操纵子重复克隆以提高外源基因的表达水平及同一大肠杆菌细胞内质粒DNA总量为一常数的新概念
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中国医科学院学报 2000年第22卷第1期
洪梅 陈伟京 李丹 卢圣栋
摘 要：目的 确定在一个表达质粒载体上串联目的操纵子以提高目的蛋白表达量的可行性，阐明宿主细胞 对胞内质粒DNA总量调控的可能机制。方法 亚克隆构建操纵子正向串联的表达载体；SDS凝胶电泳和激光扫描测定目的蛋白表达量； 3H-TdR掺入法测定质粒拷贝数。 结果 构建两组质粒：CW11系列分别含1～4个正向操纵子；CW12系列分别含1～3个正向操纵子。在 未诱导时，操纵子的串联不影响宿主大肠杆菌的生长；温度诱导表达后，CW11系列目的蛋白 表达量分别为菌体总蛋白的46.0%、54.8%、56.1%和60.1%，CW12系列目的蛋白表达量分 别为菌体总蛋白的33.5%、44.0%和47.1%。两组质粒的拷贝数均随操纵子串联个数的增加 而减少，但目的基因的总剂量随之增加。实验数据同时表明，在相同的培养条件下，同一菌 株每个宿主细胞内的质粒DNA总量被限制在一定范围内。结论 操纵子串联增加了目的基因的剂量，从而提高了目的基因在大肠杆菌中的表达水平。另外， 质粒大小和其拷贝数呈负相关，在同一培养条件下，对于特定的大肠杆菌菌株，宿主细胞内 质粒DNA总量在一定程度上是一个相对的被限定的常数。
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关键词：操纵子 基因剂量 原核表达 质粒拷贝数 质粒DNA的限制 性常数
稳定存在于大肠杆菌(E.coli)中的高拷贝质粒，是在E.coli中获得外源基因高表达的常用载体。一般而言，质粒载体的高拷贝数常与目的基因的剂量相对应。许多报道表明，质粒拷贝数的增加可使目的蛋白产量提高，这种相应的关系甚至在质粒拷贝数大于300时还存在[1]。然而，在正常情况下，特定的表达质粒在某一宿主中的拷贝数不是可以无限增加的，从而使基因剂量的增加受到限制。将外源基因串联在强启动子下进行表达，是增加基因剂量的一种方法[2～5]。Shen等[2]首先通过目的基因自身串联来增加产物的稳定性；并有效地利用细胞代谢能力，提高目的蛋白的产量。Lennick等[3]曾构建了含8个串联重复心钠素(ANP)基因的表达载体，在增加产物稳定性的基础上，充分利用菌体提供的tRNA和核糖体来尽可能高水平合成目的蛋白，提高了ANP的产量。然而，在表达天然基因产物时，基因的串联对连接点的要求较高，需要考虑目的蛋白氨基酸组成，选择合适的内肽酶以避免把目的蛋白切碎，而且需要避免在目的蛋白两端留下多余残基。此外，串联产物在切割时很难形成单一的目的产物，很可能获得不同串联长度的产物，给后期纯化带来一定的困难，而非天然单体的混合物在相应的药理与毒理研究中不能使用。本研究提出一种操纵子串联的策略，它可以克服上述方法的弱点。该方法把包括目的蛋白编码序列及强启动子、SD序列、转录终止子等调控序列的整个操纵子正向重复克隆在同一质粒表达载体上，以期增加目的基因的剂量，提高目的蛋白的表达水平。本研究组过去曾将表达质粒pLY1(5.5kb)中包括PL-SD-Ref-(α-hANP)-rrnBT1T2的长2.2kb的全套操纵子重复克隆到同一质粒中，得到了含2个操纵子和4个操纵子的表达质粒。结果表明，该方法有效地提高了目的蛋白的表达水平[6]。为了进一步证实该方法的可行性，本实验室构建了一系列含不同串联个数操纵子的表达质粒，以进一步确定操纵子重复克隆对提高表达水平的作用。
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关于E.coli中质粒复制的调控机制已有较广泛的研究，很多质粒自身反馈调控机制已被阐明[7，8]。一些以往的工作表明，E.coli宿主对质粒拷贝数存在耐受上限[6]，不同菌株的极限水平不一样。逃逸性突变的质粒在宿主中的复制失去控制，当其拷贝数超过宿主耐受极限时，会对细胞产生毒副作用[9～11]。为了明确串联操纵子对宿主生长的影响，本实验对所构建的各质粒在宿主中的DNA总量进行了分析，结果表明在同样的培养条件下，不同大小的质粒分别在每个菌体细胞中的DNA总量被限制在一定范围内，计算表明，该总量为一相对的被限定的常数。
材料和方法
菌株 E.coli DH5α:[snp E44 △Lac U169(Φ80 Lac Z △M15)hsd R 17 rec A1 end A1 gyr A 96 thi-1 rel A1 deo R]
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质粒 pCW111:本室构建的高效表达融合蛋白Ref-ANP的质粒，携带目的操纵子，其中含PL启动子、SD序列、Ref-th-ANP编码序列和下游终止序列T1T2。pCW121:含PL启动子、SD序列、DFP3(IL2-ad-ANP)融合基因和下游终止序列T1T2。
质粒构建和表达水平的比较 位于初始质粒pCW111和pCW121中的目的操纵子用EcoRV和SspI切出后插入初始载体的EcoRV位点，使整个操纵子串联在一个质粒载体上，多次重复得到CW11和CW12两组载体。
将这些质粒分别转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落转化子，接种50 ml LB/Amp+液体培养基，于32℃振荡过夜，取培养液测定OD600，以相同OD600值按2%接种量接种500 ml新鲜LB/Amp+培养基，于32℃以250 r/min振荡培养，每2小时取样测定OD600，6h 以后每小时取样测定OD600，以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制曲线图。
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挑取含有这一系列质粒的DH5α单菌落接种于5 ml LB/Amp+液体培养基中，32℃振荡过夜，以尽可能相同的OD600值按2%接种量接种于5 ml LB/Amp+新鲜液体培养基，于32℃振荡至OD600约为0.6时，转至42℃继续振荡诱导4h，离心收集菌体，常规破菌，SDS-PAGE凝胶电泳分析，激光扫描比较所表达的融合蛋白在菌体总蛋白中的含量。
质粒拷贝数的测定 DH5α/pCW单菌落接种于5ml LB/Amp+，32℃振摇过夜，以相同OD600值按2%接种量转种于1 ml LB/Amp+，32℃振摇至OD600约为0.6时加入50 μl 3H-TdR,继续于32℃振摇3 h，6000 r/min离心收集菌体细胞，用TSB溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8 .0，30mmol/L NaCl)洗涤菌体沉淀3次，加入100 μl冰预冷的SolⅠ(50 mmol/L Glucose, 25 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，10mmol/L EDTA，pH8.0)，混匀，避免剧烈振荡，加入200μ l SolⅡ(0.2mol/L NaOH,1% SDS)，颠倒混匀，冰上静置2 min，加入150 μl SolⅢ(3 mm ol/L K+，5 mmol/L Ac-)，混匀后于冰上放置5 min，12 000 r/min离心5 min，将上清吸入另一个Eppendorf管中，作为含质粒DNA的部分；沉淀加入300 μl溶解液(200 mmol/L T ris-HCl，pH8.0,1 mmol/L EDTA,1.5% SDS)，Vortex剧烈振荡至溶液清亮，此 为含菌体染色体DNA和蛋白的部分。分别将1/10体积的质粒部分和1/10体积染色体部分加入5 ml闪烁 液(100 ml二甲基亚砜中含0.4 g PPO和0.3 g POPOP)中，在液闪仪上计数，用以下公式计算质粒拷贝数：
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N=(Me×Cp)/(Me×Ce)
N：质粒拷贝数；Me:E.coli染色体分子量，这里以平均染色体长4.0×103 kb计算； Mp:质粒分子量；Cp:质粒Bq值；Ce：E.coli染色体Bq值。
结 果
含多个操纵子的质粒的构建 作为模型，图1显示了在初始载体上重复亚克隆构建含串联操纵子表达载体的过程。采用相同方法得到CW11系列和CW12系列两组表达质粒。CW11系列包括pCW111(含1×[PL-SD-Re f-ad.-ANP-T1T2])、pCW112(含2×[PL-SD-Ref-ad.-ANP-T1T2])、pCW113(含3×[PL-SD-Ref-ad.-ANP-T1T2])和pCW114(含4×[PL-SD-Ref-ad.-ANP-T1 T2])，其大小分别为5.475、7.751、10.007和12.263 kb；CW12系列包括pCW121(含1× [PL-SD-IL2-ad.-ANP-T1T2])、pCW122(含2×[PL-SD-IL2-ad.-ANP-T1T2 ])和pCW123(含3×[PL-SD-IL2-ad.-ANP-T1T2])，其大小分别为5.401、7.563 和9.725 kb。
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图1 操纵子重复克隆示意图
Fig 1 Model of construction strategy of plasmids containing tandemly linked ope rons
*nX:the number of operon in one plasmid;
→:one operon
含不同倍数操纵子的质粒对E.coli生长的影响 于32℃培养携带CW11系列的E.coli DH5α菌体，测定生长曲线，结果显示分别带有4种质粒的菌体，从OD600约为0.2时进入对数生长期，一直延续到OD600 2.2时进入平台期，4种菌体的生长基本同步，并且在平台期保持的时间基本相同(图2)。上述结果表明在没有诱导表达时，所构建质粒的复制及操纵子串联后外源基因的基础表达不会对E.coli菌体细胞的生长造成显著的影响。
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图2 携带CW11系列质粒的大肠杆菌DH5的生长比较
Fig 2 Growth of E.coli DH5α cells carrying four kind of plasmid in sereies respectively at 32℃
操纵子重复克隆对目的蛋白表达水平的影响 在比较含不同倍数操纵子的质粒在宿主中的表达水平时，严格控制温度诱导条件，尽可能使这些宿主细胞的生长状态一致。激光扫描结果表明，随着操纵子重复次数的增加，目的蛋白在菌体总蛋白中所占比例也相应增加(表1)。CW11系列中pCW111、pCW112、pCW113和pCW114表达的目的蛋白REF-ANP在菌体总蛋白中的含量分别从原来的46.0%明显提高到54.8%、56 .1%和60.1%(图3)；CW12系列中pCW121、pCW122和pCW123表达的目的蛋白IL2-ad-ANP分别为菌体总蛋白的33.5%、44.0%和47.1%(扫描图未附)。
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图3 携带CW11系列质粒E.coli DH5α表达融合蛋白Ref-ANP的激光扫描分析图
Fig 3 Laser scanning analysis of the expression of fusion protein Ref-ANP in E.coli
cells carrying 4 kind of plasmids of CW11 series respectively
a.DH5α/pCW111;b.DH5α/pCW112;c.DH5α/pCW113;d.DH5α/pCW114
表 1 含不同串联个数操纵子的质粒在大肠杆菌中的基因剂量和目的基因表达水平的比较
Table 1 Comparison of the expression level of plasmids containing different number of op eron
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Plasmids name
Plasmid copy
number
Number of operon
in one plasmid
Number of operon
in one E.coli cell
Percentage of desire
protein in total cell
proteins
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Increased level of
expression
(%)
pCW111
162
1
162
46.0
pCW112
124
2
248
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54.8*
19.1
pCW113
115
3
345
56.1*
22.0
pCW114
95
4
380
60.1*
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30.6
pCW121
101
1
101
33.5
pCW122
72
2
144
44.0△
31.3
pCW123
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58
3
174
47.1△
40.6
* P<0.05 compared with pCW111 group;△P<0.05 compared with pCW121 grou p 为了进一步理解操纵子串联提高表达水平的作用，测定这一系列质粒在E.coli中的拷贝数并计算每个宿主细胞中质粒DNA的总量。结果显示，随着质粒的增加，其拷贝数减少，但 每个系列中分别含有大小不同质粒的每一个细胞内的质粒DNA的总量保持在一定范围内(表2)，无显著性差异。数据表明单个菌体所含目的操纵子的总数仍有所增加，说明目的基因的剂量随操纵子的重复次数增加而增加。为了考察操纵子重复克隆对质粒稳定性的影响，将这两组质粒分别转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落转化子，每隔2天传代1次，到第30代时，取单菌落诱导表达，结果显示表达水平基本不变(数据未附)，说明操纵子串联不影响质粒在E.coli宿主中的稳定性。
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表 2 大肠杆菌细胞中质粒DNA总量的比较
Table 2 Total Amount of Plasmid DNA(kb) in each E.coli cell
Plasmids type
Plasmid size(kb)
Plasmid copy number
Total amount of plasmid DN A(kb)
CW111
5.473
162
886.626
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CW112
7.751
124
961.124*
CW113
10.007
115
1150.805*
CW114
12.263
95
1164.985*
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CW121
5.401
101
545.501
CW122
7.563
72
544.536△
CW123
9.725
58
564.05△
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Total amount of plasmid DNA in host cell was counted as plasmid size multipl e plasmid copy number
* P>0.05 compored with pCW111 group;△P>0.05 compared with pCW121 group 讨 论
本研究结果表明，操纵子串联对宿主细胞无毒害作用，是行之有效的提高基因剂量的方法。与其它提高基因剂量的方法相比，操纵子串联法优点在于：不涉及对操纵子内部结构作碱基突变、核苷酸增减等任何修饰，而是将整个操纵子作为一个单元进行操作，技术简便，并能保持外源基因的天然结果。
在构建含有多个操纵子的表达质粒过程中，所使用的限制性内切酶SspⅠ和EcoRⅤ均产生平头末端，理论上可能产生同向和反向的串联操纵子，但在筛选过程中只得到了同向串联的亚克隆质粒，推测两个反向连接的操纵子DNA重复片段之间可能极易形成自身互补的发卡结构，对DNA的自身复制不利，导致这种质粒丢失。
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表1所列两个系列中的质粒大小均以相似的趋势递增，但尽管目的蛋白产量随单个细胞中操纵子数目的增加而增加，而这两个系列对应的产物增加程度却不相同。这可能是由于目的蛋白编码序列不同所致。从扫描图可以看出，操纵子在同一质粒上重复克隆后，伴随着目的蛋白含量的增加，菌体其它蛋白的含量有所减少，说明菌体的总蛋白量是有一定限度的，外源蛋白不可能无限制增加。当外源基因剂量增加到一定程度时，菌体中无更多的自由核糖体和氨基酸供成倍增加的外源mRNA完全翻译成蛋白质，致使目的产物合成的增长程度受到限制。由于本实验所选初始质粒的表达水平已经很高，菌体合成蛋白的能力已近最大，或者细胞对外源蛋白的耐受已近极限，因而目的基因表达水平提高的倍数与操纵子的重复倍数不一致。推测初始表达水平较低时，利用该方法提高表达的效果会更显著。
有研究表明，逃逸性质粒抑制宿主细胞的生长，甚至使细胞致死[9～11]。在本实验中，操纵子串联所带来的目的外源基因剂量的增加对宿主细胞的生长和质粒的稳定性没有影响。Haugan[9]曾报道存在一个宿主特异性的质粒拷贝数最大容忍限度，不同的菌株有不同的容忍限度。但笔者首次揭示在同一质粒与宿主体系中，尽管每一个细胞中所含质粒的大小与拷贝数不同，但数据的统计学处理表明，所有细胞中的质粒DNA的总数(质粒分子量bp×拷贝数)总是基本相等的。这说明尽管所有的质粒都通过自身存在的负反馈机制在起始步骤调节自身复制[12～15]，宿主染色体似乎还通过某些机制，对质粒等染色体外DAN分子在胞内的存在进行控制。染色体上这一未知的控制系统有可能通过限制这些游离DNA分子的总量来控制其存在，并维持其自身的生存与正常的生命周期。根据本实验数据推测，在相同的培养条件下，同一菌株(遗传背景相同的菌株)宿主单个细胞中的质粒DNA总量在一定程度上是一个相对的被限制的常数。这说明宿主对允许存在于其内部的外源DNA的数量的控制达到了极其精确的整齐划一的程度。当某些因素引起宿主染色体失去对染色体外DNA合成数量的控制时，超负荷的异源DNA分子可能对宿主细胞产生毒副作用。确定宿主限制质粒DNA总量的可能机制，有助于认识烈性病毒在细胞中的感染、复制，且最终导致细胞破裂死亡的机制，并能进一步理解宿主染色体和染色体外DNA分子的相互关系。
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基金项目：国家高技术研究发展计划项目(863项目，102-08-02-02)资助 Supported by the
National High Technology Research and Development Program(102-08-02-02)；
作者简介：卢圣栋 Corresponding author Tel:01065295905,Fax:01065124876,E-mail:lusd@cdm.imicams.ac.cn
作者单位：洪梅(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北 京 100005)
陈伟京(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北 京 100005)
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李丹(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北 京 100005)
卢圣栋(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北 京 100005)
参考文献：
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摘 要：目的 确定在一个表达质粒载体上串联目的操纵子以提高目的蛋白表达量的可行性，阐明宿主细胞 对胞内质粒DNA总量调控的可能机制。方法 亚克隆构建操纵子正向串联的表达载体；SDS凝胶电泳和激光扫描测定目的蛋白表达量； 3H-TdR掺入法测定质粒拷贝数。 结果 构建两组质粒：CW11系列分别含1～4个正向操纵子；CW12系列分别含1～3个正向操纵子。在 未诱导时，操纵子的串联不影响宿主大肠杆菌的生长；温度诱导表达后，CW11系列目的蛋白 表达量分别为菌体总蛋白的46.0%、54.8%、56.1%和60.1%，CW12系列目的蛋白表达量分 别为菌体总蛋白的33.5%、44.0%和47.1%。两组质粒的拷贝数均随操纵子串联个数的增加 而减少，但目的基因的总剂量随之增加。实验数据同时表明，在相同的培养条件下，同一菌 株每个宿主细胞内的质粒DNA总量被限制在一定范围内。结论 操纵子串联增加了目的基因的剂量，从而提高了目的基因在大肠杆菌中的表达水平。另外， 质粒大小和其拷贝数呈负相关，在同一培养条件下，对于特定的大肠杆菌菌株，宿主细胞内 质粒DNA总量在一定程度上是一个相对的被限定的常数。
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关键词：操纵子 基因剂量 原核表达 质粒拷贝数 质粒DNA的限制 性常数
稳定存在于大肠杆菌(E.coli)中的高拷贝质粒，是在E.coli中获得外源基因高表达的常用载体。一般而言，质粒载体的高拷贝数常与目的基因的剂量相对应。许多报道表明，质粒拷贝数的增加可使目的蛋白产量提高，这种相应的关系甚至在质粒拷贝数大于300时还存在[1]。然而，在正常情况下，特定的表达质粒在某一宿主中的拷贝数不是可以无限增加的，从而使基因剂量的增加受到限制。将外源基因串联在强启动子下进行表达，是增加基因剂量的一种方法[2～5]。Shen等[2]首先通过目的基因自身串联来增加产物的稳定性；并有效地利用细胞代谢能力，提高目的蛋白的产量。Lennick等[3]曾构建了含8个串联重复心钠素(ANP)基因的表达载体，在增加产物稳定性的基础上，充分利用菌体提供的tRNA和核糖体来尽可能高水平合成目的蛋白，提高了ANP的产量。然而，在表达天然基因产物时，基因的串联对连接点的要求较高，需要考虑目的蛋白氨基酸组成，选择合适的内肽酶以避免把目的蛋白切碎，而且需要避免在目的蛋白两端留下多余残基。此外，串联产物在切割时很难形成单一的目的产物，很可能获得不同串联长度的产物，给后期纯化带来一定的困难，而非天然单体的混合物在相应的药理与毒理研究中不能使用。本研究提出一种操纵子串联的策略，它可以克服上述方法的弱点。该方法把包括目的蛋白编码序列及强启动子、SD序列、转录终止子等调控序列的整个操纵子正向重复克隆在同一质粒表达载体上，以期增加目的基因的剂量，提高目的蛋白的表达水平。本研究组过去曾将表达质粒pLY1(5.5kb)中包括PL-SD-Ref-(α-hANP)-rrnBT1T2的长2.2kb的全套操纵子重复克隆到同一质粒中，得到了含2个操纵子和4个操纵子的表达质粒。结果表明，该方法有效地提高了目的蛋白的表达水平[6]。为了进一步证实该方法的可行性，本实验室构建了一系列含不同串联个数操纵子的表达质粒，以进一步确定操纵子重复克隆对提高表达水平的作用。
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关于E.coli中质粒复制的调控机制已有较广泛的研究，很多质粒自身反馈调控机制已被阐明[7，8]。一些以往的工作表明，E.coli宿主对质粒拷贝数存在耐受上限[6]，不同菌株的极限水平不一样。逃逸性突变的质粒在宿主中的复制失去控制，当其拷贝数超过宿主耐受极限时，会对细胞产生毒副作用[9～11]。为了明确串联操纵子对宿主生长的影响，本实验对所构建的各质粒在宿主中的DNA总量进行了分析，结果表明在同样的培养条件下，不同大小的质粒分别在每个菌体细胞中的DNA总量被限制在一定范围内，计算表明，该总量为一相对的被限定的常数。
材料和方法
菌株 E.coli DH5α:[snp E44 △Lac U169(Φ80 Lac Z △M15)hsd R 17 rec A1 end A1 gyr A 96 thi-1 rel A1 deo R]
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质粒 pCW111:本室构建的高效表达融合蛋白Ref-ANP的质粒，携带目的操纵子，其中含PL启动子、SD序列、Ref-th-ANP编码序列和下游终止序列T1T2。pCW121:含PL启动子、SD序列、DFP3(IL2-ad-ANP)融合基因和下游终止序列T1T2。
质粒构建和表达水平的比较 位于初始质粒pCW111和pCW121中的目的操纵子用EcoRV和SspI切出后插入初始载体的EcoRV位点，使整个操纵子串联在一个质粒载体上，多次重复得到CW11和CW12两组载体。
将这些质粒分别转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落转化子，接种50 ml LB/Amp+液体培养基，于32℃振荡过夜，取培养液测定OD600，以相同OD600值按2%接种量接种500 ml新鲜LB/Amp+培养基，于32℃以250 r/min振荡培养，每2小时取样测定OD600，6h 以后每小时取样测定OD600，以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制曲线图。
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挑取含有这一系列质粒的DH5α单菌落接种于5 ml LB/Amp+液体培养基中，32℃振荡过夜，以尽可能相同的OD600值按2%接种量接种于5 ml LB/Amp+新鲜液体培养基，于32℃振荡至OD600约为0.6时，转至42℃继续振荡诱导4h，离心收集菌体，常规破菌，SDS-PAGE凝胶电泳分析，激光扫描比较所表达的融合蛋白在菌体总蛋白中的含量。
质粒拷贝数的测定 DH5α/pCW单菌落接种于5ml LB/Amp+，32℃振摇过夜，以相同OD600值按2%接种量转种于1 ml LB/Amp+，32℃振摇至OD600约为0.6时加入50 μl 3H-TdR,继续于32℃振摇3 h，6000 r/min离心收集菌体细胞，用TSB溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 8 .0，30mmol/L NaCl)洗涤菌体沉淀3次，加入100 μl冰预冷的SolⅠ(50 mmol/L Glucose, 25 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，10mmol/L EDTA，pH8.0)，混匀，避免剧烈振荡，加入200μ l SolⅡ(0.2mol/L NaOH,1% SDS)，颠倒混匀，冰上静置2 min，加入150 μl SolⅢ(3 mm ol/L K+，5 mmol/L Ac-)，混匀后于冰上放置5 min，12 000 r/min离心5 min，将上清吸入另一个Eppendorf管中，作为含质粒DNA的部分；沉淀加入300 μl溶解液(200 mmol/L T ris-HCl，pH8.0,1 mmol/L EDTA,1.5% SDS)，Vortex剧烈振荡至溶液清亮，此 为含菌体染色体DNA和蛋白的部分。分别将1/10体积的质粒部分和1/10体积染色体部分加入5 ml闪烁 液(100 ml二甲基亚砜中含0.4 g PPO和0.3 g POPOP)中，在液闪仪上计数，用以下公式计算质粒拷贝数：
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N=(Me×Cp)/(Me×Ce)
N：质粒拷贝数；Me:E.coli染色体分子量，这里以平均染色体长4.0×103 kb计算； Mp:质粒分子量；Cp:质粒Bq值；Ce：E.coli染色体Bq值。
结 果
含多个操纵子的质粒的构建 作为模型，图1显示了在初始载体上重复亚克隆构建含串联操纵子表达载体的过程。采用相同方法得到CW11系列和CW12系列两组表达质粒。CW11系列包括pCW111(含1×[PL-SD-Re f-ad.-ANP-T1T2])、pCW112(含2×[PL-SD-Ref-ad.-ANP-T1T2])、pCW113(含3×[PL-SD-Ref-ad.-ANP-T1T2])和pCW114(含4×[PL-SD-Ref-ad.-ANP-T1 T2])，其大小分别为5.475、7.751、10.007和12.263 kb；CW12系列包括pCW121(含1× [PL-SD-IL2-ad.-ANP-T1T2])、pCW122(含2×[PL-SD-IL2-ad.-ANP-T1T2 ])和pCW123(含3×[PL-SD-IL2-ad.-ANP-T1T2])，其大小分别为5.401、7.563 和9.725 kb。
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图1 操纵子重复克隆示意图
Fig 1 Model of construction strategy of plasmids containing tandemly linked ope rons
*nX:the number of operon in one plasmid;
→:one operon
含不同倍数操纵子的质粒对E.coli生长的影响 于32℃培养携带CW11系列的E.coli DH5α菌体，测定生长曲线，结果显示分别带有4种质粒的菌体，从OD600约为0.2时进入对数生长期，一直延续到OD600 2.2时进入平台期，4种菌体的生长基本同步，并且在平台期保持的时间基本相同(图2)。上述结果表明在没有诱导表达时，所构建质粒的复制及操纵子串联后外源基因的基础表达不会对E.coli菌体细胞的生长造成显著的影响。
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图2 携带CW11系列质粒的大肠杆菌DH5的生长比较
Fig 2 Growth of E.coli DH5α cells carrying four kind of plasmid in sereies respectively at 32℃
操纵子重复克隆对目的蛋白表达水平的影响 在比较含不同倍数操纵子的质粒在宿主中的表达水平时，严格控制温度诱导条件，尽可能使这些宿主细胞的生长状态一致。激光扫描结果表明，随着操纵子重复次数的增加，目的蛋白在菌体总蛋白中所占比例也相应增加(表1)。CW11系列中pCW111、pCW112、pCW113和pCW114表达的目的蛋白REF-ANP在菌体总蛋白中的含量分别从原来的46.0%明显提高到54.8%、56 .1%和60.1%(图3)；CW12系列中pCW121、pCW122和pCW123表达的目的蛋白IL2-ad-ANP分别为菌体总蛋白的33.5%、44.0%和47.1%(扫描图未附)。
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图3 携带CW11系列质粒E.coli DH5α表达融合蛋白Ref-ANP的激光扫描分析图
Fig 3 Laser scanning analysis of the expression of fusion protein Ref-ANP in E.coli
cells carrying 4 kind of plasmids of CW11 series respectively
a.DH5α/pCW111;b.DH5α/pCW112;c.DH5α/pCW113;d.DH5α/pCW114
表 1 含不同串联个数操纵子的质粒在大肠杆菌中的基因剂量和目的基因表达水平的比较
Table 1 Comparison of the expression level of plasmids containing different number of op eron
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Plasmids name
Plasmid copy
number
Number of operon
in one plasmid
Number of operon
in one E.coli cell
Percentage of desire
protein in total cell
proteins
, http://www.100md.com (%)
Increased level of
expression
(%)
pCW111
162
1
162
46.0
pCW112
124
2
248
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54.8*
19.1
pCW113
115
3
345
56.1*
22.0
pCW114
95
4
380
60.1*
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30.6
pCW121
101
1
101
33.5
pCW122
72
2
144
44.0△
31.3
pCW123
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58
3
174
47.1△
40.6
* P<0.05 compared with pCW111 group;△P<0.05 compared with pCW121 grou p 为了进一步理解操纵子串联提高表达水平的作用，测定这一系列质粒在E.coli中的拷贝数并计算每个宿主细胞中质粒DNA的总量。结果显示，随着质粒的增加，其拷贝数减少，但 每个系列中分别含有大小不同质粒的每一个细胞内的质粒DNA的总量保持在一定范围内(表2)，无显著性差异。数据表明单个菌体所含目的操纵子的总数仍有所增加，说明目的基因的剂量随操纵子的重复次数增加而增加。为了考察操纵子重复克隆对质粒稳定性的影响，将这两组质粒分别转化DH5α感受态细胞，挑取单菌落转化子，每隔2天传代1次，到第30代时，取单菌落诱导表达，结果显示表达水平基本不变(数据未附)，说明操纵子串联不影响质粒在E.coli宿主中的稳定性。
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表 2 大肠杆菌细胞中质粒DNA总量的比较
Table 2 Total Amount of Plasmid DNA(kb) in each E.coli cell
Plasmids type
Plasmid size(kb)
Plasmid copy number
Total amount of plasmid DN A(kb)
CW111
5.473
162
886.626
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CW112
7.751
124
961.124*
CW113
10.007
115
1150.805*
CW114
12.263
95
1164.985*
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CW121
5.401
101
545.501
CW122
7.563
72
544.536△
CW123
9.725
58
564.05△
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Total amount of plasmid DNA in host cell was counted as plasmid size multipl e plasmid copy number
* P>0.05 compored with pCW111 group;△P>0.05 compared with pCW121 group 讨 论
本研究结果表明，操纵子串联对宿主细胞无毒害作用，是行之有效的提高基因剂量的方法。与其它提高基因剂量的方法相比，操纵子串联法优点在于：不涉及对操纵子内部结构作碱基突变、核苷酸增减等任何修饰，而是将整个操纵子作为一个单元进行操作，技术简便，并能保持外源基因的天然结果。
在构建含有多个操纵子的表达质粒过程中，所使用的限制性内切酶SspⅠ和EcoRⅤ均产生平头末端，理论上可能产生同向和反向的串联操纵子，但在筛选过程中只得到了同向串联的亚克隆质粒，推测两个反向连接的操纵子DNA重复片段之间可能极易形成自身互补的发卡结构，对DNA的自身复制不利，导致这种质粒丢失。
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表1所列两个系列中的质粒大小均以相似的趋势递增，但尽管目的蛋白产量随单个细胞中操纵子数目的增加而增加，而这两个系列对应的产物增加程度却不相同。这可能是由于目的蛋白编码序列不同所致。从扫描图可以看出，操纵子在同一质粒上重复克隆后，伴随着目的蛋白含量的增加，菌体其它蛋白的含量有所减少，说明菌体的总蛋白量是有一定限度的，外源蛋白不可能无限制增加。当外源基因剂量增加到一定程度时，菌体中无更多的自由核糖体和氨基酸供成倍增加的外源mRNA完全翻译成蛋白质，致使目的产物合成的增长程度受到限制。由于本实验所选初始质粒的表达水平已经很高，菌体合成蛋白的能力已近最大，或者细胞对外源蛋白的耐受已近极限，因而目的基因表达水平提高的倍数与操纵子的重复倍数不一致。推测初始表达水平较低时，利用该方法提高表达的效果会更显著。
有研究表明，逃逸性质粒抑制宿主细胞的生长，甚至使细胞致死[9～11]。在本实验中，操纵子串联所带来的目的外源基因剂量的增加对宿主细胞的生长和质粒的稳定性没有影响。Haugan[9]曾报道存在一个宿主特异性的质粒拷贝数最大容忍限度，不同的菌株有不同的容忍限度。但笔者首次揭示在同一质粒与宿主体系中，尽管每一个细胞中所含质粒的大小与拷贝数不同，但数据的统计学处理表明，所有细胞中的质粒DNA的总数(质粒分子量bp×拷贝数)总是基本相等的。这说明尽管所有的质粒都通过自身存在的负反馈机制在起始步骤调节自身复制[12～15]，宿主染色体似乎还通过某些机制，对质粒等染色体外DAN分子在胞内的存在进行控制。染色体上这一未知的控制系统有可能通过限制这些游离DNA分子的总量来控制其存在，并维持其自身的生存与正常的生命周期。根据本实验数据推测，在相同的培养条件下，同一菌株(遗传背景相同的菌株)宿主单个细胞中的质粒DNA总量在一定程度上是一个相对的被限制的常数。这说明宿主对允许存在于其内部的外源DNA的数量的控制达到了极其精确的整齐划一的程度。当某些因素引起宿主染色体失去对染色体外DNA合成数量的控制时，超负荷的异源DNA分子可能对宿主细胞产生毒副作用。确定宿主限制质粒DNA总量的可能机制，有助于认识烈性病毒在细胞中的感染、复制，且最终导致细胞破裂死亡的机制，并能进一步理解宿主染色体和染色体外DNA分子的相互关系。
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基金项目：国家高技术研究发展计划项目(863项目，102-08-02-02)资助 Supported by the
National High Technology Research and Development Program(102-08-02-02)；
作者简介：卢圣栋 Corresponding author Tel:01065295905,Fax:01065124876,E-mail:lusd@cdm.imicams.ac.cn
作者单位：洪梅(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北 京 100005)
陈伟京(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北 京 100005)
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李丹(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北 京 100005)
卢圣栋(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室，北 京 100005)
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