胰岛细胞及肾联合移植治疗胰岛素依赖型糖尿病合并尿毒症四例
糖尿病合并尿毒症四例
唐雅望 尔秀江 张玉海
摘 要 目的 观察成人胰岛细胞及肾联合移植治疗胰岛素依赖型糖尿病合并尿毒症的临床效果。方法 对4例胰岛素依赖型糖尿病合并尿毒症的患者施行成人胰岛细胞及肾联合移植。肾移植为常规术式，在移植肾开放血液循环后，将分离、纯化、培养好的胰岛细胞注入门静脉中。移植后监测患者的空腹血糖、基础C-酞、糖化血红蛋白及肾功能的变化，并与其术前各项指标比较。 结果 4例患者术后在观察期间内胰岛素的用量均较术前减少超过25%，且持续3个月以上；空腹血糖基本保持在正常水平，基础C-酞也基本维持在正常水平，糖化血红蛋白于术后降至正常水平；4例患者的移植肾功能良好，3例患者已恢复正常工作。结论 成人尸体胰岛细胞及肾联合移植治疗胰岛素依赖型糖尿病合并尿毒症的临床效果较好，具有操作简单、安全等优点。
关键词：糖尿病，胰岛素依赖型 肾功能衰竭，慢性 胰岛移植 肾移植
, 百拇医药
糖尿病是一种慢性代谢障碍性疾病，5%～10%的患者可因此而导致肾功能衰竭。我院自90年代初期开始临床胰岛移植的研究，从1996年6月至1999年3月共有4例胰岛素依赖型糖尿病合并尿毒症的患者接受了成人尸体胰岛细胞、肾脏联合移植。报告如下。
资料与方法
一、受者的情况
4例均为胰岛素依赖型糖尿病患者，其详情见表1。
表1 4例患者的一般情况
例号
年龄
(岁)
性别
体重
, 百拇医药
(kg)
病程
(年)
空腹血糖
(mmol/L)
C-酞
(nmol/L)
糖化血红蛋白
胰岛素用量
(IU/d)
移植胰岛细胞数量
(×104)
, http://www.100md.com
1
31
男
48
19
16.89～23.63
<0.02
0.074～0.085
58～64
25
2
32
男
, http://www.100md.com
53
13
13.09～26.18
<0.02
0.078～0.095
54～58
41
3
45
女
55
15
9.69～16.04
, http://www.100md.com
<0.04
0.073～0.078
44～52
45
4
46
男
56
16
9.03～17.28
<0.03
0.076～0.088
42～48
, 百拇医药
48
二、胰岛细胞的制备
胰腺来源于成人尸体供者。胰腺全部取下后，立即放入含2.5%小牛血清的RPMI 1640培养基中，在4℃环境下去除胰腺组织外周的血管及脂肪组织。用含质量分数为0.25%胶原酶(美国SigmaⅪ型)、15mol/L氯化钙、体积分数为5%甘油的Hanks液(pH值为7.7左右)400ml经胰导管反复灌洗胰腺15～25min，温度控制在38℃左右。当胰腺组织消化成为泥沙状时，终止消化。将消化好的胰腺组织剪成2cm×2cm×2cm大小的小块，放在孔径为3mm的筛网上轻轻挤压，并用Hanks液反复吹洗，直至全部组织吹洗干净，仅剩纤维结缔组织。各块组织需分别进行，组织液收集在一个大烧杯内。将收集的组织液过500μm筛网1次，滤过液离心沉淀，弃上清液，再依次用含体积分数为3%、1%甘油的Hanks液各洗1次，最后用Hanks液洗1次。将沉淀物加入16ml比重为1.131的Ficoll液中充分混匀，其上方再分别叠加比重为1.085、1.074、1.045的Ficoll液各5ml，1 850r/min离心25min分层纯化。纯化后获得的胰岛细胞加入含小牛血清的RPMI 1640培养基，在CO2培养箱中培养2～4h，待用。用体积分数为1%双硫腙染色以判定胰岛细胞的活性。另挑选胰岛细胞100个，用低浓度葡萄糖液(1.67mol/L)洗1次，放入培养板中，加入1ml低浓度葡萄糖液37℃培养3h，抽吸上清液待测。再加入高浓度葡萄糖液(16.7mol/L)1ml培养3h，抽吸上清液待测。然后再加高浓度葡萄糖液+茶碱液1ml(茶碱浓度为10mol/L)培养3h，抽吸上清液待测。以放射免疫法测定上述待测液中胰岛素的浓度。
, 百拇医药
三、手术操作及术后处理
每例患者均接受同一个供者的胰岛细胞与肾，例2、3、4还在首次移植术后1～3周内接受第2个供者的胰岛细胞。所有供、受者的淋巴细胞毒交叉配合试验均为阴性。肾移植为常规术式，在移植肾开放血循环后，经手术切口将化疗泵导管置于胃左静脉(另文报道)，通过它将胰岛细胞注入门静脉内，4例患者所移植胰岛细胞的数量见表1。
术后应用环孢素A(CsA)、硫唑嘌呤(Aza)及泼尼松(Pred)预防排斥反应，但Pred的用量低于普通肾移植患者10mg左右。
四、术后观察项目
术后10d内每天监测患者的空腹血糖，患者恢复正常饮食后加测餐后2h的血糖。术后1个月内每周监测基础C-酞浓度1次；术后3个月内每2周监测空腹血糖、餐后2h血糖及基础C-酞浓度1次；以后每月监测空腹血糖、餐后2h血糖及基础C-酞浓度1次；2～3个月监测糖化血红蛋白1次。
, http://www.100md.com
移植肾功能的有关监测同常规肾移植。
结 果
利用本法所制得的胰岛细胞活性为85%～95%，每个胰腺可得到约25×104个胰岛细胞。
4例患者移植前后不同时期的空腹血糖的变化、基础C-酞的变化、胰岛素用量的变化及糖化血红蛋白的变化详见表2、3、4、5。若以移植术后胰岛素的平均用量较术前减少25%，且持续3个月以上为有效[1]，此4例患者均有效。由于本组患者数少，因此所有数据未做统计学处理。
表2 4例患者移植后空腹血糖(mmol/L)的变化
例 号
移植后不同时间的空腹血糖
, http://www.100md.com
1个月
3个月
6个月
12个月
24个月
36个月
1
8.64
8.51
8.18
8.64
8.97
8.18
, 百拇医药
2
8.38
7.66
7.85
8.12
8.51
—
3
6.41
7.20
6.94
6.74
—
, http://www.100md.com
—
4
7.46
6.74
—
—
—
—
表3 4例患者移植后基础C-酞(nmol/L)的变化
例 号
移植后不同时间的基础C-酞
1个月
3个月
, 百拇医药
6个月
12个月
24个月
36个月
1
0.8
1.2
1.4
1.4
1.5
1.4
2
0.7
, 百拇医药
1.3
1.2
1.2
1.3
—
3
1.3
1.5
1.5
1.6
—
—
4
1.2
, 百拇医药
1.4
—
—
—
—
表4 4例患者移植后不同时期胰岛素用量(IU/d)的变化
例 号
移植后不同时间的胰岛素用量
1个月
3个月
6个月
12个月
24个月
, 百拇医药
36个月
1
32
32
32
36
36
36
2
36
32
32
38
38
, http://www.100md.com
—
3
16
30
30
32
—
—
4
28
28
—
—
—
, 百拇医药
—
表5 4例患者移植后糖化血红蛋白的变化
例 号
移植后不同时间的糖化血红蛋白
1个月
3个月
6个月
12个月
24个月
36个月
1
0.041
0.042
, 百拇医药
0.043
0.045
0.043
0.045
2
0.043
0.050
0.045
0.047
0.050
—
3
0.038
, 百拇医药
0.045
0.042
0.042
—
—
4
0.048
0.051
—
—
—
—
本组4例患者，在住院期间及出院随访期间，均未发生新的糖尿病并发症，肾功能指标一直维持在正常水平。
, http://www.100md.com
讨 论
早在80年代，国内就有几家移植中心开展胎胰组织块移植，用以治疗胰岛素依赖型糖尿病，但由于胎胰体积小，由单个胎胰所获得的胰岛细胞数量少，施行1例胰岛细胞移植常需几个或十几个胎胰，这样就不能保证良好的组织学分型，不可避免地出现移植物的排斥反应[1]，妨碍了这一治疗的发展。对于糖尿病合并肾功能衰竭的患者，临床上常采取胰、肾联合移植治疗，移植成功后临床疗效好，但是，胰、肾联合移植的技术难度大，术后存在一些严重的并发症，如胰瘘、胰腺坏死及胰腺炎等[2]。相对来说，肾移植联合胰岛细胞移植要简单得多，随着成人胰岛细胞分离、纯化技术的不断改进，各种新型免疫抑制剂的不断问世，使得临床进行肾、胰岛细胞联合移植成为可能。本组的例数虽少，但疗效较为满意，也说明了这一点。
本组4例患者术后胰岛素的用量较移植前明显减少，C-酞水平在不同时期内均有所上升(>0.3nmol/L)，糖化血红蛋白值也基本维持在正常水平，其中1例患者现已是术后3年，其血糖基本维持在正常范围，肾功能亦保持在正常水平。虽然术后患者还需应用胰岛素，但在观察期间患者的血C-酞水平较移植术前明显提高，说明移植的胰岛细胞发挥了作用。
, http://www.100md.com
获得足量、高纯度、高活性的胰岛细胞是胰岛移植成功的前提条件，其关键在于掌握好消化时间，我们体会，15min为最佳消化时间。由于消化酶的作用，一些凝胶组织会出现在细胞悬液中，这些凝胶样物质可包裹胰岛细胞，使其收获量大减，我们在Hanks液中加入一定浓度的甘油，防止了凝胶的形成。为了提高胰岛细胞的纯度，我们采取了分层纯化的方法。胰腺摘取后应立即放入保存液中，每一步操作均需十分轻柔，这样才能得到高活性的细胞。
关于胰岛移植的部位，文献报道可有多处，门静脉系统可能是较为理想的移植区，但在行成人胰岛细胞与肾联合移植时，可考虑将胰岛细胞移植在肾被膜下，这样既便于操作，也较为安全。
移植后免疫抑制剂的应用，一般采取以环孢素A为主的联合免疫抑制治疗，如需使用激素，其用量要较常规减少，以避免激素的副作用。联合移植的患者免疫抑制剂的用量与单纯肾移植一样，不必增大剂量。
由于本组例数少，临床观察时间较短，还需作进一步的临床研究。
, 百拇医药
作者单位：唐雅望(100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科)
尔秀江(100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科)
张玉海(100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科)
参考文献
[1]孟庆敏，龚家镇，文武，等. 14例胰岛素依赖型糖尿病患者胚胎胰腺组织移植的远期临床分析. 中华器官移植杂志，1999, 20:25-26.
[2]Stratta RJ,Taylor RJ,Ozakl CF,et al.The analysis of benefits and risks of combined pancreas and renal transplantation vs renal transplantation alone.Surg Gynecol Obstel, 1993, 177:163-171., 百拇医药
唐雅望 尔秀江 张玉海
摘 要 目的 观察成人胰岛细胞及肾联合移植治疗胰岛素依赖型糖尿病合并尿毒症的临床效果。方法 对4例胰岛素依赖型糖尿病合并尿毒症的患者施行成人胰岛细胞及肾联合移植。肾移植为常规术式，在移植肾开放血液循环后，将分离、纯化、培养好的胰岛细胞注入门静脉中。移植后监测患者的空腹血糖、基础C-酞、糖化血红蛋白及肾功能的变化，并与其术前各项指标比较。 结果 4例患者术后在观察期间内胰岛素的用量均较术前减少超过25%，且持续3个月以上；空腹血糖基本保持在正常水平，基础C-酞也基本维持在正常水平，糖化血红蛋白于术后降至正常水平；4例患者的移植肾功能良好，3例患者已恢复正常工作。结论 成人尸体胰岛细胞及肾联合移植治疗胰岛素依赖型糖尿病合并尿毒症的临床效果较好，具有操作简单、安全等优点。
关键词：糖尿病，胰岛素依赖型 肾功能衰竭，慢性 胰岛移植 肾移植
, 百拇医药
糖尿病是一种慢性代谢障碍性疾病，5%～10%的患者可因此而导致肾功能衰竭。我院自90年代初期开始临床胰岛移植的研究，从1996年6月至1999年3月共有4例胰岛素依赖型糖尿病合并尿毒症的患者接受了成人尸体胰岛细胞、肾脏联合移植。报告如下。
资料与方法
一、受者的情况
4例均为胰岛素依赖型糖尿病患者，其详情见表1。
表1 4例患者的一般情况
例号
年龄
(岁)
性别
体重
, 百拇医药
(kg)
病程
(年)
空腹血糖
(mmol/L)
C-酞
(nmol/L)
糖化血红蛋白
胰岛素用量
(IU/d)
移植胰岛细胞数量
(×104)
, http://www.100md.com
1
31
男
48
19
16.89～23.63
<0.02
0.074～0.085
58～64
25
2
32
男
, http://www.100md.com
53
13
13.09～26.18
<0.02
0.078～0.095
54～58
41
3
45
女
55
15
9.69～16.04
, http://www.100md.com
<0.04
0.073～0.078
44～52
45
4
46
男
56
16
9.03～17.28
<0.03
0.076～0.088
42～48
, 百拇医药
48
二、胰岛细胞的制备
胰腺来源于成人尸体供者。胰腺全部取下后，立即放入含2.5%小牛血清的RPMI 1640培养基中，在4℃环境下去除胰腺组织外周的血管及脂肪组织。用含质量分数为0.25%胶原酶(美国SigmaⅪ型)、15mol/L氯化钙、体积分数为5%甘油的Hanks液(pH值为7.7左右)400ml经胰导管反复灌洗胰腺15～25min，温度控制在38℃左右。当胰腺组织消化成为泥沙状时，终止消化。将消化好的胰腺组织剪成2cm×2cm×2cm大小的小块，放在孔径为3mm的筛网上轻轻挤压，并用Hanks液反复吹洗，直至全部组织吹洗干净，仅剩纤维结缔组织。各块组织需分别进行，组织液收集在一个大烧杯内。将收集的组织液过500μm筛网1次，滤过液离心沉淀，弃上清液，再依次用含体积分数为3%、1%甘油的Hanks液各洗1次，最后用Hanks液洗1次。将沉淀物加入16ml比重为1.131的Ficoll液中充分混匀，其上方再分别叠加比重为1.085、1.074、1.045的Ficoll液各5ml，1 850r/min离心25min分层纯化。纯化后获得的胰岛细胞加入含小牛血清的RPMI 1640培养基，在CO2培养箱中培养2～4h，待用。用体积分数为1%双硫腙染色以判定胰岛细胞的活性。另挑选胰岛细胞100个，用低浓度葡萄糖液(1.67mol/L)洗1次，放入培养板中，加入1ml低浓度葡萄糖液37℃培养3h，抽吸上清液待测。再加入高浓度葡萄糖液(16.7mol/L)1ml培养3h，抽吸上清液待测。然后再加高浓度葡萄糖液+茶碱液1ml(茶碱浓度为10mol/L)培养3h，抽吸上清液待测。以放射免疫法测定上述待测液中胰岛素的浓度。
, 百拇医药
三、手术操作及术后处理
每例患者均接受同一个供者的胰岛细胞与肾，例2、3、4还在首次移植术后1～3周内接受第2个供者的胰岛细胞。所有供、受者的淋巴细胞毒交叉配合试验均为阴性。肾移植为常规术式，在移植肾开放血循环后，经手术切口将化疗泵导管置于胃左静脉(另文报道)，通过它将胰岛细胞注入门静脉内，4例患者所移植胰岛细胞的数量见表1。
术后应用环孢素A(CsA)、硫唑嘌呤(Aza)及泼尼松(Pred)预防排斥反应，但Pred的用量低于普通肾移植患者10mg左右。
四、术后观察项目
术后10d内每天监测患者的空腹血糖，患者恢复正常饮食后加测餐后2h的血糖。术后1个月内每周监测基础C-酞浓度1次；术后3个月内每2周监测空腹血糖、餐后2h血糖及基础C-酞浓度1次；以后每月监测空腹血糖、餐后2h血糖及基础C-酞浓度1次；2～3个月监测糖化血红蛋白1次。
, http://www.100md.com
移植肾功能的有关监测同常规肾移植。
结 果
利用本法所制得的胰岛细胞活性为85%～95%，每个胰腺可得到约25×104个胰岛细胞。
4例患者移植前后不同时期的空腹血糖的变化、基础C-酞的变化、胰岛素用量的变化及糖化血红蛋白的变化详见表2、3、4、5。若以移植术后胰岛素的平均用量较术前减少25%，且持续3个月以上为有效[1]，此4例患者均有效。由于本组患者数少，因此所有数据未做统计学处理。
表2 4例患者移植后空腹血糖(mmol/L)的变化
例 号
移植后不同时间的空腹血糖
, http://www.100md.com
1个月
3个月
6个月
12个月
24个月
36个月
1
8.64
8.51
8.18
8.64
8.97
8.18
, 百拇医药
2
8.38
7.66
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8.12
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3
6.41
7.20
6.94
6.74
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, http://www.100md.com
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4
7.46
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—
表3 4例患者移植后基础C-酞(nmol/L)的变化
例 号
移植后不同时间的基础C-酞
1个月
3个月
, 百拇医药
6个月
12个月
24个月
36个月
1
0.8
1.2
1.4
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0.7
, 百拇医药
1.3
1.2
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1.3
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1.2
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表4 4例患者移植后不同时期胰岛素用量(IU/d)的变化
例 号
移植后不同时间的胰岛素用量
1个月
3个月
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12个月
24个月
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36个月
1
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28
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表5 4例患者移植后糖化血红蛋白的变化
例 号
移植后不同时间的糖化血红蛋白
1个月
3个月
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0.043
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0.045
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本组4例患者，在住院期间及出院随访期间，均未发生新的糖尿病并发症，肾功能指标一直维持在正常水平。
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讨 论
早在80年代，国内就有几家移植中心开展胎胰组织块移植，用以治疗胰岛素依赖型糖尿病，但由于胎胰体积小，由单个胎胰所获得的胰岛细胞数量少，施行1例胰岛细胞移植常需几个或十几个胎胰，这样就不能保证良好的组织学分型，不可避免地出现移植物的排斥反应[1]，妨碍了这一治疗的发展。对于糖尿病合并肾功能衰竭的患者，临床上常采取胰、肾联合移植治疗，移植成功后临床疗效好，但是，胰、肾联合移植的技术难度大，术后存在一些严重的并发症，如胰瘘、胰腺坏死及胰腺炎等[2]。相对来说，肾移植联合胰岛细胞移植要简单得多，随着成人胰岛细胞分离、纯化技术的不断改进，各种新型免疫抑制剂的不断问世，使得临床进行肾、胰岛细胞联合移植成为可能。本组的例数虽少，但疗效较为满意，也说明了这一点。
本组4例患者术后胰岛素的用量较移植前明显减少，C-酞水平在不同时期内均有所上升(>0.3nmol/L)，糖化血红蛋白值也基本维持在正常水平，其中1例患者现已是术后3年，其血糖基本维持在正常范围，肾功能亦保持在正常水平。虽然术后患者还需应用胰岛素，但在观察期间患者的血C-酞水平较移植术前明显提高，说明移植的胰岛细胞发挥了作用。
, http://www.100md.com
获得足量、高纯度、高活性的胰岛细胞是胰岛移植成功的前提条件，其关键在于掌握好消化时间，我们体会，15min为最佳消化时间。由于消化酶的作用，一些凝胶组织会出现在细胞悬液中，这些凝胶样物质可包裹胰岛细胞，使其收获量大减，我们在Hanks液中加入一定浓度的甘油，防止了凝胶的形成。为了提高胰岛细胞的纯度，我们采取了分层纯化的方法。胰腺摘取后应立即放入保存液中，每一步操作均需十分轻柔，这样才能得到高活性的细胞。
关于胰岛移植的部位，文献报道可有多处，门静脉系统可能是较为理想的移植区，但在行成人胰岛细胞与肾联合移植时，可考虑将胰岛细胞移植在肾被膜下，这样既便于操作，也较为安全。
移植后免疫抑制剂的应用，一般采取以环孢素A为主的联合免疫抑制治疗，如需使用激素，其用量要较常规减少，以避免激素的副作用。联合移植的患者免疫抑制剂的用量与单纯肾移植一样，不必增大剂量。
由于本组例数少，临床观察时间较短，还需作进一步的临床研究。
, 百拇医药
作者单位：唐雅望(100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科)
尔秀江(100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科)
张玉海(100050 北京，首都医科大学附属北京友谊医院泌尿外科)
参考文献
[1]孟庆敏，龚家镇，文武，等. 14例胰岛素依赖型糖尿病患者胚胎胰腺组织移植的远期临床分析. 中华器官移植杂志，1999, 20:25-26.
[2]Stratta RJ,Taylor RJ,Ozakl CF,et al.The analysis of benefits and risks of combined pancreas and renal transplantation vs renal transplantation alone.Surg Gynecol Obstel, 1993, 177:163-171., 百拇医药