中、长期模拟失重大鼠心肌间质Ⅰ、Ⅲ型胶原的变化
中、长期模拟失重大鼠心肌间质Ⅰ、Ⅲ型胶原的变化
刘春 张立藩 毛秦雯 余志斌 张远强
摘要 目的：研究中期及长期模拟失重对大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响。方法：尾部悬吊大鼠模型模拟失重对机体的影响。用免疫组织化学方法及计算机显微图像分析法观察了尾部悬吊4周(suspended 4-week, SUS-4)、尾部悬吊13周(suspended 13-week, SUS-13)大鼠与同步对照大鼠(controls, CON-4, CON-13)左室各部位心肌、室间隔与右室心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原的改变。结果：与CON-4相比，CON-13各部位胶原总量及Ⅰ、Ⅲ型胶原均呈增加趋势，右室心肌Ⅰ型胶原及左室心肌内膜下区Ⅲ型胶原的差别有显著性的意义，分别增加112.2%(P<0.01)、18.7%(P<0.05)。与CON-4相比，SUS-4各部位心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原有增加趋势，但差别没有显著性的意义。与CON-13相比，SUS-13左室心肌胶原总量显著增加；左室心内膜下区、心肌膜及全部左室心肌Ⅰ型胶原分别增加69.1%、62.1%及51.6%(P<0.05)；左室心内膜下区及全部左室心肌Ⅲ型胶原分别增加61%及39.7%(P<0.05)。与SUS-4相比，SUS-13左室心内膜下区、心肌膜、整个左室心肌及右室心肌Ⅰ型胶原显著增加(P<0.05)；左室各部位心肌Ⅲ型胶原显著增加(P<0.05)。结论：中、长期模拟失重均可对大鼠心肌胶原间质产生影响，长期模拟失重可导致大鼠左室心肌胶原显著增加。
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关键词：模拟失重 大鼠 心肌 胶原 免疫组织化学
长期模拟失重可引起大鼠乳头肌的长度-静息张力曲线有下移趋势[1]，提示长期模拟失重可能引起心肌的被动性劲度增加。心肌的劲度与心脏的顺应性主要取决于胶原纤维的数量、类型，胶原蛋白分子的空间结构、分子内(外)的交联等一系列因素[2]。近年发现，在不同压力超负荷、容量超负荷下，除心肌细胞及其收缩蛋白变化外，心肌间质胶原的特异重建变化在发病过程中具有重要作用[2]。衰老过程常伴有的心律失常及心室劲度增大，与心肌纤维化程度有关。鉴于失重、不活动与衰老三者间有一定相似之处[3]，航天员心律失常的发生机制亦有待阐明。加之长期模拟失重大鼠心肌劲度可能有改变[1]及脂褐素增多现象[4]，故阐明长期模拟失重大鼠心肌胶原纤维的变化具有重要意义。
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材料与方法
一、模拟失重大鼠模型
雄性SD大鼠40只，体重140～150 g，由本校二级实验动物中心提供。按体重配对原则随机分为四组，每组10只，即尾部悬吊4周组(suspended 4-week, SUS-4)与同步对照组(controls, CON-4)和尾部悬吊13周组(suspended 13-week, SUS-13)与同步对照组(controls, CON-13)。按照陈杰等[5]的方法悬吊与饲养。动物实验均遵照第四军医大学实验动物饲养与使用规定执行。
二、标本制备
腹腔内注射戊巴比妥钠(50 mg/ kg)麻醉大鼠后，迅速打开胸腔，从下腔静脉注入2 ml 1 mol/L氯化钾，使心脏停跳在舒张状态。然后以100 mm Hg(13.3 kPa)的大鼠正常动脉压力经主动脉逆行灌注Gendre液对心脏进行原位固定。在心尖，心底连线的中部垂直平面取左心室前、后、侧壁，室间隔与右心室游离壁各一块组织。将取下的标本置于相同的固定液中后固定24 h。使用梯度酒精脱水，香柏油透明，二甲苯媒浸，石蜡包埋，切片。将切片裱贴在预先经0.5%APES处理的载玻片上。37℃烘箱保存备用。
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三、心肌形态学研究
切片脱蜡，进行Masson三色染色法显示心肌总胶原。
Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的变化采用ABC (avidin biotin complex)免疫组织化学技术测定。切片脱蜡，甲醇双氧水灭活内源性氧化酶15 min；抗原修复，正常羊血清(1∶100)封闭30 min；分别加入兔抗鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原的Ⅰ抗(1∶5 000，博士德公司产品，武汉)，4℃孵育18 h；加入生物素标记的羊抗兔IgG血清(1∶5 000, Sigma,美国)室温孵育4 h；加入ABC(1∶200, DAKO，丹麦)室温孵育45 min。切片置入葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺溶液显色。镜下观察，待显色完全，蒸馏水终止显色。以上各步骤之间均用0.01 mol/L PBS (pH 7.4)洗 3 次，每次10 min。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
对照实验：用正常羊血清取代第一抗体进行孵育；将第一抗体经过过量的相应标准I、Ⅲ型胶原抗原吸收后进行孵育。两实验结果显色均为阴性。
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四、形态学定量
对免疫组织化学染色切片采用Leica-Q500MC型自动图像分析仪(Leica，德国)进行图像分析，将视野放大400倍，通过置于显微镜上的相机将图像传输入计算机，自动选取测量范围，分析整个测量范围内的灰度值，取第一个不为零的灰度值作为最高灰度，将全部心肌细胞选入的灰度值作为背景灰度值，根据Leica-Q500MC手册给定的公式(灰度阈值=最高灰度值+(背景灰度值-最高灰度值)/2)来设定为灰度阈值，位于灰度阈值与最高灰度值间的测量面积为心肌胶原所占面积，位于背景灰度值与灰度阈值间的测量面积为心肌细胞所占面积。两者的比值为心肌中胶原所占的体积分数。将左室心肌分为心内膜下区、心外膜下区和心肌膜三个区。对左室的每一区、室间隔及右室心肌各取5张切片，每张切片均随机取5个视野。按上述方法计算出胶原体积分数。左心室三区的平均值作为整个左心室的胶原体积分数。
五、数据分析
所有数据以x±sx表示，同一时间的对照大鼠与悬吊大鼠比较采用配对样本t检验，CON-4与CON-13，以及SUS-4与SUS-13比较均采用t检验，用SPSS统计软件对数据进行统计分析。
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结果
一、心肌胶原总量
两位形态学专职技师采用双盲法，镜下观察Masson染色切片，判断组间心肌胶原量的变化趋势。一致认为：CON-13较CON-4胶原总量有增加趋势。与同步对照相比，SUS-4各部位胶原总量无明显变化；与同步对照相比，SUS-13左室心内膜下区心肌胶原总量增加，其余部位心肌胶原无明显变化。SUS-13较SUS-4各部位胶原总量明显增加。
二、免疫组织化学染色及图像分析
表1 4周、13周模拟失重大鼠(SUS-4, SUS-13)及相应对照大鼠(CON-4, CON-13)
心肌各部位Ⅰ、 Ⅲ型胶原所占体积分数(%)
部位 Region
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CON-4
SUS-4
CON-13
SUS-13
Ⅰ型胶原纤维
Type Ⅰ collagen
END
WALL
EPI
LV
SEP
RV
8.0±2.50
, 百拇医药
6.2±1.71
7.4±1.40
7.2±1.05
5.8±0.81
7.7±0.86
8.9±1.68
7.0±0.78
7.2±1.05
7.7±0.70
5.3±0.48
9.2±1.30#
9.5±1.12
, 百拇医药
8.1±0.79
9.5±1.40
9.0±0.64
7.7±0.71
16.4±1.44#
16.1±2.16*+
13.1±1.93*+
12.1±1.86
13.8±1.16**++
12.2±1.95
15.6±2.90+
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Ⅲ型胶原纤维
Type Ⅲ collagen
END
WALL
EPI
LV
SEP
RV
1.3±0.22
0.8±0.13
0.9±0.19
1.0±0.11
, 百拇医药 2.4±0.19
3.2±0.72
1.5±0.26
1.0±0.08
1.4±0.27
1.3±0.13
3.3±0.79
2.8±0.40
2.0±0.16#
1.9±0.49
1.7±0.24
1.9±0.18
, 百拇医药
3.8±0.57
6.5±1.99
3.2±0.44*+
2.1±0.16+
2.5±0.38+
2.6±0.22*+
4.1±0.66
5.0±0.69
注：END，左室心内膜下区；WALL，左室心肌膜；EPI，左室心外膜下区心肌；LV，全部左室心肌；SEP，室间隔；RV，右室心肌。与4周模拟失重大鼠相应对照比较，#P<0.05；与13周模拟失重大鼠相应对照比较，*P<0.05,**P<0.01；与4周模拟失重大鼠相比较，+P<0.05,++P<0.01
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Note: END, left ventricular subendocardium; WALL, left myocardium; EPI, left ventricular subepicardium; LV, left ventricular myocardium; SEP, septum; RV, right ventricular myocardium.Compared with CON-4,#P<0.05;compared with CON-13,*P<0.05,**P<0.01compared with SUS-4,+P<0.05，++P<0.01
CON-4和CON-13各部位心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原均匀分布，CON-13心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原形成的纤维间隔明显大于CON-4(见封4图1A、E、C、G)；SUS-4心肌血管周围出现纤维化，Ⅰ、Ⅲ型胶原主要集中于血管外膜区域(见封4图1B、F)，而SUS-13左心室心内膜下区及右室心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原非均一性增加，是以血管为中心增加的胶原纤维向心肌间隙内延伸，而且可见到局灶性胶原纤维沉积(见封4图1D、H)。
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图1 2号CON-4，SUS -4，CON-13 大鼠左室侧壁心肌内膜下区I型胶原(图A、B、C、D)、Ⅲ型胶原(图E、F、G、H)分布标尺250μm
Fig.1 Immunohistochemistry staining of type I(Fig A,B,C,D)and type Ⅲ(Fig E,F,G,H)collagens in No.2CON-4.SUS -4,CON-13and SUS-13 rats left lateral ventricular subendocardium .Scale bar,250μm
图像分析结果如下：与CON-4相比，CON-13大鼠各部位心肌的Ⅰ、Ⅲ型胶原均有增加趋势，右室心肌Ⅰ型胶原与左室心内膜下区心肌Ⅲ型胶原增加的变化达到显著水平，分别增加112.2%(P<0.01)及57.1%(P<0.05)。与CON-4相比，SUS-4大鼠各部位心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原均有增加趋势，但差别没有显著性的意义。与CON-13相比，SUS-13大鼠左室心内膜下区、心肌膜及整个左室心肌Ⅰ型胶原分别增加69.1%、62.1%及51.6%(P<0.05)，左室心内膜下区及整个左室心肌Ⅲ型胶原分别增加61%及39.7%(P<0.05)。与SUS-4相比，SUS-13大鼠分布于左室的心内膜下区、心肌膜、整个左室心肌、室间隔以及右室心肌的Ⅰ型胶原分别增加80.5%、87.5%、78.5% (P<0.01)、41.2%和70.7%(P<0.05)，左室心内膜下区、心肌膜、心外膜下区及整个左室心肌Ⅲ型胶原分别增加113.3%、 118.1%、86.6%和105.1%(P<0.05)(图2)。
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讨论
本实验结果表明：中期模拟失重引起大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原呈增加趋势。长期模拟失重引起大鼠心肌胶原总量及Ⅰ、Ⅲ型胶原显著增加，分布不均一。
心脏除心肌细胞外，还包含大量的间质成份，心肌间质中的胶原纤维组成三维的网架，支持心肌细胞与血管有序排列，保持心肌组织正常构筑关系及室腔的几何形状，并实现心肌细胞收缩力的传递，使心肌成为一功能性的整体[2]。从鼠龄3月龄到16月龄，大鼠左室心肌羟脯氨酸含量增加缓慢；而从16到22月龄，则增加率加快[6]。大鼠左室心肌Ⅰ型胶原含量随着年龄逐渐增加[7]。本次实验中发现对照大鼠各部位心肌胶原纤维的年龄变化特点与之相似。
容量超负荷或压力超负荷引起的心肌重建都必须依赖原有心肌胶原结构的重建[2]。胶原除发生重建以保护心肌结构的完整性外，在很大程度上它还决定了收缩、舒张时心肌的应力-应变关系[2]。地面卧床实验发现受试者有心肌质量减少和左室压力-容积关系左移[8]，以及左室壁厚度减少和心肌纤维收缩速度减慢变化[9]，提示可能与心肌胶原改变有关。而且本实验室对离体乳头肌收缩性能的研究发现长期模拟失重还可引起乳头肌的长度-静息张力曲线有下移趋势[1]，提示长期模拟失重可能引起心肌的被动性劲度增加。本次实验发现4周模拟失重导致心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维呈增加趋势，13周模拟失重引起大鼠全部左室心肌Ⅰ型胶原较相应对照大鼠增加51.6%，而Ⅲ型胶原仅增加39.7%。Ⅰ型胶原增加程度大于Ⅲ型胶原。心肌中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量与器
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官的弹性和(或)劲度有重要关系。Ⅰ型胶原含量增加则顺应性差，反之，则顺应性好。因而左心室心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原量的不同程度变化可能是导致长期模拟失重大鼠心肌被动性劲度增加的原因之一。
本实验发现长期模拟失重大鼠心肌各部位心肌较同龄大鼠出现纤维化，而纤维化是老年心肌特征之一。本实验室还发现长期(120 d)模拟失重大鼠心肌细胞内的脂褐素增多[1,4]等。提示长期失重可能导致心肌向老年化发展，尚需进一步证明。
总之，中、长期模拟失重可致心肌胶原发生重建，尤其是长期模拟失重导致大鼠左心室纤维化。因而在长期航天失重过程中，应考虑采取相应的对抗措施来维持心肌正常结构与功能。
志谢：衷心感谢第四军医大学组织学与胚胎学教研室的孙岚技师、解剖学教研室李雪冰与王丹技师在实验中所给予的帮助!
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图2 条图表示心室肌中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原所占体积分数。END，左室心内膜下区心肌；EPI，左室心外膜下区心肌；WALL，左室心肌膜；LV，全部左室心肌，SEP，室间隔；RV，右室心肌。与CON-4 相比,#P<0.05；与CON-13相比,*P<0.05,**P<0.01；与SUS-4相比,+P<0.05,++P<0.01
Fig 2 Graphic illustration of the volume fraction of collagen in rat myocardium. TypeⅠcollagen and type Ⅲ collagen. END, left ventricular subendocardium; EPI, left ventricular subepicardium; WALL, left myocardium; LV, left ventricular myocardium; SEP，septum; RV, right ventricular myocardium. Compared with CON-4,#P<0.05; compared with CON-13,*P<0.05,**P<0.01;compared with SUS-4,+P<0.05,++P<0.01
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670800)
作者单位：刘 春(710032 西安，第四军医大学航空航天生理学教研室)
张立藩(710032 西安，第四军医大学航空航天生理学教研室)
毛秦雯(710032 西安，第四军医大学航空航天生理学教研室)
余志斌(710032 西安，第四军医大学航空航天生理学教研室)
张远强(组织学与胚胎学教研室)
参考文献
1 ZHANG LF, YU ZB, MA J. Functional alterations in cardiac muscle after medium or long-term simulated weightlessness and related cellular mechanisms. J Gravit Physiol, 1995, 2(1): 5-8.
, 百拇医药
2 Weber KT. Cardiac interstitium in health and disease: the fibrillar collagen network. J Am Coll Cardiol, 1989, 13(7):1637-1652.
3 Timiras PS. Disuse and aging: same problem, different outcomes. J Gravit Physiol, 1994, 1(1): 5-7.
4 CHEN J, ZHANG LF, MA J, et al. Ultrastructural changes of myocardium in long-term tail-suspended rats. Chin J Aviat Med, 1995,(6):133-137.
5 陈杰，马进，丁兆平，等. 一种模拟失重影响的大鼠尾部悬吊模型. 空间科学学报, 1993, 13(2):161-164.
, http://www.100md.com
6 Besse S, Assayag P, Delcayre C, et al. Normal and hypertrophied senescent rat heart, mechanical and molecular characteristic. Am J Physiol, 1993, 265: H183-H190.
7 Mukherjee D, Sen S. Collagen phenotypes during development and regression of myocardial hypertrophy in spontaneously hypertensive rats. Circ Res, 1990, 67:1474-1480.
8 Levine BD, Zucherman JH, Pawelczyk JA. Cardiac atrophy after bed-rest deconditioning: a nonneural mechanisms for orthostatic intolerance. Circulation, 1997,96:517-525.
9 Arbeille Ph, Herault S. Cardiac hemodynamics at rest and during LBNP after 4 days and 6 weeks in HDT. J Gravit Physiol, 1997, 4(2):31-32., 百拇医药
刘春 张立藩 毛秦雯 余志斌 张远强
摘要 目的：研究中期及长期模拟失重对大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响。方法：尾部悬吊大鼠模型模拟失重对机体的影响。用免疫组织化学方法及计算机显微图像分析法观察了尾部悬吊4周(suspended 4-week, SUS-4)、尾部悬吊13周(suspended 13-week, SUS-13)大鼠与同步对照大鼠(controls, CON-4, CON-13)左室各部位心肌、室间隔与右室心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原的改变。结果：与CON-4相比，CON-13各部位胶原总量及Ⅰ、Ⅲ型胶原均呈增加趋势，右室心肌Ⅰ型胶原及左室心肌内膜下区Ⅲ型胶原的差别有显著性的意义，分别增加112.2%(P<0.01)、18.7%(P<0.05)。与CON-4相比，SUS-4各部位心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原有增加趋势，但差别没有显著性的意义。与CON-13相比，SUS-13左室心肌胶原总量显著增加；左室心内膜下区、心肌膜及全部左室心肌Ⅰ型胶原分别增加69.1%、62.1%及51.6%(P<0.05)；左室心内膜下区及全部左室心肌Ⅲ型胶原分别增加61%及39.7%(P<0.05)。与SUS-4相比，SUS-13左室心内膜下区、心肌膜、整个左室心肌及右室心肌Ⅰ型胶原显著增加(P<0.05)；左室各部位心肌Ⅲ型胶原显著增加(P<0.05)。结论：中、长期模拟失重均可对大鼠心肌胶原间质产生影响，长期模拟失重可导致大鼠左室心肌胶原显著增加。
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关键词：模拟失重 大鼠 心肌 胶原 免疫组织化学
长期模拟失重可引起大鼠乳头肌的长度-静息张力曲线有下移趋势[1]，提示长期模拟失重可能引起心肌的被动性劲度增加。心肌的劲度与心脏的顺应性主要取决于胶原纤维的数量、类型，胶原蛋白分子的空间结构、分子内(外)的交联等一系列因素[2]。近年发现，在不同压力超负荷、容量超负荷下，除心肌细胞及其收缩蛋白变化外，心肌间质胶原的特异重建变化在发病过程中具有重要作用[2]。衰老过程常伴有的心律失常及心室劲度增大，与心肌纤维化程度有关。鉴于失重、不活动与衰老三者间有一定相似之处[3]，航天员心律失常的发生机制亦有待阐明。加之长期模拟失重大鼠心肌劲度可能有改变[1]及脂褐素增多现象[4]，故阐明长期模拟失重大鼠心肌胶原纤维的变化具有重要意义。
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材料与方法
一、模拟失重大鼠模型
雄性SD大鼠40只，体重140～150 g，由本校二级实验动物中心提供。按体重配对原则随机分为四组，每组10只，即尾部悬吊4周组(suspended 4-week, SUS-4)与同步对照组(controls, CON-4)和尾部悬吊13周组(suspended 13-week, SUS-13)与同步对照组(controls, CON-13)。按照陈杰等[5]的方法悬吊与饲养。动物实验均遵照第四军医大学实验动物饲养与使用规定执行。
二、标本制备
腹腔内注射戊巴比妥钠(50 mg/ kg)麻醉大鼠后，迅速打开胸腔，从下腔静脉注入2 ml 1 mol/L氯化钾，使心脏停跳在舒张状态。然后以100 mm Hg(13.3 kPa)的大鼠正常动脉压力经主动脉逆行灌注Gendre液对心脏进行原位固定。在心尖，心底连线的中部垂直平面取左心室前、后、侧壁，室间隔与右心室游离壁各一块组织。将取下的标本置于相同的固定液中后固定24 h。使用梯度酒精脱水，香柏油透明，二甲苯媒浸，石蜡包埋，切片。将切片裱贴在预先经0.5%APES处理的载玻片上。37℃烘箱保存备用。
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三、心肌形态学研究
切片脱蜡，进行Masson三色染色法显示心肌总胶原。
Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维的变化采用ABC (avidin biotin complex)免疫组织化学技术测定。切片脱蜡，甲醇双氧水灭活内源性氧化酶15 min；抗原修复，正常羊血清(1∶100)封闭30 min；分别加入兔抗鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原的Ⅰ抗(1∶5 000，博士德公司产品，武汉)，4℃孵育18 h；加入生物素标记的羊抗兔IgG血清(1∶5 000, Sigma,美国)室温孵育4 h；加入ABC(1∶200, DAKO，丹麦)室温孵育45 min。切片置入葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍胺溶液显色。镜下观察，待显色完全，蒸馏水终止显色。以上各步骤之间均用0.01 mol/L PBS (pH 7.4)洗 3 次，每次10 min。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
对照实验：用正常羊血清取代第一抗体进行孵育；将第一抗体经过过量的相应标准I、Ⅲ型胶原抗原吸收后进行孵育。两实验结果显色均为阴性。
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四、形态学定量
对免疫组织化学染色切片采用Leica-Q500MC型自动图像分析仪(Leica，德国)进行图像分析，将视野放大400倍，通过置于显微镜上的相机将图像传输入计算机，自动选取测量范围，分析整个测量范围内的灰度值，取第一个不为零的灰度值作为最高灰度，将全部心肌细胞选入的灰度值作为背景灰度值，根据Leica-Q500MC手册给定的公式(灰度阈值=最高灰度值+(背景灰度值-最高灰度值)/2)来设定为灰度阈值，位于灰度阈值与最高灰度值间的测量面积为心肌胶原所占面积，位于背景灰度值与灰度阈值间的测量面积为心肌细胞所占面积。两者的比值为心肌中胶原所占的体积分数。将左室心肌分为心内膜下区、心外膜下区和心肌膜三个区。对左室的每一区、室间隔及右室心肌各取5张切片，每张切片均随机取5个视野。按上述方法计算出胶原体积分数。左心室三区的平均值作为整个左心室的胶原体积分数。
五、数据分析
所有数据以x±sx表示，同一时间的对照大鼠与悬吊大鼠比较采用配对样本t检验，CON-4与CON-13，以及SUS-4与SUS-13比较均采用t检验，用SPSS统计软件对数据进行统计分析。
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结果
一、心肌胶原总量
两位形态学专职技师采用双盲法，镜下观察Masson染色切片，判断组间心肌胶原量的变化趋势。一致认为：CON-13较CON-4胶原总量有增加趋势。与同步对照相比，SUS-4各部位胶原总量无明显变化；与同步对照相比，SUS-13左室心内膜下区心肌胶原总量增加，其余部位心肌胶原无明显变化。SUS-13较SUS-4各部位胶原总量明显增加。
二、免疫组织化学染色及图像分析
表1 4周、13周模拟失重大鼠(SUS-4, SUS-13)及相应对照大鼠(CON-4, CON-13)
心肌各部位Ⅰ、 Ⅲ型胶原所占体积分数(%)
部位 Region
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CON-4
SUS-4
CON-13
SUS-13
Ⅰ型胶原纤维
Type Ⅰ collagen
END
WALL
EPI
LV
SEP
RV
8.0±2.50
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6.2±1.71
7.4±1.40
7.2±1.05
5.8±0.81
7.7±0.86
8.9±1.68
7.0±0.78
7.2±1.05
7.7±0.70
5.3±0.48
9.2±1.30#
9.5±1.12
, 百拇医药
8.1±0.79
9.5±1.40
9.0±0.64
7.7±0.71
16.4±1.44#
16.1±2.16*+
13.1±1.93*+
12.1±1.86
13.8±1.16**++
12.2±1.95
15.6±2.90+
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Ⅲ型胶原纤维
Type Ⅲ collagen
END
WALL
EPI
LV
SEP
RV
1.3±0.22
0.8±0.13
0.9±0.19
1.0±0.11
, 百拇医药 2.4±0.19
3.2±0.72
1.5±0.26
1.0±0.08
1.4±0.27
1.3±0.13
3.3±0.79
2.8±0.40
2.0±0.16#
1.9±0.49
1.7±0.24
1.9±0.18
, 百拇医药
3.8±0.57
6.5±1.99
3.2±0.44*+
2.1±0.16+
2.5±0.38+
2.6±0.22*+
4.1±0.66
5.0±0.69
注：END，左室心内膜下区；WALL，左室心肌膜；EPI，左室心外膜下区心肌；LV，全部左室心肌；SEP，室间隔；RV，右室心肌。与4周模拟失重大鼠相应对照比较，#P<0.05；与13周模拟失重大鼠相应对照比较，*P<0.05,**P<0.01；与4周模拟失重大鼠相比较，+P<0.05,++P<0.01
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Note: END, left ventricular subendocardium; WALL, left myocardium; EPI, left ventricular subepicardium; LV, left ventricular myocardium; SEP, septum; RV, right ventricular myocardium.Compared with CON-4,#P<0.05;compared with CON-13,*P<0.05,**P<0.01compared with SUS-4,+P<0.05，++P<0.01
CON-4和CON-13各部位心肌组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原均匀分布，CON-13心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原形成的纤维间隔明显大于CON-4(见封4图1A、E、C、G)；SUS-4心肌血管周围出现纤维化，Ⅰ、Ⅲ型胶原主要集中于血管外膜区域(见封4图1B、F)，而SUS-13左心室心内膜下区及右室心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原非均一性增加，是以血管为中心增加的胶原纤维向心肌间隙内延伸，而且可见到局灶性胶原纤维沉积(见封4图1D、H)。
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图1 2号CON-4，SUS -4，CON-13 大鼠左室侧壁心肌内膜下区I型胶原(图A、B、C、D)、Ⅲ型胶原(图E、F、G、H)分布标尺250μm
Fig.1 Immunohistochemistry staining of type I(Fig A,B,C,D)and type Ⅲ(Fig E,F,G,H)collagens in No.2CON-4.SUS -4,CON-13and SUS-13 rats left lateral ventricular subendocardium .Scale bar,250μm
图像分析结果如下：与CON-4相比，CON-13大鼠各部位心肌的Ⅰ、Ⅲ型胶原均有增加趋势，右室心肌Ⅰ型胶原与左室心内膜下区心肌Ⅲ型胶原增加的变化达到显著水平，分别增加112.2%(P<0.01)及57.1%(P<0.05)。与CON-4相比，SUS-4大鼠各部位心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原均有增加趋势，但差别没有显著性的意义。与CON-13相比，SUS-13大鼠左室心内膜下区、心肌膜及整个左室心肌Ⅰ型胶原分别增加69.1%、62.1%及51.6%(P<0.05)，左室心内膜下区及整个左室心肌Ⅲ型胶原分别增加61%及39.7%(P<0.05)。与SUS-4相比，SUS-13大鼠分布于左室的心内膜下区、心肌膜、整个左室心肌、室间隔以及右室心肌的Ⅰ型胶原分别增加80.5%、87.5%、78.5% (P<0.01)、41.2%和70.7%(P<0.05)，左室心内膜下区、心肌膜、心外膜下区及整个左室心肌Ⅲ型胶原分别增加113.3%、 118.1%、86.6%和105.1%(P<0.05)(图2)。
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讨论
本实验结果表明：中期模拟失重引起大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原呈增加趋势。长期模拟失重引起大鼠心肌胶原总量及Ⅰ、Ⅲ型胶原显著增加，分布不均一。
心脏除心肌细胞外，还包含大量的间质成份，心肌间质中的胶原纤维组成三维的网架，支持心肌细胞与血管有序排列，保持心肌组织正常构筑关系及室腔的几何形状，并实现心肌细胞收缩力的传递，使心肌成为一功能性的整体[2]。从鼠龄3月龄到16月龄，大鼠左室心肌羟脯氨酸含量增加缓慢；而从16到22月龄，则增加率加快[6]。大鼠左室心肌Ⅰ型胶原含量随着年龄逐渐增加[7]。本次实验中发现对照大鼠各部位心肌胶原纤维的年龄变化特点与之相似。
容量超负荷或压力超负荷引起的心肌重建都必须依赖原有心肌胶原结构的重建[2]。胶原除发生重建以保护心肌结构的完整性外，在很大程度上它还决定了收缩、舒张时心肌的应力-应变关系[2]。地面卧床实验发现受试者有心肌质量减少和左室压力-容积关系左移[8]，以及左室壁厚度减少和心肌纤维收缩速度减慢变化[9]，提示可能与心肌胶原改变有关。而且本实验室对离体乳头肌收缩性能的研究发现长期模拟失重还可引起乳头肌的长度-静息张力曲线有下移趋势[1]，提示长期模拟失重可能引起心肌的被动性劲度增加。本次实验发现4周模拟失重导致心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维呈增加趋势，13周模拟失重引起大鼠全部左室心肌Ⅰ型胶原较相应对照大鼠增加51.6%，而Ⅲ型胶原仅增加39.7%。Ⅰ型胶原增加程度大于Ⅲ型胶原。心肌中Ⅰ、Ⅲ型胶原的含量与器
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官的弹性和(或)劲度有重要关系。Ⅰ型胶原含量增加则顺应性差，反之，则顺应性好。因而左心室心肌Ⅰ、Ⅲ型胶原量的不同程度变化可能是导致长期模拟失重大鼠心肌被动性劲度增加的原因之一。
本实验发现长期模拟失重大鼠心肌各部位心肌较同龄大鼠出现纤维化，而纤维化是老年心肌特征之一。本实验室还发现长期(120 d)模拟失重大鼠心肌细胞内的脂褐素增多[1,4]等。提示长期失重可能导致心肌向老年化发展，尚需进一步证明。
总之，中、长期模拟失重可致心肌胶原发生重建，尤其是长期模拟失重导致大鼠左心室纤维化。因而在长期航天失重过程中，应考虑采取相应的对抗措施来维持心肌正常结构与功能。
志谢：衷心感谢第四军医大学组织学与胚胎学教研室的孙岚技师、解剖学教研室李雪冰与王丹技师在实验中所给予的帮助!
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图2 条图表示心室肌中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原所占体积分数。END，左室心内膜下区心肌；EPI，左室心外膜下区心肌；WALL，左室心肌膜；LV，全部左室心肌，SEP，室间隔；RV，右室心肌。与CON-4 相比,#P<0.05；与CON-13相比,*P<0.05,**P<0.01；与SUS-4相比,+P<0.05,++P<0.01
Fig 2 Graphic illustration of the volume fraction of collagen in rat myocardium. TypeⅠcollagen and type Ⅲ collagen. END, left ventricular subendocardium; EPI, left ventricular subepicardium; WALL, left myocardium; LV, left ventricular myocardium; SEP，septum; RV, right ventricular myocardium. Compared with CON-4,#P<0.05; compared with CON-13,*P<0.05,**P<0.01;compared with SUS-4,+P<0.05,++P<0.01
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39670800)
作者单位：刘 春(710032 西安，第四军医大学航空航天生理学教研室)
张立藩(710032 西安，第四军医大学航空航天生理学教研室)
毛秦雯(710032 西安，第四军医大学航空航天生理学教研室)
余志斌(710032 西安，第四军医大学航空航天生理学教研室)
张远强(组织学与胚胎学教研室)
参考文献
1 ZHANG LF, YU ZB, MA J. Functional alterations in cardiac muscle after medium or long-term simulated weightlessness and related cellular mechanisms. J Gravit Physiol, 1995, 2(1): 5-8.
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2 Weber KT. Cardiac interstitium in health and disease: the fibrillar collagen network. J Am Coll Cardiol, 1989, 13(7):1637-1652.
3 Timiras PS. Disuse and aging: same problem, different outcomes. J Gravit Physiol, 1994, 1(1): 5-7.
4 CHEN J, ZHANG LF, MA J, et al. Ultrastructural changes of myocardium in long-term tail-suspended rats. Chin J Aviat Med, 1995,(6):133-137.
5 陈杰，马进，丁兆平，等. 一种模拟失重影响的大鼠尾部悬吊模型. 空间科学学报, 1993, 13(2):161-164.
, http://www.100md.com
6 Besse S, Assayag P, Delcayre C, et al. Normal and hypertrophied senescent rat heart, mechanical and molecular characteristic. Am J Physiol, 1993, 265: H183-H190.
7 Mukherjee D, Sen S. Collagen phenotypes during development and regression of myocardial hypertrophy in spontaneously hypertensive rats. Circ Res, 1990, 67:1474-1480.
8 Levine BD, Zucherman JH, Pawelczyk JA. Cardiac atrophy after bed-rest deconditioning: a nonneural mechanisms for orthostatic intolerance. Circulation, 1997,96:517-525.
9 Arbeille Ph, Herault S. Cardiac hemodynamics at rest and during LBNP after 4 days and 6 weeks in HDT. J Gravit Physiol, 1997, 4(2):31-32., 百拇医药