血小板衍生生长因子对肝星状细胞基质分解素-1及其抑制因子基因表达的调节
及其抑制因子基因表达的调节
王爱民 王宝恩 江龙安 贾继东 韩涛 李培建
摘 要 目的 了解血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)基质分解素-1(stromelysin-1, MMP3)及金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP1)基因表达的影响。方法 在培养的肝星状细胞系中加入200 μg/L PDGF，于8、24、48、72 h共4个时间点收集细胞，提取总RNA；用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定基质分解素-1及TIMP1的基因表达水平。结果 PDGF组肝星状细胞基质分解素-1基因表达水平在8、24、48、72 h 4个时间点均明显高于对照组，48 h达高峰，为对照组的2.5倍。PDGF组肝星状细胞TIMP1的基因表达水平在24、48、72 h亦明显高于对照组，24 h达高峰，为对照组的2倍。结论 PDGF可增强肝星状细胞基质分解素-1及TIMP1基因的表达。
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关键词：血小板衍生生长因子 肝星状细胞 基质分解素-1 金属蛋白酶组织抑制因子-1 基因表达
血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是一种强有力的促有丝分裂剂，对肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)有很强的促增殖作用。肝星状细胞不仅是肝脏中产生细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的主要细胞，也是参与ECM降解代谢的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及其抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)的主要细胞来源。我们通过研究PDGF对肝星状细胞基质分解素-1(stromelysin-1, MMP3)及金属蛋白 酶 组 织 抑 制 因子-1(TIMP1)基因表达的影响，探讨PDGF在肝纤维化ECM降解代谢方面的作用，现报道如下。 材料与方法
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1.材料：(1)试剂：PDGF、DMEM培养基购自Sigma公司；总RNA提取试剂盒(total RNA isolation system)、鸟成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶、RNA酶抑制剂、Olig(dt)15 primers、嗜热水生菌DNA聚合酶(Taq酶)、PCR Marker、琼脂糖均为Promega公司产品。(2)仪器：美国SHEL-LAB CO2细胞培养箱；美国Idaho毛细管PCR仪；Kodak digital science system DC-40凝胶成像系统。(3)肝星状细胞系HSC-T6[1]：美国加利福尼亚旧金山总医院肝病中心实验室Friedman教授惠赠。
2.方法：(1)肝星状细胞培养：肝星状细胞系HSC-T6复苏后接种于塑料培养瓶中，用5%DMEM的培养液在CO2孵箱中培养。HSC-T6细胞将近长满培养瓶底时换用含PDGF(终浓度200 μg/L)的培养液，同时设空白对照组。PDGF组、对照组于8、24、48、72 h 4个时间点分别收集细胞，少量用于细胞计数及存活率检测，其余迅速投入液氮，此后转入-70 ℃保存。每组每个时间点均平行培养6瓶。(2)肝星状细胞总RNA提取、cDNA的合成、共扩增PCR及扩增产物定量分析：见参照文献[2，3]。
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3.统计学处理：结果以均数±标准差(X±s)表示，用单因素方差分析进行处理。
结 果
1.PDGF对肝星状细胞基质分解素-1基因表达的影响：由表1可见对照组HSC有MMP3基因表达，48 h达最高值。PDGF组肝星状细胞MMP3基因的表达水平在8、24、48、72 h 4个时间点都显著高于对照组，高峰在48 h，为对照组的2.5倍。
表1 PDGF对HSC-T6细胞MMP3基因表达的影响(X±s)
组别
8 h
24 h
48 h
, 百拇医药
72 h
对照组
1.13±0.26
1.36±0.37
2.02±0.23
1.71±0.43
PDGF组
2.03±0.34*
3.86±0.66* *
5.11±0.89* *
3.24±0.26*
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注：与对照组比较，*P<0.05，* *P<0.01
2.PDGF对HSC-T6细胞TIMP1基因表达的影响：由表2可见，对照组HSC-T6细胞有较高水平的TIMP1基因表达。PDGF组HSC-T6细胞TIMP1基因表达水平在8 h与对照组差异无显著性(P>0.05)，24 h达高峰，为对照组的2倍，并持续至48 h，72 h时较前期下降，但仍高于对照组。
表2 PDGF对HSC-T6细胞TIMP1基因表达的影响(X±s)
组别
8 h
24 h
, 百拇医药 48 h
72 h
对照组
1.98±0.36
3.01±0.26
3.96±0.43
2.95±0.34
PDGF组
2.18±0.35
6.33±1.03**
5.88±0.62**
4.03±0.36*
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注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01 讨 论
肝星状细胞是肝脏中的间质细胞之一，是参与ECM降解代谢的基质金属蛋白酶及其抑制因子的主要细胞来源[4]。血小板衍生生长因子可促进肝星状细胞的增殖，其作用与HSC上的PDGF受体有关。PDGF与其受体结合促进肝星状细胞增殖，对肝星状细胞合成分泌MMPs、TIMPs的影响目前报道较少。本实验旨在研究PDGF对肝星状细胞基质分解素-1及TIMP1基因表达的影响，结果表明PDGF组肝星状细胞基质分解素-1基因表达水平在8、24、48、72 h 4个时间点均明显高于对照组，48 h达高峰，为对照组的2.5倍。PDGF组肝星状细胞TIMP1的基因表达水平在24、48、72 h亦明显高于对照组，24 h达高峰，为对照组的2倍。上述结果提示PDGF对肝星状细胞MMP3、TIMP1的基因表达均有显著的促进作用。PDGF在肝纤维化的发生、发展中究竟作用如何，我们在本实验中仅是研究了它在基质降解代谢方面对MMP3及TIMP1基因表达的影响。关于PDGF对肝星状细胞间质胶原酶(MMP1)、IV型胶原酶(MMP2)的影响，PDGF对肝星状细胞各种ECM成分合成与分泌的影响，这些问题尚有待于进一步研究。
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PDGF增强肝星状细胞MMP3及TIMP1基因表达的机理目前尚不清楚，是否需原癌基因c-fos和c-jun的参与 还是与活化蛋白-1(activator protein-1, AP-1)和MMP3启动子上的AP-1位点及PEA-3位点(polyoma enhancer A-binding protein-3 site)结合有关[5，6] 这些问题尚在研究之中。
作者单位：王爱民(071000河北保定，解放军第252医院实验中心)
江龙安(071000河北保定，解放军第252医院实验中心)
李培建(071000河北保定，解放军第252医院实验中心)
王宝恩(北京友谊医院肝病研究中心)
, 百拇医药
贾继东(北京友谊医院肝病研究中心)
韩涛(北京友谊医院肝病研究中心)
参考文献
[1]Friedman SL, Lalazar A, Wong L, et al. HSC-T6 cells an immortalized rat hepatic stellate cell line. Hepatology, 1997,26:338-356.
[2]王爱民，王宝恩，杨跃伟，等.慢性肝病患者基质分解素-1基因表达的研究.中华医学杂志，1999，79：275-276.
[3]王爱民，王宝恩，杨跃伟，等.实验性肝纤维化金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达的动态变化.中华实验外科杂志，1998，15：352-353.
, http://www.100md.com
[4]Vyas SK, Leyland H, Gentry J, et al. Rat hepatic lipocytes synthesize and secrete transin in early primary culture. Gastroenterology, 1995,109:889-898.
[5]Matrision LM, Mc Donnell S, Miller DB, et al. The role of the matrix metalloproteinase stromelysin in the progression of squamous cell carcinomas. Am J Med Sci, 1991,302:157-162.
[6]Wasylyk C, Gutman A, Nicholson R, et al. The c-Ets oncoprotein activates the stromelysin promoter through the same elements as several non-nuclear oncoproteins. Embo J, 1991,10:1 127-1 134., 百拇医药
王爱民 王宝恩 江龙安 贾继东 韩涛 李培建
摘 要 目的 了解血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)基质分解素-1(stromelysin-1, MMP3)及金属蛋白酶组织抑制因子-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP1)基因表达的影响。方法 在培养的肝星状细胞系中加入200 μg/L PDGF，于8、24、48、72 h共4个时间点收集细胞，提取总RNA；用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定基质分解素-1及TIMP1的基因表达水平。结果 PDGF组肝星状细胞基质分解素-1基因表达水平在8、24、48、72 h 4个时间点均明显高于对照组，48 h达高峰，为对照组的2.5倍。PDGF组肝星状细胞TIMP1的基因表达水平在24、48、72 h亦明显高于对照组，24 h达高峰，为对照组的2倍。结论 PDGF可增强肝星状细胞基质分解素-1及TIMP1基因的表达。
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关键词：血小板衍生生长因子 肝星状细胞 基质分解素-1 金属蛋白酶组织抑制因子-1 基因表达
血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)是一种强有力的促有丝分裂剂，对肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)有很强的促增殖作用。肝星状细胞不仅是肝脏中产生细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的主要细胞，也是参与ECM降解代谢的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)及其抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs)的主要细胞来源。我们通过研究PDGF对肝星状细胞基质分解素-1(stromelysin-1, MMP3)及金属蛋白 酶 组 织 抑 制 因子-1(TIMP1)基因表达的影响，探讨PDGF在肝纤维化ECM降解代谢方面的作用，现报道如下。 材料与方法
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1.材料：(1)试剂：PDGF、DMEM培养基购自Sigma公司；总RNA提取试剂盒(total RNA isolation system)、鸟成髓细胞白血病病毒(AMV)逆转录酶、RNA酶抑制剂、Olig(dt)15 primers、嗜热水生菌DNA聚合酶(Taq酶)、PCR Marker、琼脂糖均为Promega公司产品。(2)仪器：美国SHEL-LAB CO2细胞培养箱；美国Idaho毛细管PCR仪；Kodak digital science system DC-40凝胶成像系统。(3)肝星状细胞系HSC-T6[1]：美国加利福尼亚旧金山总医院肝病中心实验室Friedman教授惠赠。
2.方法：(1)肝星状细胞培养：肝星状细胞系HSC-T6复苏后接种于塑料培养瓶中，用5%DMEM的培养液在CO2孵箱中培养。HSC-T6细胞将近长满培养瓶底时换用含PDGF(终浓度200 μg/L)的培养液，同时设空白对照组。PDGF组、对照组于8、24、48、72 h 4个时间点分别收集细胞，少量用于细胞计数及存活率检测，其余迅速投入液氮，此后转入-70 ℃保存。每组每个时间点均平行培养6瓶。(2)肝星状细胞总RNA提取、cDNA的合成、共扩增PCR及扩增产物定量分析：见参照文献[2，3]。
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3.统计学处理：结果以均数±标准差(X±s)表示，用单因素方差分析进行处理。
结 果
1.PDGF对肝星状细胞基质分解素-1基因表达的影响：由表1可见对照组HSC有MMP3基因表达，48 h达最高值。PDGF组肝星状细胞MMP3基因的表达水平在8、24、48、72 h 4个时间点都显著高于对照组，高峰在48 h，为对照组的2.5倍。
表1 PDGF对HSC-T6细胞MMP3基因表达的影响(X±s)
组别
8 h
24 h
48 h
, 百拇医药
72 h
对照组
1.13±0.26
1.36±0.37
2.02±0.23
1.71±0.43
PDGF组
2.03±0.34*
3.86±0.66* *
5.11±0.89* *
3.24±0.26*
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注：与对照组比较，*P<0.05，* *P<0.01
2.PDGF对HSC-T6细胞TIMP1基因表达的影响：由表2可见，对照组HSC-T6细胞有较高水平的TIMP1基因表达。PDGF组HSC-T6细胞TIMP1基因表达水平在8 h与对照组差异无显著性(P>0.05)，24 h达高峰，为对照组的2倍，并持续至48 h，72 h时较前期下降，但仍高于对照组。
表2 PDGF对HSC-T6细胞TIMP1基因表达的影响(X±s)
组别
8 h
24 h
, 百拇医药 48 h
72 h
对照组
1.98±0.36
3.01±0.26
3.96±0.43
2.95±0.34
PDGF组
2.18±0.35
6.33±1.03**
5.88±0.62**
4.03±0.36*
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注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01 讨 论
肝星状细胞是肝脏中的间质细胞之一，是参与ECM降解代谢的基质金属蛋白酶及其抑制因子的主要细胞来源[4]。血小板衍生生长因子可促进肝星状细胞的增殖，其作用与HSC上的PDGF受体有关。PDGF与其受体结合促进肝星状细胞增殖，对肝星状细胞合成分泌MMPs、TIMPs的影响目前报道较少。本实验旨在研究PDGF对肝星状细胞基质分解素-1及TIMP1基因表达的影响，结果表明PDGF组肝星状细胞基质分解素-1基因表达水平在8、24、48、72 h 4个时间点均明显高于对照组，48 h达高峰，为对照组的2.5倍。PDGF组肝星状细胞TIMP1的基因表达水平在24、48、72 h亦明显高于对照组，24 h达高峰，为对照组的2倍。上述结果提示PDGF对肝星状细胞MMP3、TIMP1的基因表达均有显著的促进作用。PDGF在肝纤维化的发生、发展中究竟作用如何，我们在本实验中仅是研究了它在基质降解代谢方面对MMP3及TIMP1基因表达的影响。关于PDGF对肝星状细胞间质胶原酶(MMP1)、IV型胶原酶(MMP2)的影响，PDGF对肝星状细胞各种ECM成分合成与分泌的影响，这些问题尚有待于进一步研究。
, http://www.100md.com
PDGF增强肝星状细胞MMP3及TIMP1基因表达的机理目前尚不清楚，是否需原癌基因c-fos和c-jun的参与 还是与活化蛋白-1(activator protein-1, AP-1)和MMP3启动子上的AP-1位点及PEA-3位点(polyoma enhancer A-binding protein-3 site)结合有关[5，6] 这些问题尚在研究之中。
作者单位：王爱民(071000河北保定，解放军第252医院实验中心)
江龙安(071000河北保定，解放军第252医院实验中心)
李培建(071000河北保定，解放军第252医院实验中心)
王宝恩(北京友谊医院肝病研究中心)
, 百拇医药
贾继东(北京友谊医院肝病研究中心)
韩涛(北京友谊医院肝病研究中心)
参考文献
[1]Friedman SL, Lalazar A, Wong L, et al. HSC-T6 cells an immortalized rat hepatic stellate cell line. Hepatology, 1997,26:338-356.
[2]王爱民，王宝恩，杨跃伟，等.慢性肝病患者基质分解素-1基因表达的研究.中华医学杂志，1999，79：275-276.
[3]王爱民，王宝恩，杨跃伟，等.实验性肝纤维化金属蛋白酶组织抑制因子-1基因表达的动态变化.中华实验外科杂志，1998，15：352-353.
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[4]Vyas SK, Leyland H, Gentry J, et al. Rat hepatic lipocytes synthesize and secrete transin in early primary culture. Gastroenterology, 1995,109:889-898.
[5]Matrision LM, Mc Donnell S, Miller DB, et al. The role of the matrix metalloproteinase stromelysin in the progression of squamous cell carcinomas. Am J Med Sci, 1991,302:157-162.
[6]Wasylyk C, Gutman A, Nicholson R, et al. The c-Ets oncoprotein activates the stromelysin promoter through the same elements as several non-nuclear oncoproteins. Embo J, 1991,10:1 127-1 134., 百拇医药