异种肝移植免疫排斥反应中脾脏的作用
异种肝移植免疫排斥反应中脾脏的作用
谈景旺 姚和祥 杨甲梅 钱光相 吴孟超
摘要 目的：探讨脾脏在仓鼠到大鼠异种肝移植中的体液免疫、细胞免疫作用。方法：三袖套法建立仓鼠到大鼠原位肝移植模型，观察移植术后肝脏和脾脏的病理变化；采用补体介导的细胞毒实验检测异种肝移植术后血浆中抗仓鼠抗体滴度的变化；运用免疫组织化学的方法检测脾脏中大鼠抗体的产生、脾脏增殖细胞核抗原(PCNA)的表达；并观察环孢素A、环磷酰胺、切脾对移植术后生存时间及免疫排斥反应的影响。结果：异种肝移植术后免疫排斥反应发生时，脾脏急剧增大，边缘区明显增厚，产生大量抗体，血浆中抗体滴度显著增高，移植物遭受破坏。环磷酰胺可选择性抑制脾脏边缘区的增殖，明显降低血浆抗体滴度；切脾+环孢素A可抑制其免疫排斥反应，生存时间显著延长(P<0.01)，但延迟3d切脾则不能延长其生存时间(P>0.05)。结论：在异种肝移植免疫排斥反应中，介导体液免疫的抗体主要来源于脾脏边缘区的免疫细胞，术后3d即已到达免疫反应场所，在其细胞免疫中发挥重要作用。
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关键词：脾脏 异种移植，肝脏 细胞免疫 体液免疫
脾脏作为主要的外周免疫器官，占免疫系统总量的25%，在同种移植免疫排斥反应中，其重要的免疫作用已得到广泛的研究，而在异种移植中体液、细胞免疫的作用又如何呢目前缺乏较全面的了解。本实验在建立仓鼠到大鼠原位肝移植模型的基础上，从多方面探讨其在异种肝移植中的具体作用及机制。
材料与方法
一、动物肝移植模型的制作
1.实验动物：供体为仓鼠(上海计划生育研究所动物中心提供)，雌性，120～150g；受体为Wistar大鼠(中国科学院上海分院动物中心提供)，雄性，200～220g。
2.原位肝移植方法采用Harihara法[1]，并在此基础上稍加改进，简述如下：供体氯胺酮麻醉，腹部“+”字切口，游离肝周韧带及血管，肝动脉最后结扎，胆囊予以切除，经门静脉插管，用4℃乳酸盐溶液灌注。受体乙醚麻醉，切除受体肝脏，植入供肝，各血管袖套吻合，胆管内置管。
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二、实验分组
A组(对照组)：受体术后不行任何治疗；B组(切脾组)：术毕即切除脾脏；C组(环磷酰胺组)：术前7d给予环磷酰胺40mg/kg，肌注，每日1次；D组(切脾+环孢素A组)：在B组的基础上，术后给予环孢素A30mg/kg，肌注，每日1次；E组(环孢素A+延迟切脾组)：将切脾时间改为术后3d进行，环孢素A用法同D组。
三、血清学及组织学标本的收集
根据需要各组术后可断尾取血1ml，随后补液1ml，或处死动物后采取血样离心，取上层血清冷藏。另根据需要，术后不同时间或临死处死动物，取肝、脾组织冻存。
四、抗体滴度的测定
运用补体介导细胞毒实验检测异种移植术后抗体升高情况及切脾、环磷酰胺对其的影响。其具体步骤简述如下[2]：以供体仓鼠脾细胞为靶细胞，与移植后受体稀释血清混合培养并加入补体，以杀伤细胞>50%为阳性指征。
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五、普通组织学检查
主要观察各组移植肝及脾脏的病理变化。主要步骤为：取新鲜肝脾组织甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色。
六、免疫组织化学方法
1.脾脏PCNA的检测：参见ABC法[3]，一抗为兔抗大鼠PCNA单克隆抗体。
2.脾脏中大鼠抗体的检测：参见直接法，直接运用生物素化兔抗大鼠IgG单克隆抗体，通过染色系统直接染色。
结 果
1.各组生存时间：A组、B组、C组、E组中位生存时间分别为(7.2±0.5)d、(7.8±1)d、(7.5±1)d、(10±2)d，差异无显著性(P>0.05)；D组中位生存时间为(28±7)d，较其它组显著延长(P<0.01)。
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2.肝脏的病理变化：A、B、C、E组大致相同，术后3d，汇管区出现淋巴细胞浸润，肝组织轻度损害；术后5d，肝组织损害明显加重，肝间质及汇管区可见大量淋巴细胞浸润，直到术后7d动物死亡。而D组术后7d肝组织结构大致正常，无明显淋巴细胞浸润。
3.各组抗体滴度升高情况如图1。
注：A组(未治疗组)抗体逐日升高，致术后5d到达高峰；C组(环磷酰胺组)自然抗体滴度较未治疗组低，上升较平缓，显著低于A组。B组(切脾组)自然抗体滴度同A组，但上升缓慢，峰值较A组明显降低。
图1 异种肝移植术后A、B、C组的抗体滴度比较
4.脾脏的变化：(1)组织学的改变：A组术后2d脾脏迅速增大，至术后5d达到高峰，边缘区明显增厚；C组脾脏也增大，但边缘区变化不明显。(2)脾脏抗体的产生：正常的脾脏可见少量的抗体产生，A组术后3d脾脏边缘区抗体产生明显增加，至术后5d达到高峰，而C组术后脾脏抗体产生明显减少，与正常脾脏大致相似。(3)脾脏PCNA的表达：A组移植术后2d脾脏PCNA表达明显增高，至术后4～5d达到高峰，而正常脾脏仅可见少量的PCNA表达。
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讨 论
异种移植免疫排斥反应中，单核细胞、杀伤细胞、B细胞、T细胞等均参与免疫排斥反应，而这些免疫细胞正是脾脏所富含的，这说明脾脏在异种移植免疫排斥中的重要作用。
我们的实验结果显示：在异种肝移植免疫排斥反应中，脾脏急剧增殖，达5倍左右，脾脏边缘区显著增厚，血浆抗体滴度明显升高，而运用环磷酰胺选择性抑制脾脏边缘区增殖，可显著降低血浆中抗体的滴度，这说明脾脏是抗体的主要产生地，并且证实是通过边缘区产生的，与环磷酰胺能抑制外源性抗原引起的抗体分泌的结论相一致[4]。
脾脏除参与了体液免疫反应外，本研究还发现术后切脾并给予环孢素A可大大延长其生存时间，而延迟3d再切脾则不能延长其生存时间，这说明移植术后不久脾脏即已有免疫细胞到达移植排斥反应地点，参与免疫排斥反应。事实上，移植肝正是术后3d出现单核淋巴细胞浸润。
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总之，协调性异种肝移植中主要免疫障碍，体液、细胞免疫均与脾脏密切相关，其体液免疫主要通过脾脏产生抗体介导免疫损害作用；细胞免疫也与脾脏关系密不可分，但其具体机制有待进一步的研究。
作者单位：谈景旺(350001 福州，南京军区福州总医院普外科)
姚和祥(350001 福州，南京军区福州总医院普外科)
杨甲梅(第二军医大学东方肝胆外科医院)
钱光相(第二军医大学东方肝胆外科医院)
吴孟超(第二军医大学东方肝胆外科医院)
参考文献
[1]Harihara Y, Sanjo R, Idesuki Y, et al. A modified cuff technique for superhepatic vena cava anastomosis. Transplantation, 1992, 53:707-710.
, 百拇医药
[2]鄂征，主编. 组织培养技术. 第3版. 北京： 人民卫生出版社，1993.105-112.
[3]倪灿荣， 宋亚贵， 主编. 免疫组织化学实验新技术及应用. 北京： 北京科学技术出版社， 1993.248-250.
[4]Yasutomi DS, Bazin H, Ohtsuka S, et al. Mechanism of antibody production in hamster-to-rat concordant xenotransplantation: Establishment of a simple model using intravenous injection of concordant spenocytes. Transplant Proc, 1994, 26:1195-1196., 百拇医药
谈景旺 姚和祥 杨甲梅 钱光相 吴孟超
摘要 目的：探讨脾脏在仓鼠到大鼠异种肝移植中的体液免疫、细胞免疫作用。方法：三袖套法建立仓鼠到大鼠原位肝移植模型，观察移植术后肝脏和脾脏的病理变化；采用补体介导的细胞毒实验检测异种肝移植术后血浆中抗仓鼠抗体滴度的变化；运用免疫组织化学的方法检测脾脏中大鼠抗体的产生、脾脏增殖细胞核抗原(PCNA)的表达；并观察环孢素A、环磷酰胺、切脾对移植术后生存时间及免疫排斥反应的影响。结果：异种肝移植术后免疫排斥反应发生时，脾脏急剧增大，边缘区明显增厚，产生大量抗体，血浆中抗体滴度显著增高，移植物遭受破坏。环磷酰胺可选择性抑制脾脏边缘区的增殖，明显降低血浆抗体滴度；切脾+环孢素A可抑制其免疫排斥反应，生存时间显著延长(P<0.01)，但延迟3d切脾则不能延长其生存时间(P>0.05)。结论：在异种肝移植免疫排斥反应中，介导体液免疫的抗体主要来源于脾脏边缘区的免疫细胞，术后3d即已到达免疫反应场所，在其细胞免疫中发挥重要作用。
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关键词：脾脏 异种移植，肝脏 细胞免疫 体液免疫
脾脏作为主要的外周免疫器官，占免疫系统总量的25%，在同种移植免疫排斥反应中，其重要的免疫作用已得到广泛的研究，而在异种移植中体液、细胞免疫的作用又如何呢目前缺乏较全面的了解。本实验在建立仓鼠到大鼠原位肝移植模型的基础上，从多方面探讨其在异种肝移植中的具体作用及机制。
材料与方法
一、动物肝移植模型的制作
1.实验动物：供体为仓鼠(上海计划生育研究所动物中心提供)，雌性，120～150g；受体为Wistar大鼠(中国科学院上海分院动物中心提供)，雄性，200～220g。
2.原位肝移植方法采用Harihara法[1]，并在此基础上稍加改进，简述如下：供体氯胺酮麻醉，腹部“+”字切口，游离肝周韧带及血管，肝动脉最后结扎，胆囊予以切除，经门静脉插管，用4℃乳酸盐溶液灌注。受体乙醚麻醉，切除受体肝脏，植入供肝，各血管袖套吻合，胆管内置管。
, 百拇医药
二、实验分组
A组(对照组)：受体术后不行任何治疗；B组(切脾组)：术毕即切除脾脏；C组(环磷酰胺组)：术前7d给予环磷酰胺40mg/kg，肌注，每日1次；D组(切脾+环孢素A组)：在B组的基础上，术后给予环孢素A30mg/kg，肌注，每日1次；E组(环孢素A+延迟切脾组)：将切脾时间改为术后3d进行，环孢素A用法同D组。
三、血清学及组织学标本的收集
根据需要各组术后可断尾取血1ml，随后补液1ml，或处死动物后采取血样离心，取上层血清冷藏。另根据需要，术后不同时间或临死处死动物，取肝、脾组织冻存。
四、抗体滴度的测定
运用补体介导细胞毒实验检测异种移植术后抗体升高情况及切脾、环磷酰胺对其的影响。其具体步骤简述如下[2]：以供体仓鼠脾细胞为靶细胞，与移植后受体稀释血清混合培养并加入补体，以杀伤细胞>50%为阳性指征。
, http://www.100md.com
五、普通组织学检查
主要观察各组移植肝及脾脏的病理变化。主要步骤为：取新鲜肝脾组织甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色。
六、免疫组织化学方法
1.脾脏PCNA的检测：参见ABC法[3]，一抗为兔抗大鼠PCNA单克隆抗体。
2.脾脏中大鼠抗体的检测：参见直接法，直接运用生物素化兔抗大鼠IgG单克隆抗体，通过染色系统直接染色。
结 果
1.各组生存时间：A组、B组、C组、E组中位生存时间分别为(7.2±0.5)d、(7.8±1)d、(7.5±1)d、(10±2)d，差异无显著性(P>0.05)；D组中位生存时间为(28±7)d，较其它组显著延长(P<0.01)。
, 百拇医药
2.肝脏的病理变化：A、B、C、E组大致相同，术后3d，汇管区出现淋巴细胞浸润，肝组织轻度损害；术后5d，肝组织损害明显加重，肝间质及汇管区可见大量淋巴细胞浸润，直到术后7d动物死亡。而D组术后7d肝组织结构大致正常，无明显淋巴细胞浸润。
3.各组抗体滴度升高情况如图1。
注：A组(未治疗组)抗体逐日升高，致术后5d到达高峰；C组(环磷酰胺组)自然抗体滴度较未治疗组低，上升较平缓，显著低于A组。B组(切脾组)自然抗体滴度同A组，但上升缓慢，峰值较A组明显降低。
图1 异种肝移植术后A、B、C组的抗体滴度比较
4.脾脏的变化：(1)组织学的改变：A组术后2d脾脏迅速增大，至术后5d达到高峰，边缘区明显增厚；C组脾脏也增大，但边缘区变化不明显。(2)脾脏抗体的产生：正常的脾脏可见少量的抗体产生，A组术后3d脾脏边缘区抗体产生明显增加，至术后5d达到高峰，而C组术后脾脏抗体产生明显减少，与正常脾脏大致相似。(3)脾脏PCNA的表达：A组移植术后2d脾脏PCNA表达明显增高，至术后4～5d达到高峰，而正常脾脏仅可见少量的PCNA表达。
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讨 论
异种移植免疫排斥反应中，单核细胞、杀伤细胞、B细胞、T细胞等均参与免疫排斥反应，而这些免疫细胞正是脾脏所富含的，这说明脾脏在异种移植免疫排斥中的重要作用。
我们的实验结果显示：在异种肝移植免疫排斥反应中，脾脏急剧增殖，达5倍左右，脾脏边缘区显著增厚，血浆抗体滴度明显升高，而运用环磷酰胺选择性抑制脾脏边缘区增殖，可显著降低血浆中抗体的滴度，这说明脾脏是抗体的主要产生地，并且证实是通过边缘区产生的，与环磷酰胺能抑制外源性抗原引起的抗体分泌的结论相一致[4]。
脾脏除参与了体液免疫反应外，本研究还发现术后切脾并给予环孢素A可大大延长其生存时间，而延迟3d再切脾则不能延长其生存时间，这说明移植术后不久脾脏即已有免疫细胞到达移植排斥反应地点，参与免疫排斥反应。事实上，移植肝正是术后3d出现单核淋巴细胞浸润。
, http://www.100md.com
总之，协调性异种肝移植中主要免疫障碍，体液、细胞免疫均与脾脏密切相关，其体液免疫主要通过脾脏产生抗体介导免疫损害作用；细胞免疫也与脾脏关系密不可分，但其具体机制有待进一步的研究。
作者单位：谈景旺(350001 福州，南京军区福州总医院普外科)
姚和祥(350001 福州，南京军区福州总医院普外科)
杨甲梅(第二军医大学东方肝胆外科医院)
钱光相(第二军医大学东方肝胆外科医院)
吴孟超(第二军医大学东方肝胆外科医院)
参考文献
[1]Harihara Y, Sanjo R, Idesuki Y, et al. A modified cuff technique for superhepatic vena cava anastomosis. Transplantation, 1992, 53:707-710.
, 百拇医药
[2]鄂征，主编. 组织培养技术. 第3版. 北京： 人民卫生出版社，1993.105-112.
[3]倪灿荣， 宋亚贵， 主编. 免疫组织化学实验新技术及应用. 北京： 北京科学技术出版社， 1993.248-250.
[4]Yasutomi DS, Bazin H, Ohtsuka S, et al. Mechanism of antibody production in hamster-to-rat concordant xenotransplantation: Establishment of a simple model using intravenous injection of concordant spenocytes. Transplant Proc, 1994, 26:1195-1196., 百拇医药