血酶调节蛋白结合，还可激活凝血酶活化的纤溶抑制物(thrombin-activatable fibrinolysis inhibitor, TAFI)[11-13]。
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我们在使用水蛭素阻断α凝血酶作用后，观察到在FⅫai DTT试验中PRP较PPP的FⅩa生成量明显为多，其原因是多方面的。首先，活化血小板提供带负电荷磷脂表面(即PF3可利用性)，这对增强活化的维生素K依赖因子(FⅨa、FⅩa、FⅦa和凝血酶原)的适宜装配和催化反应是十分重要的。其次，新近Baglia等[14]与Oliver等[15]证明在凝血酶原和Ca2+存在的条件下，活化的血小板也为凝血酶激活FⅪ提供催化表面。此外，在无磷脂条件下，中间凝血酶与α凝血酶对FⅪ均有激活作用,但在带负电荷磷脂(PS/PE/PC)存在条件下，只有中间凝血酶对FⅪ具有较强的激活作用[16]，且中间凝血酶较α凝血酶被抗凝血酶Ⅲ灭活为慢[17]。因此PRP较PPP在试验中FⅩa生成为多，也可能与中间凝血酶的生物特性有关。另外，依赖于磷脂存在的其它正反馈因素(如FⅩa对FⅨ和FⅧ的活化)在凝血反应中也有重要作用。
, http://www.100md.com 在这里我们强调的是，在低浓度TF条件下凝血过程的两阶段假说是正确的，并且在放大阶段中FⅪ起着重要作用，这也是我们设计FⅫai DTT的基本思路。应当指出，本研究是在体外进行的，在临床是否可以较好地作为凝血机制缺陷的过筛试验若可作为过筛试验，它的最佳试验条件组合如何这些问题均尚待进一步研究。
志谢：承李家增教授提出指导性意见，曹兆丰、李安国博士提供部分试剂，一并致谢
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39830180)
作者单位：贺石林(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
熊石龙(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
何晓凡(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
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刘发益(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
汉建忠(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
李俊成(410078 长沙，湖南医科大学止血生理实验室)
贺 蓉(美国纽约州立大学)
参考文献
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