用PCR法直接快速筛查重组阳性克隆
胡维 向华 周艳 刘敬忠
摘 要：目的：应用PCR法快速筛查插入有苯丙氨酸脱氨酶(PAL)cDNA重组阳性克隆。方法：用于PCR扩增的引物是位于载体pET23b启动子处的T7启动子引物和位于目的基因PAL cDNA3′端终止密码TAA处的引物。以灭菌吸头挑一单菌落加入PCR体系扩增。结果：在筛查的3个克隆中，有2个阳性克隆，并且插入方向正确，经DNA序列测定得到进一步证实。结论：以PCR方法筛查重组阳性克隆，可以简便快速鉴定插入片段的大小和方向，不需提取质粒。
关键词：PCR 基因克隆 苯丙氨酸脱氨酶
基因重组实验中含有插入目的基因片段的重组阳性克隆的筛查，一般是使用标记探针的原位杂交法、Southern杂交法或酶切图谱法以及后来发展起来的聚合酶链反应(PCR)法[1]。后者具有快速、简便、准确，不需提取质粒DNA，不需操作放射同位素，而且可以同时确定插入片段方向等优点。我们将此方法用于苯丙氨酸脱氨酶(PAL)重组质粒的筛查，报导如下。
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1 材料与方法
1.1 目的基因 苯丙氨酸脱氨酶cDNA，本室应用RT—PCR技术从植物欧芹(Petroselinum crispum)总RNA扩增而得[2]，欧芹引种自北京农科院蔬菜研究所。
1.2 质粒、菌株 质粒为pET23b购自Novagen公司，含T7启动子；菌株：E.coli JM109 DE3购自Promega公司。
1.3 引物 T7 Promoter primer:5′ TAATACGACTCACTATAGGG 3′，位于载体pET23b的启动子处；P1：5′ TTAACAGATTGGAAGAGGAGC 3′，位于目的基因PAL cDNA3′端终止密码TAA处(由美国CyberSyn公司合成)。
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1.4 pET23b PAL 重组质粒的构建 将pET23b DNA 用 NdeⅠ 和Bam HI酶切，低熔点胶回收载体片段。PAL cDNA PCR 扩增产物的两端由于通过引物引入了单一酶切位点 NdeⅠ 和 BglⅡ，故经该二种内切酶酶切后，采用部分沉淀法[3]回收并纯化目的基因片段。将载体、目的基因片段按1∶3比例(摩尔比)在T4DNA连接酶反应体系中，于12℃温育8h，转化大肠杆菌JM109 DE3感受态细胞，用含氨苄青霉素的NZCYM培养基(Gibco BRL)37℃培养过夜。
1.5 PCR法筛查阳性克隆 20μl PCR体系含1×PCR缓冲液，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，T7启动子引物和引物P1各50ng，Taq DNA聚合酶1U。用20μl灭菌吸头挑一菌落(直径1mm)加至反应液中，轻轻吸打，5 000rpm离心5sec，加1滴石蜡油，95℃变性3min，然后94℃1min，52℃1min，72℃2min30sec，共进行25个循环，72℃延伸10min(PE480 PCR仪)。取5μl以0.8%琼脂糖电泳，在UVP凝胶成像分析仪(英国Life Science公司)下观察结果。
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1.6 DNA测序 经PCR筛查为阳性的克隆，培养200ml，以碱变性/PEG小量法提取质粒DNA作为序列测定的模板。测序引物为T7测序引物，用ABI373型自动测序仪测序，质粒DNA用量是1μg，采用Dye terminator法作测序反应[2]。
2 结 果
2.1 PCR法筛查阳性克隆 图1显示了用PCR法筛查PAL cDNA阳性克隆菌落的电泳照片，其中2号和3号出现2.2kb扩增条带，与PAL cDNA片段长度一致，因此这2个克隆即为含PAL cDNA插入片段的阳性克隆，并且其插入方向为启动子下游5′→3′，方向正确。
图1 PCR法筛查pET23bPAL克隆电泳结果
2.2 用DNA测序确证阳性克隆的正确性 以T7为测序引物，对用PCR法筛查到的阳性克隆cDNA5′端进行序列分析，在所测420bp中，发现二个碱基变异，引起CD83 CAG—GAG(Glu-Glu)和CD101 CAT-GGT(Asp-GLu)，与文献报导符合率99.5%。
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3 讨 论
筛查含目的基因的阳性克隆，通常要将转化的多个菌落转入新的培养基中培养过夜，分别提取质粒DNA，进一步酶切或杂交。Sathe等[3]将含重组质粒的细菌经过94℃变性1min，以倒置显微镜观察，发现大部分细胞破裂，释放出其DNA，因此可作为PCR的模板，而不需要作抽提、纯化质粒DNA。以菌落上少许菌体直接作PCR，可快速鉴定有无插入片段，只需3h～4h。由于引物T7位于载体pET23b的启动子上，P1位于目的基因PAL cDNA3′端终止密码TAA处，因此只有插入方向正确的PAL cDNA的克隆才能得到2.2kb扩增产物，即用PCR法可以鉴别重组片段插入方向是否符合作基因表达的要求。经PCR筛查的阳性克隆，对PAL进行序列测定，发现二个碱基变异，这应考虑到RT—PCR过程中的碱基错配，但对克隆化PAL cDNA的表达活性分析，证明有PAL酶活性[5]。
, 百拇医药 用PCR法筛查重组阳性克隆，直接、快速、方法简便、结果可靠，可用于重组分子的筛查，也可考虑应用到病原体的检查，以标本直接作PCR，不必提取DNA，为基础研究和临床诊断提供一个简便而有效的方法。
基金项目：北京自然科学基金资助
作者简介：胡维(1962～)，男，主管检验师，医学硕士，从事分子克隆与表达的研究。
作者单位：胡 维 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院，北京 100020
向 华 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院，北京 100020
周 艳 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院，北京 100020
刘敬忠 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院，北京 100020
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参考文献
[1]Gussow D and Clackson T.Direct clone characterization from plaques and colonies by polymerase chain reaction.Nucleic Acid Research,1989,17(10):4000.
[2]Applied Biosystems:373 DNA Sequencing System user′s Manual(June).Foster City,CA1994.
[3]刘敬忠，向华，张纪平，等.筛查基因突变的新技术-循环双脱氧指纹图谱法及其应用.高技术通讯，1996，6(1)：37～41.
[4]Sathe G M,Brien S O,McLaughlin M M,et al.Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells.Nucleic Acids Res,1991,19:4775.
[5]刘敬忠，向华，胡维，等.苯丙氨酸脱氨酶cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达.生物工程学报，1998，4(4)：384., 百拇医药
摘 要：目的：应用PCR法快速筛查插入有苯丙氨酸脱氨酶(PAL)cDNA重组阳性克隆。方法：用于PCR扩增的引物是位于载体pET23b启动子处的T7启动子引物和位于目的基因PAL cDNA3′端终止密码TAA处的引物。以灭菌吸头挑一单菌落加入PCR体系扩增。结果：在筛查的3个克隆中，有2个阳性克隆，并且插入方向正确，经DNA序列测定得到进一步证实。结论：以PCR方法筛查重组阳性克隆，可以简便快速鉴定插入片段的大小和方向，不需提取质粒。
关键词：PCR 基因克隆 苯丙氨酸脱氨酶
基因重组实验中含有插入目的基因片段的重组阳性克隆的筛查，一般是使用标记探针的原位杂交法、Southern杂交法或酶切图谱法以及后来发展起来的聚合酶链反应(PCR)法[1]。后者具有快速、简便、准确，不需提取质粒DNA，不需操作放射同位素，而且可以同时确定插入片段方向等优点。我们将此方法用于苯丙氨酸脱氨酶(PAL)重组质粒的筛查，报导如下。
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1.1 目的基因 苯丙氨酸脱氨酶cDNA，本室应用RT—PCR技术从植物欧芹(Petroselinum crispum)总RNA扩增而得[2]，欧芹引种自北京农科院蔬菜研究所。
1.2 质粒、菌株 质粒为pET23b购自Novagen公司，含T7启动子；菌株：E.coli JM109 DE3购自Promega公司。
1.3 引物 T7 Promoter primer:5′ TAATACGACTCACTATAGGG 3′，位于载体pET23b的启动子处；P1：5′ TTAACAGATTGGAAGAGGAGC 3′，位于目的基因PAL cDNA3′端终止密码TAA处(由美国CyberSyn公司合成)。
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1.4 pET23b PAL 重组质粒的构建 将pET23b DNA 用 NdeⅠ 和Bam HI酶切，低熔点胶回收载体片段。PAL cDNA PCR 扩增产物的两端由于通过引物引入了单一酶切位点 NdeⅠ 和 BglⅡ，故经该二种内切酶酶切后，采用部分沉淀法[3]回收并纯化目的基因片段。将载体、目的基因片段按1∶3比例(摩尔比)在T4DNA连接酶反应体系中，于12℃温育8h，转化大肠杆菌JM109 DE3感受态细胞，用含氨苄青霉素的NZCYM培养基(Gibco BRL)37℃培养过夜。
1.5 PCR法筛查阳性克隆 20μl PCR体系含1×PCR缓冲液，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTP，T7启动子引物和引物P1各50ng，Taq DNA聚合酶1U。用20μl灭菌吸头挑一菌落(直径1mm)加至反应液中，轻轻吸打，5 000rpm离心5sec，加1滴石蜡油，95℃变性3min，然后94℃1min，52℃1min，72℃2min30sec，共进行25个循环，72℃延伸10min(PE480 PCR仪)。取5μl以0.8%琼脂糖电泳，在UVP凝胶成像分析仪(英国Life Science公司)下观察结果。
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1.6 DNA测序 经PCR筛查为阳性的克隆，培养200ml，以碱变性/PEG小量法提取质粒DNA作为序列测定的模板。测序引物为T7测序引物，用ABI373型自动测序仪测序，质粒DNA用量是1μg，采用Dye terminator法作测序反应[2]。
2 结 果
2.1 PCR法筛查阳性克隆 图1显示了用PCR法筛查PAL cDNA阳性克隆菌落的电泳照片，其中2号和3号出现2.2kb扩增条带，与PAL cDNA片段长度一致，因此这2个克隆即为含PAL cDNA插入片段的阳性克隆，并且其插入方向为启动子下游5′→3′，方向正确。
图1 PCR法筛查pET23bPAL克隆电泳结果
2.2 用DNA测序确证阳性克隆的正确性 以T7为测序引物，对用PCR法筛查到的阳性克隆cDNA5′端进行序列分析，在所测420bp中，发现二个碱基变异，引起CD83 CAG—GAG(Glu-Glu)和CD101 CAT-GGT(Asp-GLu)，与文献报导符合率99.5%。
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3 讨 论
筛查含目的基因的阳性克隆，通常要将转化的多个菌落转入新的培养基中培养过夜，分别提取质粒DNA，进一步酶切或杂交。Sathe等[3]将含重组质粒的细菌经过94℃变性1min，以倒置显微镜观察，发现大部分细胞破裂，释放出其DNA，因此可作为PCR的模板，而不需要作抽提、纯化质粒DNA。以菌落上少许菌体直接作PCR，可快速鉴定有无插入片段，只需3h～4h。由于引物T7位于载体pET23b的启动子上，P1位于目的基因PAL cDNA3′端终止密码TAA处，因此只有插入方向正确的PAL cDNA的克隆才能得到2.2kb扩增产物，即用PCR法可以鉴别重组片段插入方向是否符合作基因表达的要求。经PCR筛查的阳性克隆，对PAL进行序列测定，发现二个碱基变异，这应考虑到RT—PCR过程中的碱基错配，但对克隆化PAL cDNA的表达活性分析，证明有PAL酶活性[5]。
, 百拇医药 用PCR法筛查重组阳性克隆，直接、快速、方法简便、结果可靠，可用于重组分子的筛查，也可考虑应用到病原体的检查，以标本直接作PCR，不必提取DNA，为基础研究和临床诊断提供一个简便而有效的方法。
基金项目：北京自然科学基金资助
作者简介：胡维(1962～)，男，主管检验师，医学硕士，从事分子克隆与表达的研究。
作者单位：胡 维 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院，北京 100020
向 华 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院，北京 100020
周 艳 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院，北京 100020
刘敬忠 首都医科大学附属北京红十字朝阳医院，北京 100020
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参考文献
[1]Gussow D and Clackson T.Direct clone characterization from plaques and colonies by polymerase chain reaction.Nucleic Acid Research,1989,17(10):4000.
[2]Applied Biosystems:373 DNA Sequencing System user′s Manual(June).Foster City,CA1994.
[3]刘敬忠，向华，张纪平，等.筛查基因突变的新技术-循环双脱氧指纹图谱法及其应用.高技术通讯，1996，6(1)：37～41.
[4]Sathe G M,Brien S O,McLaughlin M M,et al.Use of polymerase chain reaction for rapid detection of gene insertions in whole yeast cells.Nucleic Acids Res,1991,19:4775.
[5]刘敬忠，向华，胡维，等.苯丙氨酸脱氨酶cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达.生物工程学报，1998，4(4)：384., 百拇医药