HLA-DR抗原在结肠癌组织中的表达及其意义
沈文律 夏仁品
摘 要 目的：探讨HLA-DR在结肠癌组织及正常结肠上皮中的表达及其意义。方法：采用免疫组织化学ABC法检测32例结肠癌和正常结肠上皮组织中HLA-DR的表达情况，分析其表达水平与结肠癌Dukes分期的关系。数据处理采用多个样本率的χ2检验。结果：34.3%的结肠癌及93%的正常结肠上皮组织表达HLA-DR，且结肠癌中表达的阳性率随其病程发展而降低，在不同Dukes分期之间的阳性率差异有显著意义(χ2＝6.24,P<0.05)。结论：HLA-DR可能作为结肠癌发生发展不同时期的一个标志物，参与抗癌免疫应答。
关键词：结肠肿瘤 HLA-DR抗原 免疫组织化学
HLA-DR是人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ类分子的主要抗原之一。正常情况下，它仅分布于抗原递呈细胞如巨噬细胞、树突状细胞、郎罕细胞、B淋巴细胞和活化的T细胞等细胞表面。据报道[1]，肿瘤细胞中常出现 HLA-DR表达，其阳性率与肿瘤的进展和预后密切相关。但对于 HLA-DR在结肠癌中的表达情况，及其与结肠癌病程演进之间的关系研究甚少，在正常结肠上皮的表达情况尚存争议。本组采用免疫组织化学染色技术，检测32例结肠癌及正常结肠组织中 HLA-DR的表达情况，并分析其表达与结肠癌病程演进的关系及意义。
, 百拇医药
资料与方法
一、标本来源
我院1996～1997年收治结肠癌患者85例，从中抽签选取32例结肠癌患者进行研究。其中男21例，女11例，年龄31～72岁。Dukes分期A、B、C期者分别为6例、18例、8例。取患者自身的癌组织，距结肠癌肿旁5～10 cm的正常结肠粘膜标本做对照。切取新鲜标本后立即液氮冻存，备用。
二、抗体和主要试剂
鼠抗人 HLA-DR单克隆抗体为美国 ZYMED公司产品。免疫组化 ABC试剂盒为华美生物工程公司产品。
三、免疫组织化学检测(avidin-biotin-complex,ABC法)
检测方法参照文献[2]。8 μm冰冻切片用冷丙酮固定10 min，3%过氧化氢甲醇液 37℃封闭20 min，加1%正常小牛血清 37℃孵育30 min。滴加鼠抗人 HLA-DR单克隆抗体湿盒内 37℃ 1～1.5 h，加生物素化的羊抗鼠IgG 37℃温育30 min。上述各步骤之间均经磷酸盐缓冲液(phosphate-buffer saline,PBS)充分振洗15 min。PBS洗后加底物液二氨基联苯胺显色，苏木素复染、脱水、透明、封片镜检。每次染色时均用PBS代替HLA-DR单克隆抗体作为阴性对照。
, 百拇医药
四、结果判断
结肠癌细胞膜或胞浆呈现棕黄色染色的判为阳性。若结肠癌细胞中被染成棕黄色的阳性细胞占5%以上者，则认为该病例为阳性，否则为阴性。每张切片均经2人双盲法阅片，观察结果一致后方可决定阴性或阳性。数据经多个样本率的χ2检验进行处理。
结果
1.组织形态：结肠癌上皮细胞胞膜或胞浆不着色，细胞核也不着色为阴性。但其间质成分中大部分组织细胞、淋巴细胞及血管内皮细胞被染成棕黄色，呈强阳性反应(图1)。而正常结肠上皮细胞胞浆或胞膜着色较强(图2)，呈现 HLA-DR阳性信号。
2.结肠组织中HLA-DR的染色结果：32例结肠癌组织中仅10例呈阳性染色，而32例正常结肠上皮有30例为阳性，两者对比差异有显著意义(χ2=4.122,P<0.05)。
, http://www.100md.com
3.结肠癌Dukes分期与HLA-DR表达关系：结肠癌Dukes A期者 6例中3例HLA-DR表达呈阳性；B期18例中阳性7例；而C期8例中仅1例呈阳性。随着癌病程的进展恶化，其阳性率呈阶梯状降低的趋势，各组间差异有显著意义(χ2=6.24,P<0.05)。
图1 结肠癌组织呈阴性染色；其间质中大部分组织细胞及淋巴细胞呈阳性染色ABC法 ×200 图2 正常结肠上皮细胞胞膜或胞浆被染成棕黄色，呈现HLA-DR阳性信号ABC法 ×400
讨论
MHC是人体细胞重要的表面抗原之一，在机体免疫应答及免疫调节过程中发挥着重要的作用。与正常机体细胞比较，癌细胞表面的MHC Ⅰ类分子表达下降，甚至缺如，而MHC Ⅱ类分子的表达增加。
MHC Ⅱ类分子在癌细胞的表达主要表现为HLA-DR的表达。以往研究发现，HLA-DR在乳腺癌、肝癌、鼻咽癌等多种癌组织中均有表达，但其阳性率较低，一般都小于50%。本研究结果显示，HLA-DR在结肠癌中表达的阳性率为34%，其数量与分布各有不同，与文献的报道结果相符[3]。结肠癌间质中部分组织细胞、淋巴细胞和血管内皮细胞都较强地表达HLA-DR，而与结肠癌组织是否表达HLA-DR无明显关系。
, 百拇医药
Andersen等[4]研究表明，分化程度低的结肠癌组织极少表达HLA-DR，而在分化程度高的结肠癌组织中HLA-DR的阳性率较高。本研究结果也证实HLA-DR在Dukes A期结肠癌组织中的表达高于B期和C期中的表达水平。
此外，Daar等[5]研究认为，正常结肠上皮不表达HLA-DR抗原。而本研究结果表明，HLA-DR在大多数正常结肠上皮中表达，其阳性率为93%，与Mayer和Shlien[6]研究结果相一致。有学者研究认为，这种差异可能是由于来源不明的免疫刺激因子的作用所致。因生理情况下，激素与γ-干扰素的作用可诱导出HLA-DR在结肠组织中表达。另外，Ma等[7]在进行γ-干扰素与HLA-DR表达调控基因或其产物相互作用的体外实验时发现，γ-干扰素能诱导正常细胞或癌细胞表达HLA-DR抗原。
目前对于HLA-DR在癌细胞中表达的机理尚无一致看法，主要有2种学说：(1)癌细胞刺激机体所产生的炎症反应使癌浸润性淋巴细胞释放多种细胞因子，后者可诱导癌细胞表达HLA-DR。(2)在癌发展过程中，HLA-DR基因的表达或者调控过程发生变化，使HLA-DR在癌细胞中由不表达变为表达，而成为在癌细胞发展早期过程中出现的一个标志物。在我们的研究中，未见癌细胞与炎症之间的明显关系，支持后一种学说。
, 百拇医药
许多研究表明[8]，表达MHCⅡ类分子的癌细胞，可在一定程度上活化癌浸润性淋巴细胞中MHCⅡ类分子限制性的CD4阳性T细胞，并产生多种细胞因子，从而使癌细胞能够在一定程度上参与免疫应答过程，由此能有效地杀伤MHCⅡ类分子表达阳性的癌细胞。但结肠上皮中表达的HLA-DR在抗原呈递，与作为辅助性T细胞介导细胞毒作用的限制因素方面其功能大小还有待进一步研究。
基金项目：广东省自然科学基金资助(970610)
作者单位：沈文律(汕头大学医学院附属第二医院外三科，515041)
夏仁品(汕头大学医学院附属第二医院外三科，515041)
参考文献
[1]Jackson PA, Green MA, Marks CG, et al. Lymphocyte subset infiltration patterns and HLA antigen status in colorectal carcinomas and adenomas. Gut, 1996, 38:85-91.
, http://www.100md.com
[2]杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1990,101-105.
[3]刘保安,粟占三,陈森林等.鼻咽癌细胞人白细胞DR抗原表达及其与临床病理和预后的关系.中华病理学杂志,1996,25:162-164.
[4]Andersen SN, Breivik J, Lovig T,et al.K-ras mutations and HLA-DR expression in large bowel adenomas. Br J Cancer,1996,74:99-108.
[5]Daar AS, Fuggle SV, Fabre JW, et al. The detailed distributions of MHC classⅡantigens in normal human organs. Transplatation,1984,38:293-298.
[6]Mayer L, Shlien R. Evidence for function of Ia molecules on gut epithelial cells in man. J Exp Med,1987,166:1471-1483.
[7]Ma XC, Hattori J, Kushima R, et al. Expression of HLA-class Ⅱ antigen in gastric carcinomas. Acta Oncol,1994,33:187-189.
[8]及和照,王惠芬.肿瘤细胞表面的MHC抗原.国外医学免疫学分册,1996,5:264-266., 百拇医药
摘 要 目的：探讨HLA-DR在结肠癌组织及正常结肠上皮中的表达及其意义。方法：采用免疫组织化学ABC法检测32例结肠癌和正常结肠上皮组织中HLA-DR的表达情况，分析其表达水平与结肠癌Dukes分期的关系。数据处理采用多个样本率的χ2检验。结果：34.3%的结肠癌及93%的正常结肠上皮组织表达HLA-DR，且结肠癌中表达的阳性率随其病程发展而降低，在不同Dukes分期之间的阳性率差异有显著意义(χ2＝6.24,P<0.05)。结论：HLA-DR可能作为结肠癌发生发展不同时期的一个标志物，参与抗癌免疫应答。
关键词：结肠肿瘤 HLA-DR抗原 免疫组织化学
HLA-DR是人类主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)Ⅱ类分子的主要抗原之一。正常情况下，它仅分布于抗原递呈细胞如巨噬细胞、树突状细胞、郎罕细胞、B淋巴细胞和活化的T细胞等细胞表面。据报道[1]，肿瘤细胞中常出现 HLA-DR表达，其阳性率与肿瘤的进展和预后密切相关。但对于 HLA-DR在结肠癌中的表达情况，及其与结肠癌病程演进之间的关系研究甚少，在正常结肠上皮的表达情况尚存争议。本组采用免疫组织化学染色技术，检测32例结肠癌及正常结肠组织中 HLA-DR的表达情况，并分析其表达与结肠癌病程演进的关系及意义。
, 百拇医药
资料与方法
一、标本来源
我院1996～1997年收治结肠癌患者85例，从中抽签选取32例结肠癌患者进行研究。其中男21例，女11例，年龄31～72岁。Dukes分期A、B、C期者分别为6例、18例、8例。取患者自身的癌组织，距结肠癌肿旁5～10 cm的正常结肠粘膜标本做对照。切取新鲜标本后立即液氮冻存，备用。
二、抗体和主要试剂
鼠抗人 HLA-DR单克隆抗体为美国 ZYMED公司产品。免疫组化 ABC试剂盒为华美生物工程公司产品。
三、免疫组织化学检测(avidin-biotin-complex,ABC法)
检测方法参照文献[2]。8 μm冰冻切片用冷丙酮固定10 min，3%过氧化氢甲醇液 37℃封闭20 min，加1%正常小牛血清 37℃孵育30 min。滴加鼠抗人 HLA-DR单克隆抗体湿盒内 37℃ 1～1.5 h，加生物素化的羊抗鼠IgG 37℃温育30 min。上述各步骤之间均经磷酸盐缓冲液(phosphate-buffer saline,PBS)充分振洗15 min。PBS洗后加底物液二氨基联苯胺显色，苏木素复染、脱水、透明、封片镜检。每次染色时均用PBS代替HLA-DR单克隆抗体作为阴性对照。
, 百拇医药
四、结果判断
结肠癌细胞膜或胞浆呈现棕黄色染色的判为阳性。若结肠癌细胞中被染成棕黄色的阳性细胞占5%以上者，则认为该病例为阳性，否则为阴性。每张切片均经2人双盲法阅片，观察结果一致后方可决定阴性或阳性。数据经多个样本率的χ2检验进行处理。
结果
1.组织形态：结肠癌上皮细胞胞膜或胞浆不着色，细胞核也不着色为阴性。但其间质成分中大部分组织细胞、淋巴细胞及血管内皮细胞被染成棕黄色，呈强阳性反应(图1)。而正常结肠上皮细胞胞浆或胞膜着色较强(图2)，呈现 HLA-DR阳性信号。
2.结肠组织中HLA-DR的染色结果：32例结肠癌组织中仅10例呈阳性染色，而32例正常结肠上皮有30例为阳性，两者对比差异有显著意义(χ2=4.122,P<0.05)。
, http://www.100md.com
3.结肠癌Dukes分期与HLA-DR表达关系：结肠癌Dukes A期者 6例中3例HLA-DR表达呈阳性；B期18例中阳性7例；而C期8例中仅1例呈阳性。随着癌病程的进展恶化，其阳性率呈阶梯状降低的趋势，各组间差异有显著意义(χ2=6.24,P<0.05)。
图1 结肠癌组织呈阴性染色；其间质中大部分组织细胞及淋巴细胞呈阳性染色ABC法 ×200 图2 正常结肠上皮细胞胞膜或胞浆被染成棕黄色，呈现HLA-DR阳性信号ABC法 ×400
讨论
MHC是人体细胞重要的表面抗原之一，在机体免疫应答及免疫调节过程中发挥着重要的作用。与正常机体细胞比较，癌细胞表面的MHC Ⅰ类分子表达下降，甚至缺如，而MHC Ⅱ类分子的表达增加。
MHC Ⅱ类分子在癌细胞的表达主要表现为HLA-DR的表达。以往研究发现，HLA-DR在乳腺癌、肝癌、鼻咽癌等多种癌组织中均有表达，但其阳性率较低，一般都小于50%。本研究结果显示，HLA-DR在结肠癌中表达的阳性率为34%，其数量与分布各有不同，与文献的报道结果相符[3]。结肠癌间质中部分组织细胞、淋巴细胞和血管内皮细胞都较强地表达HLA-DR，而与结肠癌组织是否表达HLA-DR无明显关系。
, 百拇医药
Andersen等[4]研究表明，分化程度低的结肠癌组织极少表达HLA-DR，而在分化程度高的结肠癌组织中HLA-DR的阳性率较高。本研究结果也证实HLA-DR在Dukes A期结肠癌组织中的表达高于B期和C期中的表达水平。
此外，Daar等[5]研究认为，正常结肠上皮不表达HLA-DR抗原。而本研究结果表明，HLA-DR在大多数正常结肠上皮中表达，其阳性率为93%，与Mayer和Shlien[6]研究结果相一致。有学者研究认为，这种差异可能是由于来源不明的免疫刺激因子的作用所致。因生理情况下，激素与γ-干扰素的作用可诱导出HLA-DR在结肠组织中表达。另外，Ma等[7]在进行γ-干扰素与HLA-DR表达调控基因或其产物相互作用的体外实验时发现，γ-干扰素能诱导正常细胞或癌细胞表达HLA-DR抗原。
目前对于HLA-DR在癌细胞中表达的机理尚无一致看法，主要有2种学说：(1)癌细胞刺激机体所产生的炎症反应使癌浸润性淋巴细胞释放多种细胞因子，后者可诱导癌细胞表达HLA-DR。(2)在癌发展过程中，HLA-DR基因的表达或者调控过程发生变化，使HLA-DR在癌细胞中由不表达变为表达，而成为在癌细胞发展早期过程中出现的一个标志物。在我们的研究中，未见癌细胞与炎症之间的明显关系，支持后一种学说。
, 百拇医药
许多研究表明[8]，表达MHCⅡ类分子的癌细胞，可在一定程度上活化癌浸润性淋巴细胞中MHCⅡ类分子限制性的CD4阳性T细胞，并产生多种细胞因子，从而使癌细胞能够在一定程度上参与免疫应答过程，由此能有效地杀伤MHCⅡ类分子表达阳性的癌细胞。但结肠上皮中表达的HLA-DR在抗原呈递，与作为辅助性T细胞介导细胞毒作用的限制因素方面其功能大小还有待进一步研究。
基金项目：广东省自然科学基金资助(970610)
作者单位：沈文律(汕头大学医学院附属第二医院外三科，515041)
夏仁品(汕头大学医学院附属第二医院外三科，515041)
参考文献
[1]Jackson PA, Green MA, Marks CG, et al. Lymphocyte subset infiltration patterns and HLA antigen status in colorectal carcinomas and adenomas. Gut, 1996, 38:85-91.
, http://www.100md.com
[2]杨景山主编.医学细胞化学与细胞生物.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1990,101-105.
[3]刘保安,粟占三,陈森林等.鼻咽癌细胞人白细胞DR抗原表达及其与临床病理和预后的关系.中华病理学杂志,1996,25:162-164.
[4]Andersen SN, Breivik J, Lovig T,et al.K-ras mutations and HLA-DR expression in large bowel adenomas. Br J Cancer,1996,74:99-108.
[5]Daar AS, Fuggle SV, Fabre JW, et al. The detailed distributions of MHC classⅡantigens in normal human organs. Transplatation,1984,38:293-298.
[6]Mayer L, Shlien R. Evidence for function of Ia molecules on gut epithelial cells in man. J Exp Med,1987,166:1471-1483.
[7]Ma XC, Hattori J, Kushima R, et al. Expression of HLA-class Ⅱ antigen in gastric carcinomas. Acta Oncol,1994,33:187-189.
[8]及和照,王惠芬.肿瘤细胞表面的MHC抗原.国外医学免疫学分册,1996,5:264-266., 百拇医药