RAPD反应条件的优化及在微生物分型中的应用
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国外医学流行病学传染病学分册 2000年2月第27卷第1期
RAPD反应条件的优化及在微生物分型中的应用
首都医科大学附属北京儿童医院(100045) 斯 悦(综述) 申阿东 杨永弘(审校)
摘 要 分子生物学技术已成功应用于菌属内菌株分型。基因型分型比表型分型更直接，可从根本上确定菌株遗传基础间的相互联系及变异。与聚合酶链反应(PCR)相结合的新的基因型分型方法日益受到欢迎，其中随机引物扩增多态性DNA(RAPD)正广泛应用于越来越多的微生物分型中，其以快速、简易、分辨力高等优点成为直接分析许多病原菌基因组、明确菌属间克隆来源的重要方法，尤其是用于临床爆发的研究中，但该方法对实验条件高度依赖，可重复性相对较低，本文对RAPD实验条件的控制及应用加以综述。
关键词：随机引物扩增多态性 分型
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1.原理
随机引物扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA Analysis,RAPD)是建立在聚合酶链反应基础上的新的检测基因组多态性的基因型分型方法[1，2]。采用不针对已知染色体的一条长约8～12个寡核苷酸片段为引物，在低退火温度下与基因组DNA两条链的多个非特异位点通过错配而复性，若相临退火处不大于几个kbp且位于不同股DNA，扩增反应即可发生，获得的基因组DNA指纹图可反映种系发育过程的相互联系及不同克隆间的差异。该方法目前已广泛应用于细菌、真菌、支原体等微生物的分型中。
微生物分型的目的在于：追踪传染源及可能的传播途径；确定同一病人反复感染是源于复发或再感染；明确某一菌株是否与某些临床表现相关，从而发现其独特的致病机制；增加我们对感染性疾病的流行病学的认识。总之，分型主要用以鉴别菌株间的差异而不是用以确定不同菌株间的关系[2]。
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分型体系的基本假设是一次爆发感染中所分离的菌株均来自同一亲代菌株(同一克隆)，因此与同一菌属内的非流行病学相关菌株相比，这些菌株具有一些共同特征，也即建立分型体系的基础。分型率、可重复性及分辨力是评价一分型方法必不可少的三项指标。RAPD是一种简单、快速、具有高度分辨力的分型方法，但由于使用了较低的退火温度，其可重复性仍是目前亟待研究的课题。
2.影响RAPD重复性的重要因素
2.1 引物
RAPD的一个显著的优点是可在模板DNA序列未知情况下任意设计引物，因而引物的选择成为RAPD分型成功的最主要的影响因素[2，3]。
2.1.1 引物序列及长度： 在较低的退火温度下，该因素并不是影响反应的主要指标扩增产物取决于模板DNA退火位点的数目及出现的频率。一些学者认为G+C的含量是评价扩增效率最有价值的指标[2]。最佳引物长度依赖于模板DNA，理论上长的引物较短的引物具有更高的分辨力，一般RAPD选用8～12个寡核苷酸为引物。研究显示，在耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的RAPD分型中，长于10个碱基的引物分型效果较好，在屎肠球菌分型中也发现这一情况。但反应中由于模板DNA的影响，并非引物越长分辨力越高。如白色念珠菌的研究显示，较短的引物与长于10个碱基的引物相比具有更高的分辨力[2]。
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2.1.2 引物浓度： RAPD反应中引物浓度随模板DNA浓度而定[4]。一般在RAPD反应中，10ngDNA与0.25μM引物可较稳定的产生预期的DNA片段,若引物浓度低于0.05μM无扩增反应发生,若大于0.5μM引物与模板DNA比值过高将降低反应的特异性而产生更多的较小的淡染色条带[2,5]。RAPD反应中，结合相同或不同长度多个引物的扩增结果分析可提高RAPD的分辨力[3，6]。
2.2 模板
2.2.1 模板的提取方法： Micheli等[7，8]比较了不同DNA提取方法对RAPD结果的影响。其研究表明，用标准酚-氯仿抽提法、玻璃粉吸附法、树脂法、微波法等不同方法处理DNA后进行PAPD反应，产生的DNA指纹图存在一定的差异。因而在应用RAPD时，模板DNA应采用同一方法制备，其结果才具有可比性。Abed等[8]认为，微波法提取革兰阴性球菌DNA较其他方法为优。许多学者认为，煮沸法作为一种DNA快速、简易的粗提方法适用于包括RAPD在内的多种扩增反应[9]；而Power[2]认为，单纯煮沸法在提取中存在染色体浓度的变化及染色体外DNA的污染等因素而不适用于RAPD。
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2.2.2 模板浓度： 模板浓度是获得具有重复性好指纹图的重要反应参数[9]。模板过量，造成引物相对缺乏而抑制扩增反应，使生成的条带减少而出现不同的指纹图。实验表明，模板DNA含量小于1ng时不能发生有效的扩增反应；低于10ng时则扩增后图谱变异很大。DNA在10～100ng的浓度内，任意一个给定浓度均可提供足够反应所需的可重复性[5，9]。
2.3 DNA聚合酶
在不同来源DNA聚合酶催化下的RAPD反应中，出现不同的DNA指纹图，表明DNA聚合酶对反应的影响[10，2]。Micheli等[6]认为这种差异源于不同酶的制备过程，与buffer缓冲液关系不大。在一些对照实验中，未加入模板DNA的反应系电泳后出现条带，这一现象在一些引物(多为一些广泛适用的引物)的反应中尤为明显，而在另一些引物的反应系中则无扩增发生，表明存在DNA聚合酶“自然”污染，但其对RAPD分型无影响[11]。
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2.4 镁离子浓度
RAPD分析时，一般需将镁离子浓度控制在大于2μM，低于此浓度会导致扩增条带的稳定性及可重复性较差，但并非镁离子浓度越高越好。当镁离子浓度超过2.0μM时，图谱无明显影响。在RAPD分析中，镁离子浓度一般控制在2.5μM[12]。
2.5 退火温度及循环参数
RAPD分型中为达到有效DNA扩增需要较低的退火温度(25℃～40℃)，当退火温度超过40℃时，许多引物的扩增反应将被抑制。尽管有研究显示某些短的引物可在55℃退火形成扩增产物，但大量研究显示，在65℃～80℃的退火温度下无扩增反应发生。高温抑制了引物退火及后继的延伸反应[2，3]。
循环次数对RAPD分析也有影响。大量研究表明，RAPD较佳的循环为45次，小于30个循环将丢失一些条带，而在30～50个循环范围内，循环次数对条带的数目及相对强弱无影响[3，5，13]。
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2.6 其他
与常规PCR相比，PAPD对扩增仪的要求较高。许多研究显示，不同实验室使用相同的扩增方法得到的PAPD指纹图不同[5，10]，表明不同的扩增仪对反应的影响，其中温度控制是一个重要因素。此外，DNA扩增产物电泳时间的长短也对结果有所影响。
总之，模板及引物浓度是影响重复性的最重要因素。为减少RAPD图谱的差异，模板浓度应控制在中等含量即大于10ng，引物浓度至少达到2.0μM[2,5]。由于RAPD采用较低的退火温度，退火处特异性较低，因而对实验条件的变化较常规PCR更为敏感。严格控制实验条件是获得可靠结果的前提。
3.RAPD在微生物分型中的应用
随着建立在PCR基础上的分子技术的快速发展，RAPD以其快速、简易、分辨力高等优点，已成为直接分析许多病原菌基因组、明确菌属间克隆来源的重要方法。其广泛用于白色念珠菌，幽门螺杆菌，奇异变形杆菌，荚膜组织胞浆菌等的分型中[14]，在对感染爆发的大样本研究中更具优势。
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3.1 细菌
Antonioolmos等[13]采用优化的RAPD技术对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的医院内感染进行流行病学研究，并与脉冲凝胶电泳法(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)比较。该研究对96株MRSA分型的结果基本一致，均可分为6个主要的不同基因型。尽管有报道认为，RAPD对MRSA的分辨力低于PFGE，但该研究表明，通过对模板、酶、引物、镁离子浓度、退火温度等反应条件的优化，完全可以得到与PFGE完全相关的分型结果。他们进而提出，在重症监护病房及外科病房MRSA的感染爆发的研究中，RAPD是一种分辨力高、重复性好并可靠的流行病学调查工具。法国Sonia等[3]从29条引物中筛选出4条引物对114株无乳链球菌进行RAPD分析，得到71个不同RAPD图谱，并与多位点酶电泳(Multilocus Enzyme Electrophoresis,MLEE)、核糖体分型及PFGE比较，进一步证实RAPD的分辨力、敏感性明显高于MLEE而与PFGE无明显差异，但可重复性稍差，同时还证实RAPD及PFGE可探知更细微的基因组信息。他们认为，与MLEE、核糖体分型及PFGE相比，快速简单的RAPD技术可用于检测围生期孕妇阴道及无症状新生儿胃液中分离的链球菌，即用于围生期筛查：特异的RAPD图谱或扩增条带可作为高危因素的指标。Cocconcelli等[15]在肠球菌的RAPD分析中得到粪链球菌、屎链球菌、嗜热链球菌的不同DNA指纹图。Carapetis等[16]利用RAPD技术对从脓疱病疱疹中分离的194株GAS进行分型均显示了RAPD技术在链球菌分型中的应用。
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在革兰阴性杆菌中，RAPD技术也被广泛应用。Adams等[17]对50例囊性纤维化病人痰中分离的252株铜绿假单胞菌进行分析，以研究该菌在囊性纤维化病人中的分布及对病情的影响。通过与PFGE的比较发现，PFGE可分辨RAPD型别内所不能分出的亚型，但对RAPD的有些型别有多次重复下不能显示图谱，可见这两种技术各有局限性，但RAPD无需复杂的DNA抽提及包埋等准备而更具吸引力。Athena等[18]利用PFGE、核糖体分型、噬菌体分型及RAPD法对29株肠炎沙门氏菌的分析中认为，RAPD是肠炎沙门氏菌在分子水平上简单、快速、有效的分型法。
3.2 真菌
有学者利用3条引物对13株荚膜组织胞浆菌的临床标本进行分型：引物R-1分为4型，R-2分为3型，用引物R-3产生的图谱则基本相同，表明了菌株间的同源性与北美菌株的差别。测定特异的RAPD扩增条带的DNA序列，进而合成新的PCR引物可鉴定出100%所测的荚膜组织胞浆菌参考菌株。Paul等[19]对23株熏烟色曲菌进行RAPD分析，认为缓冲液、引物浓度、循环参数和电泳时间对RAPD带谱有较大影响，进而影响所用引物的分辨力。
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3.3 其他
此外，RAPD也可用于支原体、衣原体、螺旋体和原虫的分型中
* * *
RAPD技术自1990年建立以来，在科研及临床实验室得到广泛应用，特别是在微生物分型的研究中具有诸多优点，占有重要地位。但由于该方法在分型中使用非特异的遗传位点未知的单一短核苷酸序列为引物，反应在较低退火温度下进行，对反应条件高度依赖，因此对RAPD反应条件的优化是获得稳定可靠分型的关键。
参考文献
1 John J et al.Pediatr Infect Dis J.1998;17(8):667～675
2 Power EGM.J Hosp Infect,1996;34(1):247～265
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3 Sonia C et al.J Clin Microbiol,1997;135(10):2573～2579
4 Muralidharan K et al.BioTechniqus,1993;14(3):362～363
5 Macpherson JM et al.Mol Cellular Probes,1993;7(1):293～299
6 Micheli MR et al.BioTechniques,1993;15(1):388～390
7 Micheli MR et al.Nucleic acid Res,1994;22(6):1921～1922
8 Abed Y et al.BioTechniques,1995;11(2):238～239
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9 Davin-Regli A et al.Res Microbiol,1995;146(1):561～568
10 Shierwater R et al.Nucleic Acids Res,1993;21(15):4647～4648
11 Meunier JR et al.Res Microbiol,1993;144(1):373～379
12 Ellsworth DL et al.BioTechniques,1993;14(2):214～217
13 Antonioolmos et al.J Clin Microbiol,1998;36(4):1128～1234
14 Michael DO et al.J Clin Microbiol,1999;37(6):1661～1669
, 百拇医药
15 Cocconcelli PS et al.Letters in Applied Microbiol,1995;21(6):376～379
16 Carapetis J et al.J Clinic Microbiol,1995;33(6):1471～1472
17 Adams C et al.J Infect,1998;37(2):515～518
18 Athona W et al.J Clin Microbiol,1996;34(4):870～876
19 Paule V et al.J Clin Microbiol.1996;34(10):2595～2597, 百拇医药
首都医科大学附属北京儿童医院(100045) 斯 悦(综述) 申阿东 杨永弘(审校)
摘 要 分子生物学技术已成功应用于菌属内菌株分型。基因型分型比表型分型更直接，可从根本上确定菌株遗传基础间的相互联系及变异。与聚合酶链反应(PCR)相结合的新的基因型分型方法日益受到欢迎，其中随机引物扩增多态性DNA(RAPD)正广泛应用于越来越多的微生物分型中，其以快速、简易、分辨力高等优点成为直接分析许多病原菌基因组、明确菌属间克隆来源的重要方法，尤其是用于临床爆发的研究中，但该方法对实验条件高度依赖，可重复性相对较低，本文对RAPD实验条件的控制及应用加以综述。
关键词：随机引物扩增多态性 分型
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1.原理
随机引物扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphic DNA Analysis,RAPD)是建立在聚合酶链反应基础上的新的检测基因组多态性的基因型分型方法[1，2]。采用不针对已知染色体的一条长约8～12个寡核苷酸片段为引物，在低退火温度下与基因组DNA两条链的多个非特异位点通过错配而复性，若相临退火处不大于几个kbp且位于不同股DNA，扩增反应即可发生，获得的基因组DNA指纹图可反映种系发育过程的相互联系及不同克隆间的差异。该方法目前已广泛应用于细菌、真菌、支原体等微生物的分型中。
微生物分型的目的在于：追踪传染源及可能的传播途径；确定同一病人反复感染是源于复发或再感染；明确某一菌株是否与某些临床表现相关，从而发现其独特的致病机制；增加我们对感染性疾病的流行病学的认识。总之，分型主要用以鉴别菌株间的差异而不是用以确定不同菌株间的关系[2]。
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分型体系的基本假设是一次爆发感染中所分离的菌株均来自同一亲代菌株(同一克隆)，因此与同一菌属内的非流行病学相关菌株相比，这些菌株具有一些共同特征，也即建立分型体系的基础。分型率、可重复性及分辨力是评价一分型方法必不可少的三项指标。RAPD是一种简单、快速、具有高度分辨力的分型方法，但由于使用了较低的退火温度，其可重复性仍是目前亟待研究的课题。
2.影响RAPD重复性的重要因素
2.1 引物
RAPD的一个显著的优点是可在模板DNA序列未知情况下任意设计引物，因而引物的选择成为RAPD分型成功的最主要的影响因素[2，3]。
2.1.1 引物序列及长度： 在较低的退火温度下，该因素并不是影响反应的主要指标扩增产物取决于模板DNA退火位点的数目及出现的频率。一些学者认为G+C的含量是评价扩增效率最有价值的指标[2]。最佳引物长度依赖于模板DNA，理论上长的引物较短的引物具有更高的分辨力，一般RAPD选用8～12个寡核苷酸为引物。研究显示，在耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的RAPD分型中，长于10个碱基的引物分型效果较好，在屎肠球菌分型中也发现这一情况。但反应中由于模板DNA的影响，并非引物越长分辨力越高。如白色念珠菌的研究显示，较短的引物与长于10个碱基的引物相比具有更高的分辨力[2]。
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2.1.2 引物浓度： RAPD反应中引物浓度随模板DNA浓度而定[4]。一般在RAPD反应中，10ngDNA与0.25μM引物可较稳定的产生预期的DNA片段,若引物浓度低于0.05μM无扩增反应发生,若大于0.5μM引物与模板DNA比值过高将降低反应的特异性而产生更多的较小的淡染色条带[2,5]。RAPD反应中，结合相同或不同长度多个引物的扩增结果分析可提高RAPD的分辨力[3，6]。
2.2 模板
2.2.1 模板的提取方法： Micheli等[7，8]比较了不同DNA提取方法对RAPD结果的影响。其研究表明，用标准酚-氯仿抽提法、玻璃粉吸附法、树脂法、微波法等不同方法处理DNA后进行PAPD反应，产生的DNA指纹图存在一定的差异。因而在应用RAPD时，模板DNA应采用同一方法制备，其结果才具有可比性。Abed等[8]认为，微波法提取革兰阴性球菌DNA较其他方法为优。许多学者认为，煮沸法作为一种DNA快速、简易的粗提方法适用于包括RAPD在内的多种扩增反应[9]；而Power[2]认为，单纯煮沸法在提取中存在染色体浓度的变化及染色体外DNA的污染等因素而不适用于RAPD。
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2.2.2 模板浓度： 模板浓度是获得具有重复性好指纹图的重要反应参数[9]。模板过量，造成引物相对缺乏而抑制扩增反应，使生成的条带减少而出现不同的指纹图。实验表明，模板DNA含量小于1ng时不能发生有效的扩增反应；低于10ng时则扩增后图谱变异很大。DNA在10～100ng的浓度内，任意一个给定浓度均可提供足够反应所需的可重复性[5，9]。
2.3 DNA聚合酶
在不同来源DNA聚合酶催化下的RAPD反应中，出现不同的DNA指纹图，表明DNA聚合酶对反应的影响[10，2]。Micheli等[6]认为这种差异源于不同酶的制备过程，与buffer缓冲液关系不大。在一些对照实验中，未加入模板DNA的反应系电泳后出现条带，这一现象在一些引物(多为一些广泛适用的引物)的反应中尤为明显，而在另一些引物的反应系中则无扩增发生，表明存在DNA聚合酶“自然”污染，但其对RAPD分型无影响[11]。
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2.4 镁离子浓度
RAPD分析时，一般需将镁离子浓度控制在大于2μM，低于此浓度会导致扩增条带的稳定性及可重复性较差，但并非镁离子浓度越高越好。当镁离子浓度超过2.0μM时，图谱无明显影响。在RAPD分析中，镁离子浓度一般控制在2.5μM[12]。
2.5 退火温度及循环参数
RAPD分型中为达到有效DNA扩增需要较低的退火温度(25℃～40℃)，当退火温度超过40℃时，许多引物的扩增反应将被抑制。尽管有研究显示某些短的引物可在55℃退火形成扩增产物，但大量研究显示，在65℃～80℃的退火温度下无扩增反应发生。高温抑制了引物退火及后继的延伸反应[2，3]。
循环次数对RAPD分析也有影响。大量研究表明，RAPD较佳的循环为45次，小于30个循环将丢失一些条带，而在30～50个循环范围内，循环次数对条带的数目及相对强弱无影响[3，5，13]。
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2.6 其他
与常规PCR相比，PAPD对扩增仪的要求较高。许多研究显示，不同实验室使用相同的扩增方法得到的PAPD指纹图不同[5，10]，表明不同的扩增仪对反应的影响，其中温度控制是一个重要因素。此外，DNA扩增产物电泳时间的长短也对结果有所影响。
总之，模板及引物浓度是影响重复性的最重要因素。为减少RAPD图谱的差异，模板浓度应控制在中等含量即大于10ng，引物浓度至少达到2.0μM[2,5]。由于RAPD采用较低的退火温度，退火处特异性较低，因而对实验条件的变化较常规PCR更为敏感。严格控制实验条件是获得可靠结果的前提。
3.RAPD在微生物分型中的应用
随着建立在PCR基础上的分子技术的快速发展，RAPD以其快速、简易、分辨力高等优点，已成为直接分析许多病原菌基因组、明确菌属间克隆来源的重要方法。其广泛用于白色念珠菌，幽门螺杆菌，奇异变形杆菌，荚膜组织胞浆菌等的分型中[14]，在对感染爆发的大样本研究中更具优势。
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3.1 细菌
Antonioolmos等[13]采用优化的RAPD技术对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的医院内感染进行流行病学研究，并与脉冲凝胶电泳法(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)比较。该研究对96株MRSA分型的结果基本一致，均可分为6个主要的不同基因型。尽管有报道认为，RAPD对MRSA的分辨力低于PFGE，但该研究表明，通过对模板、酶、引物、镁离子浓度、退火温度等反应条件的优化，完全可以得到与PFGE完全相关的分型结果。他们进而提出，在重症监护病房及外科病房MRSA的感染爆发的研究中，RAPD是一种分辨力高、重复性好并可靠的流行病学调查工具。法国Sonia等[3]从29条引物中筛选出4条引物对114株无乳链球菌进行RAPD分析，得到71个不同RAPD图谱，并与多位点酶电泳(Multilocus Enzyme Electrophoresis,MLEE)、核糖体分型及PFGE比较，进一步证实RAPD的分辨力、敏感性明显高于MLEE而与PFGE无明显差异，但可重复性稍差，同时还证实RAPD及PFGE可探知更细微的基因组信息。他们认为，与MLEE、核糖体分型及PFGE相比，快速简单的RAPD技术可用于检测围生期孕妇阴道及无症状新生儿胃液中分离的链球菌，即用于围生期筛查：特异的RAPD图谱或扩增条带可作为高危因素的指标。Cocconcelli等[15]在肠球菌的RAPD分析中得到粪链球菌、屎链球菌、嗜热链球菌的不同DNA指纹图。Carapetis等[16]利用RAPD技术对从脓疱病疱疹中分离的194株GAS进行分型均显示了RAPD技术在链球菌分型中的应用。
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在革兰阴性杆菌中，RAPD技术也被广泛应用。Adams等[17]对50例囊性纤维化病人痰中分离的252株铜绿假单胞菌进行分析，以研究该菌在囊性纤维化病人中的分布及对病情的影响。通过与PFGE的比较发现，PFGE可分辨RAPD型别内所不能分出的亚型，但对RAPD的有些型别有多次重复下不能显示图谱，可见这两种技术各有局限性，但RAPD无需复杂的DNA抽提及包埋等准备而更具吸引力。Athena等[18]利用PFGE、核糖体分型、噬菌体分型及RAPD法对29株肠炎沙门氏菌的分析中认为，RAPD是肠炎沙门氏菌在分子水平上简单、快速、有效的分型法。
3.2 真菌
有学者利用3条引物对13株荚膜组织胞浆菌的临床标本进行分型：引物R-1分为4型，R-2分为3型，用引物R-3产生的图谱则基本相同，表明了菌株间的同源性与北美菌株的差别。测定特异的RAPD扩增条带的DNA序列，进而合成新的PCR引物可鉴定出100%所测的荚膜组织胞浆菌参考菌株。Paul等[19]对23株熏烟色曲菌进行RAPD分析，认为缓冲液、引物浓度、循环参数和电泳时间对RAPD带谱有较大影响，进而影响所用引物的分辨力。
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3.3 其他
此外，RAPD也可用于支原体、衣原体、螺旋体和原虫的分型中
* * *
RAPD技术自1990年建立以来，在科研及临床实验室得到广泛应用，特别是在微生物分型的研究中具有诸多优点，占有重要地位。但由于该方法在分型中使用非特异的遗传位点未知的单一短核苷酸序列为引物，反应在较低退火温度下进行，对反应条件高度依赖，因此对RAPD反应条件的优化是获得稳定可靠分型的关键。
参考文献
1 John J et al.Pediatr Infect Dis J.1998;17(8):667～675
2 Power EGM.J Hosp Infect,1996;34(1):247～265
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3 Sonia C et al.J Clin Microbiol,1997;135(10):2573～2579
4 Muralidharan K et al.BioTechniqus,1993;14(3):362～363
5 Macpherson JM et al.Mol Cellular Probes,1993;7(1):293～299
6 Micheli MR et al.BioTechniques,1993;15(1):388～390
7 Micheli MR et al.Nucleic acid Res,1994;22(6):1921～1922
8 Abed Y et al.BioTechniques,1995;11(2):238～239
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9 Davin-Regli A et al.Res Microbiol,1995;146(1):561～568
10 Shierwater R et al.Nucleic Acids Res,1993;21(15):4647～4648
11 Meunier JR et al.Res Microbiol,1993;144(1):373～379
12 Ellsworth DL et al.BioTechniques,1993;14(2):214～217
13 Antonioolmos et al.J Clin Microbiol,1998;36(4):1128～1234
14 Michael DO et al.J Clin Microbiol,1999;37(6):1661～1669
, 百拇医药
15 Cocconcelli PS et al.Letters in Applied Microbiol,1995;21(6):376～379
16 Carapetis J et al.J Clinic Microbiol,1995;33(6):1471～1472
17 Adams C et al.J Infect,1998;37(2):515～518
18 Athona W et al.J Clin Microbiol,1996;34(4):870～876
19 Paule V et al.J Clin Microbiol.1996;34(10):2595～2597, 百拇医药