大鼠肝脏缺血再灌注及低温保存过程中氧自由基变化的实验研究
自由基变化的实验研究
宋少伟 李先亮 刘永锋 梁健 刘树荣 何三光
摘 要 目的 观察大鼠肝脏缺血再灌注及低温保存过程中氧自由基的变化。方法 建立大鼠肝脏假手术、热缺血再灌注和原位肝移植模型，分别测定再灌注1 h和移植术后2 h下腔静脉血中超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)和血清中脂质过氧化物酶(LPO)的变化，并进行组织学观察。结果 术前30 min静脉注射别嘌醇或灌洗液及保存液中加别嘌醇的实验组大鼠，其全血中SOD的活力高于条件相同、但不给予别嘌醇的对照组，LPO及LDH的含量低于对照组，其各项测定值与假手术组比较，差异不显著；实验组和假手术组的大鼠肝组织病理改变均轻于对照组。结论 大鼠肝脏缺血再灌注及低温保存过程中氧自由基明显增加，并且造成肝脏的损害。
关键词：肝 再灌注损伤 大鼠 自由基
在肝移植过程中，低温保存及缺血再灌注产生氧自由基，导致肝组织损伤。本实验应用大鼠肝脏热缺血再灌注和原位肝移植模型，探讨供肝在低温保存及缺血再灌注后氧自由基和乳酸脱氢酶(LDH)的变化。
, 百拇医药
材料与方法
采用健康Wistar大鼠58只，体重250～350 g，均为雄性，随机编号分组如下：(1)假手术组(n=6)：只做肝脏游离，然后采取下腔静脉血，切取肝组织标本，固定，目的是作为正常对照，以排除手术因素对实验结果的影响；(2)对照组1(n=6)：术前30 min经阴茎背静脉注射生理盐水1.25 ml/kg，开腹后游离肝脏，阻断肝脏血液供应30 min，恢复血液供应后60 min采取下腔静脉血，切取肝组织标本，固定；(3)实验组1(n=6)：除术前30 min经阴茎背静脉注射别嘌醇50 mg/kg外，余均同对照组1；(4)对照组2(n=20)：每对大鼠互作供、受者，供肝切取后，用20 ml冷乳酸林格液灌洗，置4 ℃乳酸林格液中保存4 h，然后行异体原位肝移植，术后2 h采取下腔静脉血，切取肝组织标本，固定；(5)实验组2(n=20)：每对大鼠互作供、受者，灌洗液及保存液均用含别嘌醇1 mmol/L的乳酸林格液，其余同对照组2。上述各组按实验设计的时间在乙醚麻醉下开腹采取下腔静脉血，采血量3～4 ml，从中准确取出50 μl血放入装有生理盐水的离心管中，混匀，3 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀待测超氧化物歧化酶(SOD)活力；再从采血管中取1.0 ml血置入试管中摇匀，待测LDH；余下的血液静置3 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液测脂质过氧化物酶(LPO)；同时取肝尾叶组织制成光镜、电镜标本，于光镜和透射电镜下观察。
, 百拇医药
结 果
一、 各组大鼠血中SOD、LPO和LDH的测定结果(表1)
表1 5个组的SOD、LPO及LDH测定值(x±s)
组 别
n
SOD活力
(nU/g Hb)
LPO
(nmol/ml)
LDH
(IU/L)
假手术组
, 百拇医药
6
4 410.22±539.43
3.21±0.65
395.23±25.46
对照组1
6
3 125.24±920.80
7.25±1.15
410.55±20.54
实验组1
6
4 346.22±558.06
, 百拇医药
5.51±1.38
406.33±17.68
对照组2
20
2 567.34±702.29
6.18±1.82
578.89±23.79
实验组2
20
4 105.77±506.79
4.30±1.05
450.86±19.75
, 百拇医药
对照组1的SOD活力低于实验组1(P<0.05)和假手术组(P<0.05)，而LPO的含量高于实验组1(P<0.05)和假手术组(P<0.01)；LDH的含量3个组的差异不显著。对照组2的SOD活力低于实验组2(P<0.05) 和假手术组(P<0.01)，LPO及LDH的含量高于实验组2(P<0.05，P<0.05)和假手术组(P<0.01，P<0.05)。
二、肝脏组织学变化
1.光镜所见：对照组1及对照组2的大鼠肝细胞变性比较明显，胞体增大，胞浆透明、淡染，部分细胞膨大，肝窦内有炎性细胞浸润。实验组1及实验组2的大鼠大部分肝细胞形态正常，偶见肝细胞肿胀，胞浆内出现颗粒，提示轻度变性。假手术组的大鼠肝细胞形态基本正常。
2.电镜所见：对照组1及对照组2的大鼠肝细胞线粒体肿胀明显，大部分线粒体嵴被破坏，结构紊乱，甚至消失，呈空泡状，有的可见糖元颗粒增多，溶酶体增多。实验组1及实验组2的大鼠仅见肝细胞线粒体轻度肿胀，基质稍淡，偶见嵴减少，无嵴紊乱及消失现象，有的可见内质网轻度扩张。假手术组的大鼠肝细胞超微结构基本正常。
, 百拇医药
讨 论
肝脏在单纯复温而血液未再灌注之前就可受到氧自由基的损伤，自由基清除剂对预防热缺血损伤非常有效，其对于微循环的具体作用机制还不十分清楚。本实验中对照组的LPO含量均高于假手术组，说明氧自由基在肝脏缺血再灌注和低温保存后明显增多。氧自由基可以同细胞膜上的脂质发生过氧化反应，破坏细胞膜和线粒体膜的完整性，导致膜通透性增加，造成细胞内外离子失衡及细胞水肿变性，其组织形态学改变也证实了这一点。缺血再灌注损伤主要是肝窦内皮细胞受损，肝实质细胞损伤的程度轻于内皮细胞，所以在缺血再灌注早期，LDH的变化不明显。
别嘌醇是UW液的主要成分之一，是一种重要的外源性自由基清除剂，其作用机理是能够竞争性地抑制黄嘌呤脱氢酶转化成黄嘌呤氧化酶，在肝脏中黄嘌呤氧化酶是主要的氧自由基来源[1]，所以别嘌醇能够有效地减少氧自由基的生成，从而减少肝细胞的损害。Karwinski等[2]还提出，别嘌醇除上述减少氧自由基生成作用外，还能够促进ATP再合成，改善缺血时肝脏的能量代谢。本实验在热缺血前30 min通过外周静脉给予别嘌醇，或在保存液中加入别嘌醇，取得非常满意的效果。因为缺血后肝组织的损伤包括两个阶段：一是由于缺血造成的乏氧损伤，另一个是氧自由基介导的再灌注损伤，而氧自由基特别是超氧阴离子主要在这一阶段产生。本实验均是在再灌注之前施加处理因素，实验组的SOD活力较对照组强，说明清除超氧阴离子的能力增强，而LPO的减少则说明其脂质过氧化反应的程度也相应降低，对细胞的损伤减轻，LDH的变化也证实这一点。这些表明，术前30 min经外周静脉一次性给予供者别嘌醇和保存液中加入别嘌醇同样具有明显的抗氧自由基作用，并有方便快捷的优点。
, 百拇医药
作者单位：宋少伟(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
李先亮(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
刘永锋(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
梁健(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
刘树荣(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
何三光(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
参考文献
[1]唐伟松，钟守先. 氧自由基与缺血性损害. 中华外科杂志，1991，29:260-262.
[2]Karwinski W，Fakstad M，Ulvic R. Sixty-minute normothermic liver ischemia in rats. Transplantation，1991，52:231-234., 百拇医药
宋少伟 李先亮 刘永锋 梁健 刘树荣 何三光
摘 要 目的 观察大鼠肝脏缺血再灌注及低温保存过程中氧自由基的变化。方法 建立大鼠肝脏假手术、热缺血再灌注和原位肝移植模型，分别测定再灌注1 h和移植术后2 h下腔静脉血中超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)和血清中脂质过氧化物酶(LPO)的变化，并进行组织学观察。结果 术前30 min静脉注射别嘌醇或灌洗液及保存液中加别嘌醇的实验组大鼠，其全血中SOD的活力高于条件相同、但不给予别嘌醇的对照组，LPO及LDH的含量低于对照组，其各项测定值与假手术组比较，差异不显著；实验组和假手术组的大鼠肝组织病理改变均轻于对照组。结论 大鼠肝脏缺血再灌注及低温保存过程中氧自由基明显增加，并且造成肝脏的损害。
关键词：肝 再灌注损伤 大鼠 自由基
在肝移植过程中，低温保存及缺血再灌注产生氧自由基，导致肝组织损伤。本实验应用大鼠肝脏热缺血再灌注和原位肝移植模型，探讨供肝在低温保存及缺血再灌注后氧自由基和乳酸脱氢酶(LDH)的变化。
, 百拇医药
材料与方法
采用健康Wistar大鼠58只，体重250～350 g，均为雄性，随机编号分组如下：(1)假手术组(n=6)：只做肝脏游离，然后采取下腔静脉血，切取肝组织标本，固定，目的是作为正常对照，以排除手术因素对实验结果的影响；(2)对照组1(n=6)：术前30 min经阴茎背静脉注射生理盐水1.25 ml/kg，开腹后游离肝脏，阻断肝脏血液供应30 min，恢复血液供应后60 min采取下腔静脉血，切取肝组织标本，固定；(3)实验组1(n=6)：除术前30 min经阴茎背静脉注射别嘌醇50 mg/kg外，余均同对照组1；(4)对照组2(n=20)：每对大鼠互作供、受者，供肝切取后，用20 ml冷乳酸林格液灌洗，置4 ℃乳酸林格液中保存4 h，然后行异体原位肝移植，术后2 h采取下腔静脉血，切取肝组织标本，固定；(5)实验组2(n=20)：每对大鼠互作供、受者，灌洗液及保存液均用含别嘌醇1 mmol/L的乳酸林格液，其余同对照组2。上述各组按实验设计的时间在乙醚麻醉下开腹采取下腔静脉血，采血量3～4 ml，从中准确取出50 μl血放入装有生理盐水的离心管中，混匀，3 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀待测超氧化物歧化酶(SOD)活力；再从采血管中取1.0 ml血置入试管中摇匀，待测LDH；余下的血液静置3 h，3 000 r/min离心10 min，取上清液测脂质过氧化物酶(LPO)；同时取肝尾叶组织制成光镜、电镜标本，于光镜和透射电镜下观察。
, 百拇医药
结 果
一、 各组大鼠血中SOD、LPO和LDH的测定结果(表1)
表1 5个组的SOD、LPO及LDH测定值(x±s)
组 别
n
SOD活力
(nU/g Hb)
LPO
(nmol/ml)
LDH
(IU/L)
假手术组
, 百拇医药
6
4 410.22±539.43
3.21±0.65
395.23±25.46
对照组1
6
3 125.24±920.80
7.25±1.15
410.55±20.54
实验组1
6
4 346.22±558.06
, 百拇医药
5.51±1.38
406.33±17.68
对照组2
20
2 567.34±702.29
6.18±1.82
578.89±23.79
实验组2
20
4 105.77±506.79
4.30±1.05
450.86±19.75
, 百拇医药
对照组1的SOD活力低于实验组1(P<0.05)和假手术组(P<0.05)，而LPO的含量高于实验组1(P<0.05)和假手术组(P<0.01)；LDH的含量3个组的差异不显著。对照组2的SOD活力低于实验组2(P<0.05) 和假手术组(P<0.01)，LPO及LDH的含量高于实验组2(P<0.05，P<0.05)和假手术组(P<0.01，P<0.05)。
二、肝脏组织学变化
1.光镜所见：对照组1及对照组2的大鼠肝细胞变性比较明显，胞体增大，胞浆透明、淡染，部分细胞膨大，肝窦内有炎性细胞浸润。实验组1及实验组2的大鼠大部分肝细胞形态正常，偶见肝细胞肿胀，胞浆内出现颗粒，提示轻度变性。假手术组的大鼠肝细胞形态基本正常。
2.电镜所见：对照组1及对照组2的大鼠肝细胞线粒体肿胀明显，大部分线粒体嵴被破坏，结构紊乱，甚至消失，呈空泡状，有的可见糖元颗粒增多，溶酶体增多。实验组1及实验组2的大鼠仅见肝细胞线粒体轻度肿胀，基质稍淡，偶见嵴减少，无嵴紊乱及消失现象，有的可见内质网轻度扩张。假手术组的大鼠肝细胞超微结构基本正常。
, 百拇医药
讨 论
肝脏在单纯复温而血液未再灌注之前就可受到氧自由基的损伤，自由基清除剂对预防热缺血损伤非常有效，其对于微循环的具体作用机制还不十分清楚。本实验中对照组的LPO含量均高于假手术组，说明氧自由基在肝脏缺血再灌注和低温保存后明显增多。氧自由基可以同细胞膜上的脂质发生过氧化反应，破坏细胞膜和线粒体膜的完整性，导致膜通透性增加，造成细胞内外离子失衡及细胞水肿变性，其组织形态学改变也证实了这一点。缺血再灌注损伤主要是肝窦内皮细胞受损，肝实质细胞损伤的程度轻于内皮细胞，所以在缺血再灌注早期，LDH的变化不明显。
别嘌醇是UW液的主要成分之一，是一种重要的外源性自由基清除剂，其作用机理是能够竞争性地抑制黄嘌呤脱氢酶转化成黄嘌呤氧化酶，在肝脏中黄嘌呤氧化酶是主要的氧自由基来源[1]，所以别嘌醇能够有效地减少氧自由基的生成，从而减少肝细胞的损害。Karwinski等[2]还提出，别嘌醇除上述减少氧自由基生成作用外，还能够促进ATP再合成，改善缺血时肝脏的能量代谢。本实验在热缺血前30 min通过外周静脉给予别嘌醇，或在保存液中加入别嘌醇，取得非常满意的效果。因为缺血后肝组织的损伤包括两个阶段：一是由于缺血造成的乏氧损伤，另一个是氧自由基介导的再灌注损伤，而氧自由基特别是超氧阴离子主要在这一阶段产生。本实验均是在再灌注之前施加处理因素，实验组的SOD活力较对照组强，说明清除超氧阴离子的能力增强，而LPO的减少则说明其脂质过氧化反应的程度也相应降低，对细胞的损伤减轻，LDH的变化也证实这一点。这些表明，术前30 min经外周静脉一次性给予供者别嘌醇和保存液中加入别嘌醇同样具有明显的抗氧自由基作用，并有方便快捷的优点。
, 百拇医药
作者单位：宋少伟(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
李先亮(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
刘永锋(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
梁健(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
刘树荣(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
何三光(110001 沈阳，中国医科大学附属第一医院移植科)
参考文献
[1]唐伟松，钟守先. 氧自由基与缺血性损害. 中华外科杂志，1991，29:260-262.
[2]Karwinski W，Fakstad M，Ulvic R. Sixty-minute normothermic liver ischemia in rats. Transplantation，1991，52:231-234., 百拇医药