细菌防护液对照射小鼠脾脏细胞生物学效应的影响
徐书显 王常有 马素娥 张凤云 王忠海 赵娟 左连富
摘 要：目的：探讨细菌防护液(BPL)与受照小鼠脾脏细胞生物学效应的关系。方法：应用流式细胞仪((FCM)检测细胞的凋亡指数和免疫参数(CD+4、CD+8、NK)。结果：BPL能够降低细胞凋亡率(P<0.01)，同时能够提高细胞的增殖率(P<0.05)。其作用机制可能与提高NK细胞活性和CD+4、CD+8数量有关。结论：本研究进一步证实，BPL对辐射损伤细胞有一定的保护作用，为临床应用提供科学数据。
关键词：细菌防护液 γ射线照射 脾脏细胞 流式细胞仪
随着医疗保健事业的发展，电离辐射源和放射性核素在医疗中的应用日益广泛，放射诊断与治疗的新技术、新设备不断出现，在提高疾病诊治水平的同时，也增加了人类受电离辐射照射剂量的负担，从而会引起对人体不同程度的辐射损伤。如何进行防护，已日益受到各界的普遍重视[1～2]。我们研制的细菌防护液就是其中的一种，初步证明，它能延长小鼠的存活率[3]。该项研究主要是采用流式细胞术(FCM)对小鼠脾脏细胞进行多参数的研究，为细菌防护液用于临床提供科学依据。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
1.1 细菌防护液(BPL) 其中含一定量的活的蕈状芽胞杆菌，该菌经中科院做过系统鉴定，并且无毒，无副作用，由本所提供。
1.2 实验动物 昆明种小鼠，体重(20±1.5)g，雌性，由河北省实验动物中心提供，达一级实验动物卫生标准。并随机分为正常对照组，单纯照射对照组，饲防护液A组和B组，每组6只。
1.3 给药方式 采取灌胃法，两个对照组分别给0.5ml的生理盐水，防护液A组和B组分别给0.5ml和0.25ml BPL，每天1次，照射前后各服药8天。
1.4 照射条件 60Coγ射线照射，剂量率为0.794Gy/min，总剂量3.5Gy，全身一次性照射。
1.5 脾脏细胞的制备 将小鼠断颈处死，取脾脏放入平皿中，加入少量PBS液，用剪刀将组织剪至匀浆状，再加入10mlPBS，用吸管取组织匀浆，通过100目网过滤，去除细胞碎片，再通过300目网过滤，去除细胞团块。最后将细胞以70%乙醇固定，即可进行细胞DNA荧光和免疫荧光标记染色，染色方法参照文献[4]。
, 百拇医药
1.6 流式细胞仪检测方法[4] 应用FACS-420型流式细胞仪(美国BD公司)进行检测，数据和图像输入HP-300 Consort30计算机，应用相应的程序软件分别进行资料处理。测定前以鸡戏细胞作为标准样品调整仪器的变异系数(CV)在5%以内，确保仪器的精度。上机后每份标本检测10000个细胞，所得数据采用t检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 BPL对细胞周期的影响 结果见表1。
表1 各组细胞周期的变化
组别
细胞周期分布(%)
Go/Gl
, 百拇医药 S
G2M
正常对照
78.97±5.24
10.58±3.33
10.45±2.10
单纯照射
82.35±1.47
7.92±0.67
9.37±1.69
防护液A
75.49±4.45**
, 百拇医药
11.79±3.26*
12.72±1.72*
防护液B
78.19±2.56*
8.66±0.98
13.15±1.58**
注：与单纯照射组比:*P<0.05，**P<0.01
表1显示，单纯照射组与给药组相比，两个给药组的Go/G1期细胞比例下降，而S、G2M期细胞比例均有不同程度的升高，表明BPL可促进脾脏细胞的分裂增殖，加速脾脏细胞的修复。但S期的防护液B组差别不显著。
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2.2 BPL对细胞周期中DNA含量的影响 结果见表2。
表2 细胞周期中DNA含量的测定
组别
细胞周期分布
Go/Gl
S
G2M
正常对照
60.00±1.73
70.00±1.73
111.33±4.16
, http://www.100md.com
单纯照射
60.33±1.53
70.67±1.53
111.67±3.06
防护液A
59.33±2.52
70.67±0.58
112.00±1.00
防护液B
58.00±1.00*
70.50±3.54
, 百拇医药 107.50±7.78
注：各期中每组之间:P>0.05
FCM应用最多的领域是肿瘤细胞DNA含量的定量研究，并发现DNA含量这一参量与肿瘤的恶性分级、预后、治疗等有一定的关系。表2结果显示，在每期的各组之间DNA含量差别不显著P>0.05。说明BPL没有致癌、致畸和致突变的作用。
2.3 BPL对细胞凋亡率和增殖率的影响 结果见表3。
表3 细胞凋亡率和增殖率测定(%)
组 别
凋亡率
增殖率
正常对照
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1.27±0.35**
21.03±5.43
单纯照射
9.37±1.96
17.65±2.36
防护液A
4.93±2.36**
24.51±4.98*
防护液B
3.30±1.41**
21.81±2.56*
, http://www.100md.com
注：与单纯照射组比:*P<0.05，**P<0.01
表3结果显示，经照射后，细胞的凋亡率明显增加，BPL对细胞的凋亡有一定保护作用，同时能够提高细胞的增殖率。
2.4 BPL对细胞亚群的影响 测定T细胞亚群的相对标记率，结果见表4。
表4 BPL与NK细胞和T细胞亚群的关系(%)
组别
NK
CD+4
CD+8
CD+4/CD+8
, 百拇医药
正常对照
21.37±1.07***
37.60±4.61**
26.07±1.70*
1.44±0.15**
单纯照射
13.00±1.15
28.83±1.96
23.93±0.61
1.20±0.07
防护液A
, 百拇医药
23.77±2.65***
36.00±1.65***
27.37±2.64*
1.32±0.08*
防护液B
27.45±3.32***
34.35±1.48***
26.55±1.34**
1.30±0.12*
, 百拇医药
注：与单纯照射组比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
表4结果显示，单纯照射组的NK细胞、CD+4和CD+8明显低于正常对照组，而BPL能显著地提高它们的活性。
3 讨 论
本次实验采用目前较先进的技术FCM，对经60Coγ射线照射和照射前后口服药物的小鼠脾脏细胞进行多参数定量分析。结果显示，BPL能显著地降低细胞的凋亡率，并能提高细胞的增殖率。从一个侧面可以说明BPL对辐射损伤有一定的防护作用。其作用机制可能与BPL能提高NK细胞活性和CD+4、CD+8的数量，从而提高了机体免疫能力和增强免疫调节功能及保护造血系统有关。众所周知，T淋巴细胞按表型不同可分为CD+4和CD+8两大亚群，它们均能分泌多种细胞因子，在机体中主要承担细胞免疫功能，同时协助和参与机体的体液免疫及免疫调节[5]，在抗感染、抗肿瘤、抗衰老和抗辐射等生命过程中发挥十分重要的作用。NK细胞对机体的免疫和造血系统也有重要的调节作用。T淋巴细胞对辐射最敏感，而NK细胞则有一定的辐射抗性。这两种细胞的数量及活性变化对被辐射机体的保护及恢复具有十分重要的意义。
, 百拇医药
作者简介：徐书显(19××～)，男
作者单位：徐书显 北京军区军事医学研究所，石家庄 050081
王常有 北京军区军事医学研究所，石家庄 050081
马素娥 北京军区军事医学研究所，石家庄 050081
张凤云 河北医科大学生物教研室
王忠海 河北医科大学生物教研室
赵 娟 河北医科大学生物教研室
左连富 河北医科大学生物教研室
参考文献
[1]江幼岷.辐射防护剂研究的进展及现状.中华放射医学与防护杂志，1995，15(3)：197.
, http://www.100md.com
[2]徐书显，时华富，张凤云.中药防治放射损伤的动物实验研究.河北中西医结合杂志，1998，7(1)：9.
[3]徐书显，张凤云，时华富，等.蕈状芽胞杆菌的特性及在辐射防护中的应用.中国微生态学杂志，1998，10(3)：155.
[4]左连富主编.流式细胞术与生物学.第2版，沈阳：辽宁科学技术出版社，1996.68～385.
[5]Subash S,Li L,Tim R.Cytokine-deficient CD+8 Tcl cells induced by lL-4.j Immunol,1997.159-606., http://www.100md.com
摘 要：目的：探讨细菌防护液(BPL)与受照小鼠脾脏细胞生物学效应的关系。方法：应用流式细胞仪((FCM)检测细胞的凋亡指数和免疫参数(CD+4、CD+8、NK)。结果：BPL能够降低细胞凋亡率(P<0.01)，同时能够提高细胞的增殖率(P<0.05)。其作用机制可能与提高NK细胞活性和CD+4、CD+8数量有关。结论：本研究进一步证实，BPL对辐射损伤细胞有一定的保护作用，为临床应用提供科学数据。
关键词：细菌防护液 γ射线照射 脾脏细胞 流式细胞仪
随着医疗保健事业的发展，电离辐射源和放射性核素在医疗中的应用日益广泛，放射诊断与治疗的新技术、新设备不断出现，在提高疾病诊治水平的同时，也增加了人类受电离辐射照射剂量的负担，从而会引起对人体不同程度的辐射损伤。如何进行防护，已日益受到各界的普遍重视[1～2]。我们研制的细菌防护液就是其中的一种，初步证明，它能延长小鼠的存活率[3]。该项研究主要是采用流式细胞术(FCM)对小鼠脾脏细胞进行多参数的研究，为细菌防护液用于临床提供科学依据。
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1 材料与方法
1.1 细菌防护液(BPL) 其中含一定量的活的蕈状芽胞杆菌，该菌经中科院做过系统鉴定，并且无毒，无副作用，由本所提供。
1.2 实验动物 昆明种小鼠，体重(20±1.5)g，雌性，由河北省实验动物中心提供，达一级实验动物卫生标准。并随机分为正常对照组，单纯照射对照组，饲防护液A组和B组，每组6只。
1.3 给药方式 采取灌胃法，两个对照组分别给0.5ml的生理盐水，防护液A组和B组分别给0.5ml和0.25ml BPL，每天1次，照射前后各服药8天。
1.4 照射条件 60Coγ射线照射，剂量率为0.794Gy/min，总剂量3.5Gy，全身一次性照射。
1.5 脾脏细胞的制备 将小鼠断颈处死，取脾脏放入平皿中，加入少量PBS液，用剪刀将组织剪至匀浆状，再加入10mlPBS，用吸管取组织匀浆，通过100目网过滤，去除细胞碎片，再通过300目网过滤，去除细胞团块。最后将细胞以70%乙醇固定，即可进行细胞DNA荧光和免疫荧光标记染色，染色方法参照文献[4]。
, 百拇医药
1.6 流式细胞仪检测方法[4] 应用FACS-420型流式细胞仪(美国BD公司)进行检测，数据和图像输入HP-300 Consort30计算机，应用相应的程序软件分别进行资料处理。测定前以鸡戏细胞作为标准样品调整仪器的变异系数(CV)在5%以内，确保仪器的精度。上机后每份标本检测10000个细胞，所得数据采用t检验进行统计学处理。
2 结 果
2.1 BPL对细胞周期的影响 结果见表1。
表1 各组细胞周期的变化
组别
细胞周期分布(%)
Go/Gl
, 百拇医药 S
G2M
正常对照
78.97±5.24
10.58±3.33
10.45±2.10
单纯照射
82.35±1.47
7.92±0.67
9.37±1.69
防护液A
75.49±4.45**
, 百拇医药
11.79±3.26*
12.72±1.72*
防护液B
78.19±2.56*
8.66±0.98
13.15±1.58**
注：与单纯照射组比:*P<0.05，**P<0.01
表1显示，单纯照射组与给药组相比，两个给药组的Go/G1期细胞比例下降，而S、G2M期细胞比例均有不同程度的升高，表明BPL可促进脾脏细胞的分裂增殖，加速脾脏细胞的修复。但S期的防护液B组差别不显著。
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2.2 BPL对细胞周期中DNA含量的影响 结果见表2。
表2 细胞周期中DNA含量的测定
组别
细胞周期分布
Go/Gl
S
G2M
正常对照
60.00±1.73
70.00±1.73
111.33±4.16
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单纯照射
60.33±1.53
70.67±1.53
111.67±3.06
防护液A
59.33±2.52
70.67±0.58
112.00±1.00
防护液B
58.00±1.00*
70.50±3.54
, 百拇医药 107.50±7.78
注：各期中每组之间:P>0.05
FCM应用最多的领域是肿瘤细胞DNA含量的定量研究，并发现DNA含量这一参量与肿瘤的恶性分级、预后、治疗等有一定的关系。表2结果显示，在每期的各组之间DNA含量差别不显著P>0.05。说明BPL没有致癌、致畸和致突变的作用。
2.3 BPL对细胞凋亡率和增殖率的影响 结果见表3。
表3 细胞凋亡率和增殖率测定(%)
组 别
凋亡率
增殖率
正常对照
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1.27±0.35**
21.03±5.43
单纯照射
9.37±1.96
17.65±2.36
防护液A
4.93±2.36**
24.51±4.98*
防护液B
3.30±1.41**
21.81±2.56*
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注：与单纯照射组比:*P<0.05，**P<0.01
表3结果显示，经照射后，细胞的凋亡率明显增加，BPL对细胞的凋亡有一定保护作用，同时能够提高细胞的增殖率。
2.4 BPL对细胞亚群的影响 测定T细胞亚群的相对标记率，结果见表4。
表4 BPL与NK细胞和T细胞亚群的关系(%)
组别
NK
CD+4
CD+8
CD+4/CD+8
, 百拇医药
正常对照
21.37±1.07***
37.60±4.61**
26.07±1.70*
1.44±0.15**
单纯照射
13.00±1.15
28.83±1.96
23.93±0.61
1.20±0.07
防护液A
, 百拇医药
23.77±2.65***
36.00±1.65***
27.37±2.64*
1.32±0.08*
防护液B
27.45±3.32***
34.35±1.48***
26.55±1.34**
1.30±0.12*
, 百拇医药
注：与单纯照射组比：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001
表4结果显示，单纯照射组的NK细胞、CD+4和CD+8明显低于正常对照组，而BPL能显著地提高它们的活性。
3 讨 论
本次实验采用目前较先进的技术FCM，对经60Coγ射线照射和照射前后口服药物的小鼠脾脏细胞进行多参数定量分析。结果显示，BPL能显著地降低细胞的凋亡率，并能提高细胞的增殖率。从一个侧面可以说明BPL对辐射损伤有一定的防护作用。其作用机制可能与BPL能提高NK细胞活性和CD+4、CD+8的数量，从而提高了机体免疫能力和增强免疫调节功能及保护造血系统有关。众所周知，T淋巴细胞按表型不同可分为CD+4和CD+8两大亚群，它们均能分泌多种细胞因子，在机体中主要承担细胞免疫功能，同时协助和参与机体的体液免疫及免疫调节[5]，在抗感染、抗肿瘤、抗衰老和抗辐射等生命过程中发挥十分重要的作用。NK细胞对机体的免疫和造血系统也有重要的调节作用。T淋巴细胞对辐射最敏感，而NK细胞则有一定的辐射抗性。这两种细胞的数量及活性变化对被辐射机体的保护及恢复具有十分重要的意义。
, 百拇医药
作者简介：徐书显(19××～)，男
作者单位：徐书显 北京军区军事医学研究所，石家庄 050081
王常有 北京军区军事医学研究所，石家庄 050081
马素娥 北京军区军事医学研究所，石家庄 050081
张凤云 河北医科大学生物教研室
王忠海 河北医科大学生物教研室
赵 娟 河北医科大学生物教研室
左连富 河北医科大学生物教研室
参考文献
[1]江幼岷.辐射防护剂研究的进展及现状.中华放射医学与防护杂志，1995，15(3)：197.
, http://www.100md.com
[2]徐书显，时华富，张凤云.中药防治放射损伤的动物实验研究.河北中西医结合杂志，1998，7(1)：9.
[3]徐书显，张凤云，时华富，等.蕈状芽胞杆菌的特性及在辐射防护中的应用.中国微生态学杂志，1998，10(3)：155.
[4]左连富主编.流式细胞术与生物学.第2版，沈阳：辽宁科学技术出版社，1996.68～385.
[5]Subash S,Li L,Tim R.Cytokine-deficient CD+8 Tcl cells induced by lL-4.j Immunol,1997.159-606., http://www.100md.com