吗啡依赖小鼠脑组织cAMP系统的变化及腺苷酸环化酶磷酸化调节
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中国医科学院学报 2000年第22卷第1期
方芳 汪青 曹清 刘景生
摘 要：目的 观察吗啡依赖小鼠脑组织腺苷酸环化酶 (AC)/cAMP 信号系统的变化、 AC 活性的磷酸化调 节及蛋白激酶 A (PKA) 抑制剂对吗啡依赖形成的影响。 方法 采用放射免疫和酶学方法。 结果 (1) 吗啡依赖小鼠纹状体、海马及大脑皮质 AC 活性、 cAMP 含量及可溶相蛋白激酶 A (PK A) 活性明显增加，小脑未见此变化；每日给吗啡前 15 min脑室注射 PKA 抑制剂的小鼠纹 状 体、海马及大脑皮质 AC 活性明显低于吗啡依赖小鼠； (2) 纳洛酮拮抗组未见上述变化； (3) 吗啡依赖小鼠纹状体及大脑皮质 AC 体外磷酸化水平明显高于对照； (4) 每日给吗啡 前 15 min脑室注射 PKA 抑制剂可抑制吗啡依赖的产生。 结论 吗啡依赖时脑组织存在着 AC/cAMP-PKA 系统的上调，此变化由阿片受体所介导； PKA 可 通过影响 AC 的磷酸化状态使 AC 活性升高，造成吗啡长时作用下 AC/cAMP 系统的正反馈 调节，这可能是吗啡依赖机制中的重要环节。
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关键词：吗啡 腺苷酸环化酶 cAMP 蛋白激酶 A 磷酸化 依赖
阿片类物质耐受和依赖是神经生物学领域的重要课题，但至今对其确切生化机制还不十分清楚。在过去20年中，该研究领域的目标主要集中在阿片受体的变化上，如受体的数目和亲和力。近年来人们的注意力逐渐转向阿片作用的受体后机制，其中细胞G蛋白活性、胞内第二信使和蛋白磷酸化过程的改变尤其引人注目。一些研究发现，吗啡短时作用下，胞内腺苷酸环化酶(AC)活性及 cAMP 水平降低；随着吗啡作用时间的延长，AC活性及 cAMP 水平又逐渐回升。因此认为 AC/cAMP 水平的改变可能是产生吗啡耐受依赖的生化基础[1，2]。但是阿片长时作用后AC活性在脑组织中的变化，各家研究结果并不一致[3，4]。另外，阿片长时作用对神经组织 AC/cAMP 系统其它环节尚缺乏研究。由于 cAMP 对神经元的效应在多数情况下是通过激活蛋白激酶 A (PKA) 及其所致底物磷酸化而获得的，而且蛋白磷酸化是胞外信号影响神经元功能的公共通路。为此，本研究观察并分析吗啡依赖时小鼠脑组织中AC/cAMP-PKA 系统的变化、PKA 抑制剂对吗啡依赖形成的影响及 AC 活性的磷酸化调节。
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材料和方法
动物 雄性昆明小鼠，体重 18～22 g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所。
试剂、仪器 硫酸吗啡(morphine sulfate, Mor)， Puninsula公司。盐酸纳洛酮(naloxone hydrochloride, Nal)、Histone ⅡA、ATP、cAMP、GTP、PKA 抑制剂、PKA 催化亚单位，Sigma公司。γ-32P-ATP (1.85×105 GBq)，北京市亚辉生物医学工程公司。3H-cAMP (1.03×103 GBq)， 原子能研究所。 LKB XL 型光密度扫描仪，Pharmacia 公司。
用药 (1)吗啡递增给药组：以递增剂量皮下注射吗啡，共7d，即 30、40、50、60、70、80、90 mg/kg，每日2次，间隔12 h，以使小鼠产生对吗啡的躯体依赖性[5]；(2) 对照组：每日皮下注射等量生理盐水；(3) 纳洛酮拮抗组：吗啡给药处理同吗啡递增给药组，只是在注射吗啡前 30min先皮下注射纳洛酮，用量为相应吗啡浓度的 1/10；(4) PKA抑制剂组：用一根自制的聚乙烯管(事先充满 2μl 生理盐水)插至小鼠脑室，固定于颅骨并皮下缝合固定。通过注射 1% 美蓝染料确定插管是否入脑室。术后24～36h，将活动正常、反应灵活、脑室注射生理盐水无任何异常反应的小鼠用于实验。吗啡给药处理同吗啡递增给药组，于每次皮下注射吗啡前15min通过插管缓慢注入PKA抑制剂 2μg/2μl。
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小鼠戒断症状观察 在第 7天末次给药后 2h，皮下注射纳洛酮5mg/kg体重，立即将小鼠放至一个高35cm、直径30cm的圆台上，观察30min内小鼠跳跃反应，同时观察给予纳洛酮后2h其它一些戒断体征，以判定小鼠躯体依赖性的产生。
AC活性测定 小鼠末次给药后2h断头处死，迅速取出所需脑组织，加入预冷的匀浆缓冲液A(10mmol/L Hepes, 0.32mol/L蔗糖，1.6mmo l/L EGTA,pH7.4)，冰浴中匀浆。4℃ 1000×g 离心10min，沉淀部分用匀浆缓冲液洗 1遍；再在 4℃ 1000×g 离心 10min，将两次上清合并，在 4℃ 以 22 500×g离心 20min；弃上清，沉淀部分用匀浆缓冲液B(10 mmol/L Hepes, 1.6 mmol/L EGTA, pH7.4)混悬。测定时于冰浴中分别加入100μl 缓冲液 C(40 mmol/L Hepes, 10 mmol/L MgCl2, 40 μmol/L GTP)、50 μl 样品、10 mmol/L ATP 50 μl， 置 30℃ 水 浴中保温 5 min后煮沸 3 min终止反应，于冰浴中加入适量 TE 缓冲液 (30 mmol/L Tris, 4 mmol/L EDTA, pH7.5)。于 4℃ 以 3000 r/min 离心 15 min。上清即可测定 cAMP 含量 。 AC 活性以每克湿组织催化形成的 cAMP 的 pmol 数表示。
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cAMP 含量测定 小鼠末次给药后 2 h断头处死，迅速取出所需脑组织，加入预冷的 6% 三氯醋酸，冰浴中匀浆，于 4℃ 3 000 r/min 离心 15 min。上清用 5 倍体积的水饱和乙醚洗提 4 次，水相在 70～75℃ 水浴上吹干。测 定时 吹干的样品溶于适量的 TE 缓冲液，采用竞争性蛋白结合分析法测定小脑、纹状体、海马、大脑皮层的 cAMP。
PKA 活性测定 按文献[5]方法进行。
AC 反磷酸化测定(back-phosphorylation assay) 参考文献[6，7]并加以改良。利用反磷酸化测定技术了解脱磷酸化底物含量的高低，推算体内底物蛋白/酶的磷酸化程度。反应体积 50 μl，含 20 mmol/L Tris(pH7.5)、5 mmol/L MgCl2、 100 μmol/L EGTA、 2 μmol/L cAMP、 100 μmol/L ATP、10-4 U PKA 催化亚单位、γ-32P-ATP 74 kBq，于 25℃ 加入 30μl 样品(样品制备同活性测定)启动反应，5min后置于冰浴，加入 2×SDS 加样缓冲液 50μl， 于沸水中加热 5 min后进行 SDS-PAGE 分析(积层胶 5%，分离胶 8%)。电泳结束后于凝胶干燥机上干胶。将干燥过的凝胶置于暗盒，压上 X光片，于 -70℃曝光2～3d。结果用光密度扫描仪分析显影条带。
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数据处理 数据用 Pharmacologic Calculation System 4.1 版软件进行计算统计学处理，结果以平均数±标准误(X±SX)表示。采用单因素方差分析，组间差异用双侧 t 检验比较，差异的显著性以 P<0.05 和 P<0.01 表示。
结 果
吗啡依赖小鼠脑组织 cAMP 含量的变化 吗啡依赖小鼠纹状体、海马及大脑皮质的 cAMP 含量明显高于对照组，分别升高 105%、35% 及 48% (P均<0.01)；而小脑 cAMP 含量无明显变化。纳洛酮拮抗组以上各脑区的 cAMP 含量与对照组比较变化不明显(P均>0.05)(图1)。
图 1 吗啡依赖小鼠各脑区 cAMP含量
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Fig 1 Concentration of cAMP in the brain regions
from morphine-dependent mice (X±SX，n=5)
** P<0.01 compared with control
CON: control;
MOR+NAL: morphine+naloxone;
MOR: morphine
吗啡依赖小鼠脑组织PKA活性的变化及 PKA 对吗啡依赖形成的影响 吗啡依赖小鼠脑组织小脑、纹状体、海马、大脑皮质胞质可溶相 PKA 活性分别比对照组升高16%(P>0.05)、80%(P<0.05)、31%(P<0.05)及43%(P<0.05)，其中小脑升高不显著(附表)。吗啡依赖小鼠脑组织膜相PKA活性虽也有所增加(小脑8%、纹状体22%、海马19%、大脑皮质5%)，与对照组比较均无显著差异(P>0.05)；纳洛酮拮抗组PKA活性与对照组比较未见明显变化(附表)。每天给吗啡前15min
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附表 吗啡依赖小鼠脑组织胞浆相及膜相蛋白激酶A活性
Table Protein kinase A activity of cytosol and membrane fractions in the brain of morp h ine-dependent
mice (pmol.min-1.mg-1 protein)(X±SX, n=6)
Brain region
Control group
Morphine group
MOR+NAL group
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Cytosol
Membrane
Cytosol
Membrane
Cytosol
Membrane
Cerebral cortex
4.71±0.79
39.96±6.29
6.74±0.74*
4 1.91±6.15
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5.19±0.95
40.33±4.33
Striatum
11.55±1.52
66.87±12.57
20.75±3.81**
81.48± 11.72
13.04±3.30
76.29±14.34
Hippocampus
17.86±1.76
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66.24±9.73
23.47±2.21*
78.74±11.18
18.74±2.23
66.03±10.28
Cerebellum
5.41±0.86
16.18±2.42
6.24±0.82
17.54±2.00
5.71±0.48
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15.76±1.12
* P<0.05， ** P<0.01 compared with control group； MOR+NAL: mor phine+naloxone
脑室注射 PKA 抑制剂，末次给吗啡后注射纳洛酮，发现小鼠跳跃反应发生率为 (1.57±0 .59) 次，明显低于单独吗啡递增给药组的 (7.88±1.20) 次，两者比较差异有显著意义 (P<0.01)；前者与对照组比较 P<0.05，后者与对照组比较 P<0.01；未见其它戒断症状出现。
吗啡依赖小鼠脑组织 AC 活性的变化及 PKA 抑制剂对 AC 活性的影响 吗啡依赖小鼠纹状体、海马及大脑皮质中 AC 活性明显增加，与对照组比较分别升高了 101% (P<0.01)、44% (P<0.05) 及90% (P<0.05)，其中以纹状体 AC 变化最为显著(图2)。脑室注射 PKA 抑制剂组，纹状体、海马及大脑皮质的 AC 活性 明显低于单独吗啡递增给药组 (P<0.05 或 P<0.01)，但与对照组比较差异无显著意义。小脑部位及纳洛酮拮抗组未见上述变化。
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图 2 吗啡依赖小鼠各脑区腺苷酸环化酶活性及蛋白激酶 A 抑制剂的作用
Fig 2 Adenylate cyclase activity in the brain regions from morphine-dependent mice an d effect of protein kinase A inhibitors (PKA-I) on AC activity (X±SX, n=5)
* P<0.05, ** P<0.01 compared with control; # P<0.05, ## P<0.01 compared with morphine group
CON: control; MOR+NAL: morphine+naloxone; MOR: morphine； MOR+PKA-I: morphin e+protein kinase A inhibitor
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吗啡依赖小鼠脑组织 AC 体外磷酸化水平的变化 吗啡依赖小鼠纹状体及大脑皮质中 AC 体外磷酸化水平比对照组增强，尤以大脑皮质明显( 图3)。
图 3 吗啡依赖小鼠腺苷酸 环化酶体外磷酸化水平变化
Fig 3 Phosporylation of adenylate cyclase in morphine-dependent mice in vitro
A. Lane 1. control, striatum; Lane 2. control, cerebral cortex; Lane 3. Mor, striatum; Lane 4. Mor, cerebral cortex; Lane 5. protein relative standard s
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B. The band corresponding to adenylate cyclase was analyzed by scanning d ensitometry Results from three separate experiments are presented as X±SX;
* P<0.05, ** P<0.01 compared with control
CON： control; MOR: morphine;
AC: adenylate cyclase
讨 论
早在 20 多年前，Sharma 等[1] 在体外培养 NG108-15 细胞时发现，吗啡短时作用于细胞可抑制 AC 活性而降低胞内 cAMP 含量；当持 续作用 12 h以后，AC 活性逐渐上升；如果突然撤除吗啡或加入纳洛酮，可观察到 AC 活性的反弹性超高 (overshoot) 现象。以后的一些研究也发现，吗啡长时作用于 NG108-15 细胞可使胞内 AC 活性及 cAMP 水平升高[2]。推测吗啡长时作用过程中细胞 AC 活性由最初的抑制到逐渐升高，代表了吗啡耐受和依赖过程的产生，而 AC 活性的超高现象则代表一种戒断过程的生化反应。但在整体动物，对于阿片耐受成瘾中 AC/cAMP 系统上调的设想一直存在争论。有研究报道，吗啡长时作用可使小鼠大脑皮质 AC 活性下降，但不影响大鼠大脑皮质、小脑及下丘脑的 AC 活性[3]。而 Duman 和 Nestler 等[4] 却发现吗啡长时作用 可使大鼠蓝斑核 AC 活性及 cAMP 含量明显升高。 Nestler 等[8] 还发现，吗啡耐受依赖大鼠蓝斑核胞质及膜相 PKA 活性升高，而在纹状体、额叶皮质及背侧缝等却无明显变化，进一步表明 AC/cAMP-PKA 系统的增强可能是吗啡产生耐受依赖的生化基础。
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本研究发现，吗啡依赖小鼠脑组织纹状体、海马及大脑皮质中 AC 活性、cAMP 含量及胞质可溶相 PKA 活性均明显升高，但膜相 PKA 活性无明显变化，小脑则未见类似变化。另外，还发现 PKA 抑制剂可抑制小鼠吗啡依赖的形成，表明在吗啡依赖形成过程中脑组织存在 AC /cAMP-PKA 信号系统的上调，这一系统的上调可能使细胞某些 PKA 的特异底物发生磷酸化 改变而影响神经元的功能，如神经递质的合成与释放。有研究发现，吗啡短时作用可通过激 活与 Gi 蛋白耦联的阿片受体而抑制 AC 活性、降低细胞基础 cAMP 水平；而多次使用阿 片类物质后，通过某种机制可使受体与 Gi 蛋白解耦联，Gs 活性相对增强，AC 活性升高[8，9]。推测阿片长时作用下 AC/cAMP-PKA 信号系统的上调可能是细胞对阿片抑制 AC/cAMP 系统的一个代偿性的反馈调节，是构成阿片类物质耐受依赖的部分生化基础。另外，阿片长时作用下脑组织 AC 活性变化不一致的原因可能有二，一是与脑组织各脑区阿片受体的分布有关，如纹状体、大脑皮质中阿片受体密度最高，而小脑中密度最低；二是因所研究脑区的异质性，即各脑区神经元成分并不单一，如纹状体、大脑皮质、小脑等含有多种类型的神经元，各种神经元的变化可能并不一致，而 AC/cAMP 系统的变化可能仅能在某一种神经元上测到，也可能是各种神经元反应的整合效应。本实验发现依赖小鼠大脑皮层、纹状体可溶相 PKA 活性增强，膜相没有明显改变，与 Nestler 等[10] 结果不一致，这可能与所用的动物种属、用药方式不同有关，其生物学意义需进一步探讨 。
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蛋白质的可逆磷酸化是细胞信息传递的公共通路，是使细胞对信号作出持续反应的一种调节 方式，因而蛋白质的磷酸化调节在吗啡耐受依赖形成中的作用也越来越受到重视。早期的一 些研究发现，阿片短时或长时作用可使脑组织一些蛋白质磷酸化[11，12]。 Guita r 和 Nestler 等[6] 曾在吗啡耐受依赖大鼠蓝斑核及其它脑区检出一些磷酸化的 蛋白质，即吗啡和 cAMP 调节的磷蛋白(morphine and cAMP-regulated phosphoproteins, MARPPS)， 但并不清楚这些蛋白质的性质。为进一步阐明蛋白磷酸化调节在吗啡依赖机制中的作用，本实验用反磷酸化技术研究 PKA 对吗啡依赖小鼠脑组织中 AC 活性的磷酸化调节作用。反磷酸化测定技术是了解脱磷酸化底物含量的高低推算底物磷酸化程度，即离体组织参入的 32P 越少 (SDS-PAGE 放射自显影条带越浅)，说明体内磷酸化底物水平越高，反之则越少。结果发现吗啡依赖小鼠纹状体及大脑皮质 AC 的体外磷酸化水平明显增加，尤以皮质显著，说明依赖小鼠体内相应脑组织中磷酸化状态的 AC 水平与对照小鼠比较降低，但依赖小鼠纹状体及大脑皮质中 AC 活性却是升高的，且 PKA 抑制剂可抑制AC活性的升高。推测在吗啡依赖动物脑组织中 PKA 不是直接磷酸化 AC，而可能是通过激活磷酸酶使 AC 去磷酸化进而升高 AC 活性，这就构成了吗啡依赖中代偿性增强的 AC/cAMP 系统内部的一个正反馈调节，即AC/cAMP 的上调激活了 PKA，而 PKA 不仅能启动信号通路的下游信号反应，如使 CREB 磷酸化而改变一些基因的表达水平，还能反过来使上游信 号通路中的 AC 受到磷酸化调节而使 AC 活性进一步增强。 AC/cAMP-PKA 系统的这一正反馈调节可能与维持或上调、以及使神经元处于过度激活状态有关，因此可能是形成和维持吗啡依赖状态的一个重要机制。
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基金项目：国家自然科学基金 (39770852) 和卫生部科学基金 (96-1-018) 资助
Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (39770852)
and the Foundation for Scientific Research, Ministry of Health, China
(96-1-018);
作者简介：Corresponding author Tel: 01065296403， Fax:01065256546，E-mail:jsliu 99@263.net
作者单位：方芳(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室， 北京 100005)
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汪青(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室， 北京 10 0005)
曹清(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室， 北京 10 0005)
刘景生(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室， 北京
100005)
参考文献：
[1] Sharma SK, Klee WA, Nirenberg M, et al. Dual regulation of adenylate cyclas e accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc Natl Acad Sci USA, 1975, 72: 3092-3096
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[2] Musacchio JM, Greenspan DL. The adenylate cyclase rebound response to naloxone in the NG108-15cells: effects of etorphine and other opiates. Neuropharmacolog y, 1986, 25: 833-837
[3] Naito K, Kuriyama K. Effect of morphine administration on adenyl cyclase and 3 ', 5'～cyclic nucleotide phosphodiesterase activites in the brain. Japan J Ph armacol, 1973, 23: 274-276
[4] Duman RS, Tallman JF, Nestler EJ, et al. Acute and chronic opiate-regulati o n of adenylate cyclase in brain: specific effects in locus coeruleus. J Pharmac ol Exp Ther, 1988, 46: 1033-1039
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[5] 方 芳， 陈轶琨， 王小明， 等. 吗啡长时程作用对小鼠脑组织蛋白 激酶 A 及 C 活性的影响. 基础医学与临床， 1997， 17： 115-120
[6] Fleming LM, Ponjee G, Childers SR. Inhibition of protein phosphorylation by opi oid-inhibited adenylyl cyclase in rat brain membranes. J Phharmacol Exp Ther, 1992, 260: 1416-1424
[7] Guitart X, Nestler EJ. Identification of morphine-and cyclic AMP-regulated-p hospoprotein (MMRPPS) in the locus coeruleus and other regions of rat brain: reg ulation by acute and chronic morphine. J Neurosci, 1989, 9: 4371-4387
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[8] Dolphin AC. Nucleotide binding proteins in signal transduction and disease. TI NS, 1987, 10: 53-57
[9] Nestler EJ. Molecular mechanisms of drug addiction. J Neurosci, 1992, 12: 2439 -2450
[10] Nestler EJ, Tallman JF. Chronic morphine treatment increases cyclic AMP depende n t protein kinase activity in the rat locus coeruleus. Mol Pharmcol, 1988, 33: 1 27-132
[11] Ehrlich YH, Bonnet KA, Davis LG, et al. Decreased phosphorylation of specif ic proteins in neostriatal membranes from rats after long-term narcotics exposu re. Life Sci, 1978, 23: 137-146
[12] Williams N, Clouet DH. The effect of acute opioid administration on the phospho rylation of rat striatal synaptic membrane proteins. J Pharmacol Exp Ther, 1982 , 220: 278-286, 百拇医药
摘 要：目的 观察吗啡依赖小鼠脑组织腺苷酸环化酶 (AC)/cAMP 信号系统的变化、 AC 活性的磷酸化调 节及蛋白激酶 A (PKA) 抑制剂对吗啡依赖形成的影响。 方法 采用放射免疫和酶学方法。 结果 (1) 吗啡依赖小鼠纹状体、海马及大脑皮质 AC 活性、 cAMP 含量及可溶相蛋白激酶 A (PK A) 活性明显增加，小脑未见此变化；每日给吗啡前 15 min脑室注射 PKA 抑制剂的小鼠纹 状 体、海马及大脑皮质 AC 活性明显低于吗啡依赖小鼠； (2) 纳洛酮拮抗组未见上述变化； (3) 吗啡依赖小鼠纹状体及大脑皮质 AC 体外磷酸化水平明显高于对照； (4) 每日给吗啡 前 15 min脑室注射 PKA 抑制剂可抑制吗啡依赖的产生。 结论 吗啡依赖时脑组织存在着 AC/cAMP-PKA 系统的上调，此变化由阿片受体所介导； PKA 可 通过影响 AC 的磷酸化状态使 AC 活性升高，造成吗啡长时作用下 AC/cAMP 系统的正反馈 调节，这可能是吗啡依赖机制中的重要环节。
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阿片类物质耐受和依赖是神经生物学领域的重要课题，但至今对其确切生化机制还不十分清楚。在过去20年中，该研究领域的目标主要集中在阿片受体的变化上，如受体的数目和亲和力。近年来人们的注意力逐渐转向阿片作用的受体后机制，其中细胞G蛋白活性、胞内第二信使和蛋白磷酸化过程的改变尤其引人注目。一些研究发现，吗啡短时作用下，胞内腺苷酸环化酶(AC)活性及 cAMP 水平降低；随着吗啡作用时间的延长，AC活性及 cAMP 水平又逐渐回升。因此认为 AC/cAMP 水平的改变可能是产生吗啡耐受依赖的生化基础[1，2]。但是阿片长时作用后AC活性在脑组织中的变化，各家研究结果并不一致[3，4]。另外，阿片长时作用对神经组织 AC/cAMP 系统其它环节尚缺乏研究。由于 cAMP 对神经元的效应在多数情况下是通过激活蛋白激酶 A (PKA) 及其所致底物磷酸化而获得的，而且蛋白磷酸化是胞外信号影响神经元功能的公共通路。为此，本研究观察并分析吗啡依赖时小鼠脑组织中AC/cAMP-PKA 系统的变化、PKA 抑制剂对吗啡依赖形成的影响及 AC 活性的磷酸化调节。
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材料和方法
动物 雄性昆明小鼠，体重 18～22 g，购自中国医学科学院医学实验动物研究所。
试剂、仪器 硫酸吗啡(morphine sulfate, Mor)， Puninsula公司。盐酸纳洛酮(naloxone hydrochloride, Nal)、Histone ⅡA、ATP、cAMP、GTP、PKA 抑制剂、PKA 催化亚单位，Sigma公司。γ-32P-ATP (1.85×105 GBq)，北京市亚辉生物医学工程公司。3H-cAMP (1.03×103 GBq)， 原子能研究所。 LKB XL 型光密度扫描仪，Pharmacia 公司。
用药 (1)吗啡递增给药组：以递增剂量皮下注射吗啡，共7d，即 30、40、50、60、70、80、90 mg/kg，每日2次，间隔12 h，以使小鼠产生对吗啡的躯体依赖性[5]；(2) 对照组：每日皮下注射等量生理盐水；(3) 纳洛酮拮抗组：吗啡给药处理同吗啡递增给药组，只是在注射吗啡前 30min先皮下注射纳洛酮，用量为相应吗啡浓度的 1/10；(4) PKA抑制剂组：用一根自制的聚乙烯管(事先充满 2μl 生理盐水)插至小鼠脑室，固定于颅骨并皮下缝合固定。通过注射 1% 美蓝染料确定插管是否入脑室。术后24～36h，将活动正常、反应灵活、脑室注射生理盐水无任何异常反应的小鼠用于实验。吗啡给药处理同吗啡递增给药组，于每次皮下注射吗啡前15min通过插管缓慢注入PKA抑制剂 2μg/2μl。
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小鼠戒断症状观察 在第 7天末次给药后 2h，皮下注射纳洛酮5mg/kg体重，立即将小鼠放至一个高35cm、直径30cm的圆台上，观察30min内小鼠跳跃反应，同时观察给予纳洛酮后2h其它一些戒断体征，以判定小鼠躯体依赖性的产生。
AC活性测定 小鼠末次给药后2h断头处死，迅速取出所需脑组织，加入预冷的匀浆缓冲液A(10mmol/L Hepes, 0.32mol/L蔗糖，1.6mmo l/L EGTA,pH7.4)，冰浴中匀浆。4℃ 1000×g 离心10min，沉淀部分用匀浆缓冲液洗 1遍；再在 4℃ 1000×g 离心 10min，将两次上清合并，在 4℃ 以 22 500×g离心 20min；弃上清，沉淀部分用匀浆缓冲液B(10 mmol/L Hepes, 1.6 mmol/L EGTA, pH7.4)混悬。测定时于冰浴中分别加入100μl 缓冲液 C(40 mmol/L Hepes, 10 mmol/L MgCl2, 40 μmol/L GTP)、50 μl 样品、10 mmol/L ATP 50 μl， 置 30℃ 水 浴中保温 5 min后煮沸 3 min终止反应，于冰浴中加入适量 TE 缓冲液 (30 mmol/L Tris, 4 mmol/L EDTA, pH7.5)。于 4℃ 以 3000 r/min 离心 15 min。上清即可测定 cAMP 含量 。 AC 活性以每克湿组织催化形成的 cAMP 的 pmol 数表示。
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cAMP 含量测定 小鼠末次给药后 2 h断头处死，迅速取出所需脑组织，加入预冷的 6% 三氯醋酸，冰浴中匀浆，于 4℃ 3 000 r/min 离心 15 min。上清用 5 倍体积的水饱和乙醚洗提 4 次，水相在 70～75℃ 水浴上吹干。测 定时 吹干的样品溶于适量的 TE 缓冲液，采用竞争性蛋白结合分析法测定小脑、纹状体、海马、大脑皮层的 cAMP。
PKA 活性测定 按文献[5]方法进行。
AC 反磷酸化测定(back-phosphorylation assay) 参考文献[6，7]并加以改良。利用反磷酸化测定技术了解脱磷酸化底物含量的高低，推算体内底物蛋白/酶的磷酸化程度。反应体积 50 μl，含 20 mmol/L Tris(pH7.5)、5 mmol/L MgCl2、 100 μmol/L EGTA、 2 μmol/L cAMP、 100 μmol/L ATP、10-4 U PKA 催化亚单位、γ-32P-ATP 74 kBq，于 25℃ 加入 30μl 样品(样品制备同活性测定)启动反应，5min后置于冰浴，加入 2×SDS 加样缓冲液 50μl， 于沸水中加热 5 min后进行 SDS-PAGE 分析(积层胶 5%，分离胶 8%)。电泳结束后于凝胶干燥机上干胶。将干燥过的凝胶置于暗盒，压上 X光片，于 -70℃曝光2～3d。结果用光密度扫描仪分析显影条带。
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数据处理 数据用 Pharmacologic Calculation System 4.1 版软件进行计算统计学处理，结果以平均数±标准误(X±SX)表示。采用单因素方差分析，组间差异用双侧 t 检验比较，差异的显著性以 P<0.05 和 P<0.01 表示。
结 果
吗啡依赖小鼠脑组织 cAMP 含量的变化 吗啡依赖小鼠纹状体、海马及大脑皮质的 cAMP 含量明显高于对照组，分别升高 105%、35% 及 48% (P均<0.01)；而小脑 cAMP 含量无明显变化。纳洛酮拮抗组以上各脑区的 cAMP 含量与对照组比较变化不明显(P均>0.05)(图1)。
图 1 吗啡依赖小鼠各脑区 cAMP含量
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Fig 1 Concentration of cAMP in the brain regions
from morphine-dependent mice (X±SX，n=5)
** P<0.01 compared with control
CON: control;
MOR+NAL: morphine+naloxone;
MOR: morphine
吗啡依赖小鼠脑组织PKA活性的变化及 PKA 对吗啡依赖形成的影响 吗啡依赖小鼠脑组织小脑、纹状体、海马、大脑皮质胞质可溶相 PKA 活性分别比对照组升高16%(P>0.05)、80%(P<0.05)、31%(P<0.05)及43%(P<0.05)，其中小脑升高不显著(附表)。吗啡依赖小鼠脑组织膜相PKA活性虽也有所增加(小脑8%、纹状体22%、海马19%、大脑皮质5%)，与对照组比较均无显著差异(P>0.05)；纳洛酮拮抗组PKA活性与对照组比较未见明显变化(附表)。每天给吗啡前15min
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附表 吗啡依赖小鼠脑组织胞浆相及膜相蛋白激酶A活性
Table Protein kinase A activity of cytosol and membrane fractions in the brain of morp h ine-dependent
mice (pmol.min-1.mg-1 protein)(X±SX, n=6)
Brain region
Control group
Morphine group
MOR+NAL group
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Cytosol
Membrane
Cytosol
Membrane
Cytosol
Membrane
Cerebral cortex
4.71±0.79
39.96±6.29
6.74±0.74*
4 1.91±6.15
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5.19±0.95
40.33±4.33
Striatum
11.55±1.52
66.87±12.57
20.75±3.81**
81.48± 11.72
13.04±3.30
76.29±14.34
Hippocampus
17.86±1.76
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66.24±9.73
23.47±2.21*
78.74±11.18
18.74±2.23
66.03±10.28
Cerebellum
5.41±0.86
16.18±2.42
6.24±0.82
17.54±2.00
5.71±0.48
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15.76±1.12
* P<0.05， ** P<0.01 compared with control group； MOR+NAL: mor phine+naloxone
脑室注射 PKA 抑制剂，末次给吗啡后注射纳洛酮，发现小鼠跳跃反应发生率为 (1.57±0 .59) 次，明显低于单独吗啡递增给药组的 (7.88±1.20) 次，两者比较差异有显著意义 (P<0.01)；前者与对照组比较 P<0.05，后者与对照组比较 P<0.01；未见其它戒断症状出现。
吗啡依赖小鼠脑组织 AC 活性的变化及 PKA 抑制剂对 AC 活性的影响 吗啡依赖小鼠纹状体、海马及大脑皮质中 AC 活性明显增加，与对照组比较分别升高了 101% (P<0.01)、44% (P<0.05) 及90% (P<0.05)，其中以纹状体 AC 变化最为显著(图2)。脑室注射 PKA 抑制剂组，纹状体、海马及大脑皮质的 AC 活性 明显低于单独吗啡递增给药组 (P<0.05 或 P<0.01)，但与对照组比较差异无显著意义。小脑部位及纳洛酮拮抗组未见上述变化。
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图 2 吗啡依赖小鼠各脑区腺苷酸环化酶活性及蛋白激酶 A 抑制剂的作用
Fig 2 Adenylate cyclase activity in the brain regions from morphine-dependent mice an d effect of protein kinase A inhibitors (PKA-I) on AC activity (X±SX, n=5)
* P<0.05, ** P<0.01 compared with control; # P<0.05, ## P<0.01 compared with morphine group
CON: control; MOR+NAL: morphine+naloxone; MOR: morphine； MOR+PKA-I: morphin e+protein kinase A inhibitor
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吗啡依赖小鼠脑组织 AC 体外磷酸化水平的变化 吗啡依赖小鼠纹状体及大脑皮质中 AC 体外磷酸化水平比对照组增强，尤以大脑皮质明显( 图3)。
图 3 吗啡依赖小鼠腺苷酸 环化酶体外磷酸化水平变化
Fig 3 Phosporylation of adenylate cyclase in morphine-dependent mice in vitro
A. Lane 1. control, striatum; Lane 2. control, cerebral cortex; Lane 3. Mor, striatum; Lane 4. Mor, cerebral cortex; Lane 5. protein relative standard s
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B. The band corresponding to adenylate cyclase was analyzed by scanning d ensitometry Results from three separate experiments are presented as X±SX;
* P<0.05, ** P<0.01 compared with control
CON： control; MOR: morphine;
AC: adenylate cyclase
讨 论
早在 20 多年前，Sharma 等[1] 在体外培养 NG108-15 细胞时发现，吗啡短时作用于细胞可抑制 AC 活性而降低胞内 cAMP 含量；当持 续作用 12 h以后，AC 活性逐渐上升；如果突然撤除吗啡或加入纳洛酮，可观察到 AC 活性的反弹性超高 (overshoot) 现象。以后的一些研究也发现，吗啡长时作用于 NG108-15 细胞可使胞内 AC 活性及 cAMP 水平升高[2]。推测吗啡长时作用过程中细胞 AC 活性由最初的抑制到逐渐升高，代表了吗啡耐受和依赖过程的产生，而 AC 活性的超高现象则代表一种戒断过程的生化反应。但在整体动物，对于阿片耐受成瘾中 AC/cAMP 系统上调的设想一直存在争论。有研究报道，吗啡长时作用可使小鼠大脑皮质 AC 活性下降，但不影响大鼠大脑皮质、小脑及下丘脑的 AC 活性[3]。而 Duman 和 Nestler 等[4] 却发现吗啡长时作用 可使大鼠蓝斑核 AC 活性及 cAMP 含量明显升高。 Nestler 等[8] 还发现，吗啡耐受依赖大鼠蓝斑核胞质及膜相 PKA 活性升高，而在纹状体、额叶皮质及背侧缝等却无明显变化，进一步表明 AC/cAMP-PKA 系统的增强可能是吗啡产生耐受依赖的生化基础。
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本研究发现，吗啡依赖小鼠脑组织纹状体、海马及大脑皮质中 AC 活性、cAMP 含量及胞质可溶相 PKA 活性均明显升高，但膜相 PKA 活性无明显变化，小脑则未见类似变化。另外，还发现 PKA 抑制剂可抑制小鼠吗啡依赖的形成，表明在吗啡依赖形成过程中脑组织存在 AC /cAMP-PKA 信号系统的上调，这一系统的上调可能使细胞某些 PKA 的特异底物发生磷酸化 改变而影响神经元的功能，如神经递质的合成与释放。有研究发现，吗啡短时作用可通过激 活与 Gi 蛋白耦联的阿片受体而抑制 AC 活性、降低细胞基础 cAMP 水平；而多次使用阿 片类物质后，通过某种机制可使受体与 Gi 蛋白解耦联，Gs 活性相对增强，AC 活性升高[8，9]。推测阿片长时作用下 AC/cAMP-PKA 信号系统的上调可能是细胞对阿片抑制 AC/cAMP 系统的一个代偿性的反馈调节，是构成阿片类物质耐受依赖的部分生化基础。另外，阿片长时作用下脑组织 AC 活性变化不一致的原因可能有二，一是与脑组织各脑区阿片受体的分布有关，如纹状体、大脑皮质中阿片受体密度最高，而小脑中密度最低；二是因所研究脑区的异质性，即各脑区神经元成分并不单一，如纹状体、大脑皮质、小脑等含有多种类型的神经元，各种神经元的变化可能并不一致，而 AC/cAMP 系统的变化可能仅能在某一种神经元上测到，也可能是各种神经元反应的整合效应。本实验发现依赖小鼠大脑皮层、纹状体可溶相 PKA 活性增强，膜相没有明显改变，与 Nestler 等[10] 结果不一致，这可能与所用的动物种属、用药方式不同有关，其生物学意义需进一步探讨 。
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蛋白质的可逆磷酸化是细胞信息传递的公共通路，是使细胞对信号作出持续反应的一种调节 方式，因而蛋白质的磷酸化调节在吗啡耐受依赖形成中的作用也越来越受到重视。早期的一 些研究发现，阿片短时或长时作用可使脑组织一些蛋白质磷酸化[11，12]。 Guita r 和 Nestler 等[6] 曾在吗啡耐受依赖大鼠蓝斑核及其它脑区检出一些磷酸化的 蛋白质，即吗啡和 cAMP 调节的磷蛋白(morphine and cAMP-regulated phosphoproteins, MARPPS)， 但并不清楚这些蛋白质的性质。为进一步阐明蛋白磷酸化调节在吗啡依赖机制中的作用，本实验用反磷酸化技术研究 PKA 对吗啡依赖小鼠脑组织中 AC 活性的磷酸化调节作用。反磷酸化测定技术是了解脱磷酸化底物含量的高低推算底物磷酸化程度，即离体组织参入的 32P 越少 (SDS-PAGE 放射自显影条带越浅)，说明体内磷酸化底物水平越高，反之则越少。结果发现吗啡依赖小鼠纹状体及大脑皮质 AC 的体外磷酸化水平明显增加，尤以皮质显著，说明依赖小鼠体内相应脑组织中磷酸化状态的 AC 水平与对照小鼠比较降低，但依赖小鼠纹状体及大脑皮质中 AC 活性却是升高的，且 PKA 抑制剂可抑制AC活性的升高。推测在吗啡依赖动物脑组织中 PKA 不是直接磷酸化 AC，而可能是通过激活磷酸酶使 AC 去磷酸化进而升高 AC 活性，这就构成了吗啡依赖中代偿性增强的 AC/cAMP 系统内部的一个正反馈调节，即AC/cAMP 的上调激活了 PKA，而 PKA 不仅能启动信号通路的下游信号反应，如使 CREB 磷酸化而改变一些基因的表达水平，还能反过来使上游信 号通路中的 AC 受到磷酸化调节而使 AC 活性进一步增强。 AC/cAMP-PKA 系统的这一正反馈调节可能与维持或上调、以及使神经元处于过度激活状态有关，因此可能是形成和维持吗啡依赖状态的一个重要机制。
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基金项目：国家自然科学基金 (39770852) 和卫生部科学基金 (96-1-018) 资助
Supported by the National Natural Sciences Foundation of China (39770852)
and the Foundation for Scientific Research, Ministry of Health, China
(96-1-018);
作者简介：Corresponding author Tel: 01065296403， Fax:01065256546，E-mail:jsliu 99@263.net
作者单位：方芳(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室， 北京 100005)
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汪青(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室， 北京 10 0005)
曹清(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室， 北京 10 0005)
刘景生(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所药理室， 北京
100005)
参考文献：
[1] Sharma SK, Klee WA, Nirenberg M, et al. Dual regulation of adenylate cyclas e accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc Natl Acad Sci USA, 1975, 72: 3092-3096
, http://www.100md.com
[2] Musacchio JM, Greenspan DL. The adenylate cyclase rebound response to naloxone in the NG108-15cells: effects of etorphine and other opiates. Neuropharmacolog y, 1986, 25: 833-837
[3] Naito K, Kuriyama K. Effect of morphine administration on adenyl cyclase and 3 ', 5'～cyclic nucleotide phosphodiesterase activites in the brain. Japan J Ph armacol, 1973, 23: 274-276
[4] Duman RS, Tallman JF, Nestler EJ, et al. Acute and chronic opiate-regulati o n of adenylate cyclase in brain: specific effects in locus coeruleus. J Pharmac ol Exp Ther, 1988, 46: 1033-1039
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[5] 方 芳， 陈轶琨， 王小明， 等. 吗啡长时程作用对小鼠脑组织蛋白 激酶 A 及 C 活性的影响. 基础医学与临床， 1997， 17： 115-120
[6] Fleming LM, Ponjee G, Childers SR. Inhibition of protein phosphorylation by opi oid-inhibited adenylyl cyclase in rat brain membranes. J Phharmacol Exp Ther, 1992, 260: 1416-1424
[7] Guitart X, Nestler EJ. Identification of morphine-and cyclic AMP-regulated-p hospoprotein (MMRPPS) in the locus coeruleus and other regions of rat brain: reg ulation by acute and chronic morphine. J Neurosci, 1989, 9: 4371-4387
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[8] Dolphin AC. Nucleotide binding proteins in signal transduction and disease. TI NS, 1987, 10: 53-57
[9] Nestler EJ. Molecular mechanisms of drug addiction. J Neurosci, 1992, 12: 2439 -2450
[10] Nestler EJ, Tallman JF. Chronic morphine treatment increases cyclic AMP depende n t protein kinase activity in the rat locus coeruleus. Mol Pharmcol, 1988, 33: 1 27-132
[11] Ehrlich YH, Bonnet KA, Davis LG, et al. Decreased phosphorylation of specif ic proteins in neostriatal membranes from rats after long-term narcotics exposu re. Life Sci, 1978, 23: 137-146
[12] Williams N, Clouet DH. The effect of acute opioid administration on the phospho rylation of rat striatal synaptic membrane proteins. J Pharmacol Exp Ther, 1982 , 220: 278-286, 百拇医药