几丁糖庆大霉素药物释放系统的研究
陈爱民 侯春林 顾琪胜 张伟
摘 要：目的：研究几丁糖庆大霉素药物释放系统释放行为及临床应用疗效。 方法：以30只家兔为实验对象，采用体外、体内释放实验评价几丁糖庆大霉素缓释药缓释效果；临床上采用几丁糖庆大霉素缓释药治疗慢性骨髓炎18例,以术后切口愈合情况、临床表现和X线表现评定疗效。 结果：体外释放实验显示第1天释放量为926.7 μg/颗,其后下降并以4.0 μg.颗-1.d-1较低水平稳定释放,达25天以上；体内释放实验显示血药浓度峰值(0.92 μg/ml)在24 h出现；术后血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)值无增加；术后第8周,药棒周围骨组织中庆大霉素浓度仍在骨髓炎常见致病菌最小抑菌浓度(MIC)以上。临床应用18例患者均获随访，随访时间6～34个月，平均24.8个月。初期愈合率88.9%(16/18)，无复发。 结论：几丁糖庆大霉素缓释药具有较好体内外缓释作用,临床上对于治疗骨感染有应用前景。
, 百拇医药
关键词：庆大霉素类 壳多糖 骨髓炎 药物载体
慢性骨髓炎由于死腔、死骨形成而难以治疗,彻底病灶清除辅以局部应用抗生素被认为是行之有效的方法。局部应用抗生素的方法很多,但以局部药物释放系统(drug delivery system,DDS)最为简便有效。庆大霉素PMMA珠链是临床广为应用的一种DDS, 但需二期拔链。基于几丁糖良好的组织相容性和体内可降解吸收性[1,2]，且具有抑菌[3]、提高机体免疫机能[4]及缓解骨感染的作用[5]等,我们研制出几丁糖庆大霉素DDS[6]。本研究旨在进一步探讨几丁糖DDS缓释行为，总结临床应用的初步疗效。
材料与方法
一、实验材料
家兔30只,每只体重2.5～2.7 kg；几丁糖庆大霉素DDS药棒[6],庆大霉素含量为每颗8.19 mg,密封,60Co消毒；荧光偏振免疫测定仪(第二军医大学长海医院提供)，用于测定庆大霉素浓度。
, 百拇医药
二、体外释放试验
抽取3颗药棒,置入3个含5 ml 0.1 mol(pH=7.4)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)小瓶中,室温下浸泡24 h；取出试样,吸取浸出液,-20℃存放；用PBS液冲洗3次,更换PBS液,继续浸泡；按浸泡后第1、2、5、10、15、20、25天留取浸出液,荧光偏振免疫法测定庆大霉素浓度。
三、体内释放试验
1.药棒植入方法：随机将30只家兔分成10组,每组3只,麻醉后取仰卧位,取右胫骨结节为中心内侧纵形切口,切开皮肤皮下骨膜,在胫骨干骺端开窗,大小为15 mm×7 mm,刮除部分骨质及骨髓,以胫骨结节为中心点,自开窗口植入1颗药棒,开窗骨块回植后缝合骨膜及各层组织,术后动物分笼饲养。
2.血药浓度测定：随机抽取1组动物作为血药浓度测定对象,于术后30 min和1、2、6、12 h，1、2、4 d，1、2、3、4、6、8、10周，从耳缘静脉取血约0.3 ml,抗凝,1?000 r/min离心15 min,吸取上清液,-20℃存放待测。
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3.骨组织及血肿药物浓度测定：按药棒植入后1、2、4天，1、2、3、4、6、8、10周,处死各组动物,取出右侧胫骨,以离药棒两端1 cm处为中心点,在中心点两侧共0.5 cm宽度内,采取干骺端松质骨及骨干皮质骨标本,血肿标本取自距药棒边缘0.5 cm处的干骺端。粉碎骨标本,称骨粉50 mg,加入含有2 ml 0.1 mol/L (pH=7.4)的PBS试管中,振荡2 h,1?000 r/min离心15 min,吸取上清液,-20℃存放待测。取50 mg血肿,置于均浆器中,加入2 ml 0.1 mol/L(pH=7.4)的PBS中,充分匀浆振荡2 h,1?000 r/min离心15 min,吸取上清液,-20℃保存待测。
4.血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)测定：术前随机抽取1组动物，经耳缘静脉取血2 ml,测定BUN和Cr,作为对照组。留取1、2、3、4、6、8、10周处死各组动物的耳缘静脉血2 ml,测定BUN和Cr。
四、临床应用
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1.临床资料：1994年8月～1997年6月，我院采用病灶清除术和局部植入几丁糖庆大霉素DDS治疗了18例慢性骨髓炎患者，其中男12例，女6例；年龄16岁～52岁，平均年龄39.5岁；住院时间14天～30 d，平均19.2 d。病灶部位：股骨8例，胫骨7例，肱骨3例。每位患者DDS植入量为10～22粒，庆大霉素剂量81.9～180.4 mg，平均15粒,平均剂量为123 mg。对病灶广泛或慢性骨髓炎急性发作患者置负压引流并全身静脉应用抗生素5 d。
2.临床疗效评定标准：初期治愈标准包括：(1)切口14 d之内愈合；(2)无全身症状和局部疼痛；(3)X线片无进行性骨感染的表现；(4)窦道愈合。若有1项指标不符合即为手术失败。
结 果
一、体外释放试验
3个试样中庆大霉素均能从药棒向PBS中扩散,具有明显缓释作用。第1个24 h释放量最大,达926.7 μg/颗；第2天减少,但释放量仍较大,为157.1 μg/颗；第5天锐减为17.3 μg/颗,其后以较低浓度维持,第25天仍有4 μg/颗的释放量。
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二、体内释放试验
1.血药浓度：结果见表1。
表1 体内庆大霉素血药浓度(μg/ml，x±s)
时间(h)
血药浓度
时间(W)
血药浓度
0.5
0.12±0.07
1
0.03±0.05
1
, 百拇医药
0.29±0.11
2
0
2
0.36±0.15
3
0
6
0.55±0.24
4
0.09±0.16
12
0.61±0.18
, 百拇医药
6
0.44±0.32
24
0.95±0.21
10
0
48
0.16±0.15
96
0.08±0.09
2.骨组织及血肿中庆大霉素浓度：术后第1天离药棒0.5 cm处血肿、1 cm处皮质骨和松质骨中庆大霉素浓度分别为(62.0±18.9) μg/g、(40.38±19.41) μg/g、(29.78±7.83) μg/g，其后逐渐下降；第8周时,局部骨组织中庆大霉素浓度仍在金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)(2 μg/ml)[7]以上(图1)。
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图1 药棒植入后局部组织庆大霉素浓度的变化
3.血BUN和Cr：术后BUN、Cr值均无增加(表2)。
三、临床应用
16例患者获初期愈合，2例患者术后切口仍有渗液，分别于术后31 d和39 d愈合。经2年随访，无复发者。
表2 血BUN、Cr的浓度变化(x±s)
术后时间(W)
BUN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
1
6.4±1.0
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98.1±13.3
2
5.4±1.2
131.7±44.2
3
4.5±0.3
84.0±8.0
4
7.5±1.9
130.0±61.9
6
6.0±0.7
, 百拇医药 87.5±32.7
8
5.6±2.8
89.3±30.9
10
4.2±0.4
84.9±15.0
对照组
5.9±0.4
90.2±17.7
讨论 慢性骨髓炎难以治愈是由于死骨、死腔、窦道形成，为致病菌潜伏和繁殖提供良好的外环境[8]。清除病灶和血肿、消灭死腔以及应用有效抗生素是治疗慢性骨感染的基本措施。Mayberry-Carson等[9]观察到骨髓炎的致病菌能产生多糖蛋白复合物,易使细菌粘附于死骨上,并形成生物膜,使细菌潜伏在死骨内。Nickel等[10]的实验证实要杀灭潜伏在生物膜内细菌,局部抗生素浓度必须高于致病菌最低抑菌浓度许多倍。显然全身应用抗生素难以达到这样的治疗要求。局部应用抗生素的方法主要有局部直接注射法[11]、闭合灌注和吸引法[12]等。局部给药虽能增加病灶抗生素浓度,且全身浓度较低,但由于存在疗程长,操作繁琐等问题,临床应用受到一定限制。自从Wahlig等[13]研制成功庆大霉素PMMA珠链并应用于治疗骨髓炎后,这种DDS已被推广应用，其缺点是需二期拔链[14]，因此可吸收DDS亟待研究。
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本研究表明，几丁糖庆大霉素DDS具有较好体内、体外缓释作用，与庆大霉素珠链释放行为极相似,是一种具有初期释药量大、有效浓度维持时间长、血浓度低的良好DDS。DDS植入动物体内后6周庆大霉素血药浓度、局部组织浓度均有较小的第2次峰值。Wei等[15]在其实验研究中也观察到这种现象，推测这可能是几丁糖载体在术后4～6周出现脆裂,使DDS内部庆大霉素快速扩散而引起。当DDS植入体内后,距离DDS 1 cm以上局部骨组织中抗生素浓度高出致病菌MIC数10倍以上, 且有效杀菌浓度维持时间长达8周以上, 符合慢性骨髓炎需应用抗生素4～6周时限的要求。故在外科病灶清创术的残腔内植入几丁糖DDS，能达到杀灭死腔及潜伏于生物膜内细菌的目的,防止术后复发。载体几丁糖在体内被溶菌酶缓慢降解而吸收[1]，勿需二期取出。
本研究DDS植入动物体内后血浓度峰值为0.92 μg/ml,远低于肾毒性浓度12 μg/ml,术后血BUN和Cr值均无增加,提示肾功能正常，因此认为临床应用是安全的。
, 百拇医药
临床应用几丁糖DDS治疗慢性骨髓炎18例，初期愈合率88.9%(16/18)，无复发者，而且临床应用无不良反应。
本实验和临床研究结果表明，几丁糖庆大霉素缓释药具有简单、方便、安全，且无需二期取出载体的特点。临床初步应用于治疗骨感染是有效的，单独应用本DDS适用于慢性骨髓炎病变相对较局限的患者，对病灶广泛的慢性骨髓炎或伴急性发作患者，在应用本DDS时，建议配合全身应用有效的抗生素。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(38970714)
作者单位：陈爱民 200003 上海，第二军医大学长征医院骨科
侯春林 200003 上海，第二军医大学长征医院骨科
顾琪胜 200003 上海，第二军医大学长征医院骨科
, 百拇医药
张 伟 200003 上海，第二军医大学长征医院骨科
参考文献
[1]Yomota C,Komuro T,Kimura T. Study in the degradation of chitosan film by lysozyme and release of loaded chemicals.Yakugaku Zasshi，1990，110:442-448.
[2]Malette WG.Chitin in nature and technollogy.New York:Plenum Press，1986.430-442.
[3]Muzzarelli R,Tarsi R,Filippini O，et al.Antimicrobial properties of N-carboxybutyl chitosan.Antimicrob Agents Chemother，1990，34:2019-2023.
, 百拇医药
[4]Peluso G,Petillo O,Ranieri M，et al.Chitosan-mediated stimulation of macrophage function.Biomaterial，1994，15:1215.
[5]陈爱民，侯春林，屠开元，等.几丁糖抗生素凝胶预防骨感染的实验研究.第二军医大学学报，1997，18：452.
[6]陈爱民，侯春林，屠开元.几丁糖庆大霉素药物释放系统的研制及体外释放实验.中华骨科杂志，1997，17：591.
[7]Woods GL,Washington JA.Antibacterial susceptibility test,dilution and disk diffusion methods.In:Murray PR,ed.Manual of clinical microbiology.Washington: American Society Microbiology,1995.1327-1341.
, 百拇医药
[8]Kahn DS.The pathophysiology of bone infection.Clin Orthop，1973，(96):12.
[9]Mayberry-Carson KJ,Tober-Meyer B,Smith JK，et al.Bacterial adherence and glycocalyx formation in osteomyelitis experimentally induced with staphlococcus aureus.Infect Immun，1984，43:825-833.
[10]Nickel JC,Ruseska I,Wright JB，et al.Tobramycin resistance of pseudomonas aeruginosa cells growing as a biofilm on urinary catheter material. Antimicrob Agents Chemother，1985，27:619-624.
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[11]Grace EJ,Bryson V.Modern treatment of chronic osteomyelitis with topical detergent antibiotic therapy.Surg Gynecol Obstert，1950，91:333.
[12]Taylor AR,Maudsley RH.Instillation-suction technique in chronic osteomyelitis.J Bone Joint Surg(Br)，1970，52:88-92.
[13]Wahlig H,Dingledein E,Bergmann R,et al.The release of gentamicin from polymethylme-thacrylate beads-an experimental and pharmacokinetic study. J Bone Joint Surg(Br),1978,60:270-275.
[14]Walenkamp GH, Vree TB, van Rens TJ. Gentamicin-PMMA beads. pharmacokinetic and nephrotoxicological study.Clin Orthop,1986，(205):171-183.
[15]Wei G,Kotoura Y,Oka M,et al.A bioabsorbable delivery system for antibiotic treatment of osteomyelitis:the use of lactic acid pligomer as a carrier.J Bone Joint Surg(Br)，1991,73:246-252., 百拇医药
摘 要：目的：研究几丁糖庆大霉素药物释放系统释放行为及临床应用疗效。 方法：以30只家兔为实验对象，采用体外、体内释放实验评价几丁糖庆大霉素缓释药缓释效果；临床上采用几丁糖庆大霉素缓释药治疗慢性骨髓炎18例,以术后切口愈合情况、临床表现和X线表现评定疗效。 结果：体外释放实验显示第1天释放量为926.7 μg/颗,其后下降并以4.0 μg.颗-1.d-1较低水平稳定释放,达25天以上；体内释放实验显示血药浓度峰值(0.92 μg/ml)在24 h出现；术后血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)值无增加；术后第8周,药棒周围骨组织中庆大霉素浓度仍在骨髓炎常见致病菌最小抑菌浓度(MIC)以上。临床应用18例患者均获随访，随访时间6～34个月，平均24.8个月。初期愈合率88.9%(16/18)，无复发。 结论：几丁糖庆大霉素缓释药具有较好体内外缓释作用,临床上对于治疗骨感染有应用前景。
, 百拇医药
关键词：庆大霉素类 壳多糖 骨髓炎 药物载体
慢性骨髓炎由于死腔、死骨形成而难以治疗,彻底病灶清除辅以局部应用抗生素被认为是行之有效的方法。局部应用抗生素的方法很多,但以局部药物释放系统(drug delivery system,DDS)最为简便有效。庆大霉素PMMA珠链是临床广为应用的一种DDS, 但需二期拔链。基于几丁糖良好的组织相容性和体内可降解吸收性[1,2]，且具有抑菌[3]、提高机体免疫机能[4]及缓解骨感染的作用[5]等,我们研制出几丁糖庆大霉素DDS[6]。本研究旨在进一步探讨几丁糖DDS缓释行为，总结临床应用的初步疗效。
材料与方法
一、实验材料
家兔30只,每只体重2.5～2.7 kg；几丁糖庆大霉素DDS药棒[6],庆大霉素含量为每颗8.19 mg,密封,60Co消毒；荧光偏振免疫测定仪(第二军医大学长海医院提供)，用于测定庆大霉素浓度。
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二、体外释放试验
抽取3颗药棒,置入3个含5 ml 0.1 mol(pH=7.4)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)小瓶中,室温下浸泡24 h；取出试样,吸取浸出液,-20℃存放；用PBS液冲洗3次,更换PBS液,继续浸泡；按浸泡后第1、2、5、10、15、20、25天留取浸出液,荧光偏振免疫法测定庆大霉素浓度。
三、体内释放试验
1.药棒植入方法：随机将30只家兔分成10组,每组3只,麻醉后取仰卧位,取右胫骨结节为中心内侧纵形切口,切开皮肤皮下骨膜,在胫骨干骺端开窗,大小为15 mm×7 mm,刮除部分骨质及骨髓,以胫骨结节为中心点,自开窗口植入1颗药棒,开窗骨块回植后缝合骨膜及各层组织,术后动物分笼饲养。
2.血药浓度测定：随机抽取1组动物作为血药浓度测定对象,于术后30 min和1、2、6、12 h，1、2、4 d，1、2、3、4、6、8、10周，从耳缘静脉取血约0.3 ml,抗凝,1?000 r/min离心15 min,吸取上清液,-20℃存放待测。
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3.骨组织及血肿药物浓度测定：按药棒植入后1、2、4天，1、2、3、4、6、8、10周,处死各组动物,取出右侧胫骨,以离药棒两端1 cm处为中心点,在中心点两侧共0.5 cm宽度内,采取干骺端松质骨及骨干皮质骨标本,血肿标本取自距药棒边缘0.5 cm处的干骺端。粉碎骨标本,称骨粉50 mg,加入含有2 ml 0.1 mol/L (pH=7.4)的PBS试管中,振荡2 h,1?000 r/min离心15 min,吸取上清液,-20℃存放待测。取50 mg血肿,置于均浆器中,加入2 ml 0.1 mol/L(pH=7.4)的PBS中,充分匀浆振荡2 h,1?000 r/min离心15 min,吸取上清液,-20℃保存待测。
4.血尿素氮(BUN)和肌酐(Cr)测定：术前随机抽取1组动物，经耳缘静脉取血2 ml,测定BUN和Cr,作为对照组。留取1、2、3、4、6、8、10周处死各组动物的耳缘静脉血2 ml,测定BUN和Cr。
四、临床应用
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1.临床资料：1994年8月～1997年6月，我院采用病灶清除术和局部植入几丁糖庆大霉素DDS治疗了18例慢性骨髓炎患者，其中男12例，女6例；年龄16岁～52岁，平均年龄39.5岁；住院时间14天～30 d，平均19.2 d。病灶部位：股骨8例，胫骨7例，肱骨3例。每位患者DDS植入量为10～22粒，庆大霉素剂量81.9～180.4 mg，平均15粒,平均剂量为123 mg。对病灶广泛或慢性骨髓炎急性发作患者置负压引流并全身静脉应用抗生素5 d。
2.临床疗效评定标准：初期治愈标准包括：(1)切口14 d之内愈合；(2)无全身症状和局部疼痛；(3)X线片无进行性骨感染的表现；(4)窦道愈合。若有1项指标不符合即为手术失败。
结 果
一、体外释放试验
3个试样中庆大霉素均能从药棒向PBS中扩散,具有明显缓释作用。第1个24 h释放量最大,达926.7 μg/颗；第2天减少,但释放量仍较大,为157.1 μg/颗；第5天锐减为17.3 μg/颗,其后以较低浓度维持,第25天仍有4 μg/颗的释放量。
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二、体内释放试验
1.血药浓度：结果见表1。
表1 体内庆大霉素血药浓度(μg/ml，x±s)
时间(h)
血药浓度
时间(W)
血药浓度
0.5
0.12±0.07
1
0.03±0.05
1
, 百拇医药
0.29±0.11
2
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0.36±0.15
3
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0.55±0.24
4
0.09±0.16
12
0.61±0.18
, 百拇医药
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0.44±0.32
24
0.95±0.21
10
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48
0.16±0.15
96
0.08±0.09
2.骨组织及血肿中庆大霉素浓度：术后第1天离药棒0.5 cm处血肿、1 cm处皮质骨和松质骨中庆大霉素浓度分别为(62.0±18.9) μg/g、(40.38±19.41) μg/g、(29.78±7.83) μg/g，其后逐渐下降；第8周时,局部骨组织中庆大霉素浓度仍在金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度(MIC)(2 μg/ml)[7]以上(图1)。
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图1 药棒植入后局部组织庆大霉素浓度的变化
3.血BUN和Cr：术后BUN、Cr值均无增加(表2)。
三、临床应用
16例患者获初期愈合，2例患者术后切口仍有渗液，分别于术后31 d和39 d愈合。经2年随访，无复发者。
表2 血BUN、Cr的浓度变化(x±s)
术后时间(W)
BUN(mmol/L)
Cr(μmol/L)
1
6.4±1.0
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98.1±13.3
2
5.4±1.2
131.7±44.2
3
4.5±0.3
84.0±8.0
4
7.5±1.9
130.0±61.9
6
6.0±0.7
, 百拇医药 87.5±32.7
8
5.6±2.8
89.3±30.9
10
4.2±0.4
84.9±15.0
对照组
5.9±0.4
90.2±17.7
讨论 慢性骨髓炎难以治愈是由于死骨、死腔、窦道形成，为致病菌潜伏和繁殖提供良好的外环境[8]。清除病灶和血肿、消灭死腔以及应用有效抗生素是治疗慢性骨感染的基本措施。Mayberry-Carson等[9]观察到骨髓炎的致病菌能产生多糖蛋白复合物,易使细菌粘附于死骨上,并形成生物膜,使细菌潜伏在死骨内。Nickel等[10]的实验证实要杀灭潜伏在生物膜内细菌,局部抗生素浓度必须高于致病菌最低抑菌浓度许多倍。显然全身应用抗生素难以达到这样的治疗要求。局部应用抗生素的方法主要有局部直接注射法[11]、闭合灌注和吸引法[12]等。局部给药虽能增加病灶抗生素浓度,且全身浓度较低,但由于存在疗程长,操作繁琐等问题,临床应用受到一定限制。自从Wahlig等[13]研制成功庆大霉素PMMA珠链并应用于治疗骨髓炎后,这种DDS已被推广应用，其缺点是需二期拔链[14]，因此可吸收DDS亟待研究。
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本研究表明，几丁糖庆大霉素DDS具有较好体内、体外缓释作用，与庆大霉素珠链释放行为极相似,是一种具有初期释药量大、有效浓度维持时间长、血浓度低的良好DDS。DDS植入动物体内后6周庆大霉素血药浓度、局部组织浓度均有较小的第2次峰值。Wei等[15]在其实验研究中也观察到这种现象，推测这可能是几丁糖载体在术后4～6周出现脆裂,使DDS内部庆大霉素快速扩散而引起。当DDS植入体内后,距离DDS 1 cm以上局部骨组织中抗生素浓度高出致病菌MIC数10倍以上, 且有效杀菌浓度维持时间长达8周以上, 符合慢性骨髓炎需应用抗生素4～6周时限的要求。故在外科病灶清创术的残腔内植入几丁糖DDS，能达到杀灭死腔及潜伏于生物膜内细菌的目的,防止术后复发。载体几丁糖在体内被溶菌酶缓慢降解而吸收[1]，勿需二期取出。
本研究DDS植入动物体内后血浓度峰值为0.92 μg/ml,远低于肾毒性浓度12 μg/ml,术后血BUN和Cr值均无增加,提示肾功能正常，因此认为临床应用是安全的。
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临床应用几丁糖DDS治疗慢性骨髓炎18例，初期愈合率88.9%(16/18)，无复发者，而且临床应用无不良反应。
本实验和临床研究结果表明，几丁糖庆大霉素缓释药具有简单、方便、安全，且无需二期取出载体的特点。临床初步应用于治疗骨感染是有效的，单独应用本DDS适用于慢性骨髓炎病变相对较局限的患者，对病灶广泛的慢性骨髓炎或伴急性发作患者，在应用本DDS时，建议配合全身应用有效的抗生素。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(38970714)
作者单位：陈爱民 200003 上海，第二军医大学长征医院骨科
侯春林 200003 上海，第二军医大学长征医院骨科
顾琪胜 200003 上海，第二军医大学长征医院骨科
, 百拇医药
张 伟 200003 上海，第二军医大学长征医院骨科
参考文献
[1]Yomota C,Komuro T,Kimura T. Study in the degradation of chitosan film by lysozyme and release of loaded chemicals.Yakugaku Zasshi，1990，110:442-448.
[2]Malette WG.Chitin in nature and technollogy.New York:Plenum Press，1986.430-442.
[3]Muzzarelli R,Tarsi R,Filippini O，et al.Antimicrobial properties of N-carboxybutyl chitosan.Antimicrob Agents Chemother，1990，34:2019-2023.
, 百拇医药
[4]Peluso G,Petillo O,Ranieri M，et al.Chitosan-mediated stimulation of macrophage function.Biomaterial，1994，15:1215.
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