近端型脊肌萎缩症骨骼肌病理及其形态定量分析的研究
李洵桦 田伟 马耘田 陈燕奎
摘 要：目的 探讨骨骼肌病理活检和病变肌细胞形态定量分析对婴儿及儿童期发病脊肌萎缩症的临床诊断意义。方法 15岁以下脊肌萎缩症31例，肌肉活检标本作常规HE染色和肌肉酶组化染色，应用图像分析系统对肌肉活检切片进行定量分析，计算每例正常细胞平均面积与病变细胞平均面积的比值。结果 肌肉病理和免疫组化改变为神经性肌萎缩，肌细胞变圆或呈角形，出现病变细胞变圆的都为1岁以前的患者，而1岁以后发病的患者大多出现呈角形细胞；半数有明显的同型肌群化现象。两种细胞的面积比值与发病年龄呈负相关(r=-0.27，P<0.05)，而与病程呈正相关(r=0.37,P<0.01)，与年龄没有相关关系。结论 应用图像分析系统对肌肉切片进行定量分析，以正常细胞与病变细胞面积比值可作为判断脊肌萎缩症病变程度的指标之一。
关键词：脊肌萎缩症 肌肉活检 图像分析
发生在儿童及少年期的进行性脊肌萎缩症是最常见的近端型脊肌萎缩症，具有特殊的肌肉病理特征，现就一组15岁以下的脊肌萎缩症患者肌肉病理及其形态定量分析结果报告如下。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 研究资料 1988～1998年间在我科就诊的15岁以下近端型脊肌萎缩症患者，均获得肌肉活检确诊并保留了完整的肌活检资料(切片标本)，共31例，平均年龄6.6岁。其中，男21例，平均年龄6.9岁，女10例，平均年龄6.1岁。发病年龄：2个月龄～9岁，平均2.0岁，其中1岁以内发病的16例(51%)。病程6个月～14年，平均4.44年。根据1992年欧洲神经肌肉疾病中心(European Neuromuscular Center)召开的SMA国际研讨会(International SMA Consortium Meeting)上提出的脊肌萎缩症的分型标准[1]，本组Ⅰ型脊肌萎缩症(SMAⅠ，又名Werdnig-Hoffmann病)8例；Ⅱ型脊肌萎缩症(SMAⅡ，又名中间型脊肌萎缩症)10例；Ⅲ型脊肌萎缩症(SMAⅢ，又名少年型进行性脊肌萎缩症或Wohlfart-Kugelberg-Welander病)13例。
, 百拇医药 1.2 病理活检 分别从腓肠肌、三角肌或股直肌各取肌肉一小块，异戊烷速冻并在液氮中保存，恒冷冰冻连续切片，作常规HE染色，并作肌肉酶组化肌球蛋白ATP酶，辅酶Ⅰ四唑氮氧化酶(NADH-TR)等染色以观察肌纤维的组化分型[2]。
1.3 图像分析 采用奥林巴斯BX-50型显微镜及HPIAX-1000型图像分析仪。在40×物镜下每张切片随机选取5个视野，每个视野分别对正常肌束和病变肌束中的5个细胞测量其细胞面积、细胞周长及核面积、核周长4项参数。并计算每1例正常细胞平均面积与病变细胞平均面积的比值[3，4]。
1.4 统计学分析 均数用t检验，相关分析用直线相关分析法。
2 结果
2.1 临床、电生理和肌肉活检的关系 本组有20例患者临床诊断为进行性脊肌萎缩症，4例为脊肌萎缩症与肌营养不良鉴别，3例为肌营养不良或先天性肌病，3例为四肢无力查因，1例怀疑腰骶神经损害或脑瘫。18例作了肌电图检查，结果全部均为神经性损害，其中10例检出巨大运动单位，提示前角细胞损害。全部肌肉活检结果均为神经性肌萎缩。
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2.2 肌肉病理和组化改变 普通病理改变以束性肌肉萎缩为主，可见萎缩与正常的肌纤维束同时存在；细胞核凝聚或固缩，部分呈链状排列；肌细胞变圆或呈角形，出现病变细胞变圆的都为1岁以前发病的患者，共11例，而出现呈角形细胞的20例患者有16例在1岁以后发病，1岁以前发病的只有4例。所有标本均见结缔组织增生，无炎症细胞浸润。免疫组化改变，在ATP酶染色多见以Ⅱ型肌纤维萎缩明显(15例，48.39%)，也有两型肌纤维均萎缩(13例，41.94%)或以Ⅰ型萎缩明显(3例，9.68%)。15例(48.39%)见明显的同型肌群化现象。Ⅰ型纤维占优势者8例，Ⅱ型纤维占优势者7例。个别可见靶型纤维(2例)和肥大纤维(2例)。
2.3 肌活检形态定量分析 结果显示病变肌细胞面积和周长较正常明显缩小，但细胞核改变不明显。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3组患者正常肌细胞与萎缩肌细胞面积比值分别为40.24±21.99，52.21±39.29，42.80±34.57，各组间均没有显著性差异(P>0.05)。相关分析结果显示：正常肌细胞与萎缩肌细胞面积比值与发病年龄呈负相关(r=-0.27，P<0.05)，而与病程呈正相关(r=0.37，P<0.01)，与年龄没有相关关系(r=0.09，P>0.05)。
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3 讨论
根据本病的发病年龄，以及进行性四肢无力，肌肉萎缩，肌张力极低，腱反射减低或消失，肌电图表现为神经性损害的临床特征，诊断不难。但本组有1/3(11例)的患者根据其临床表现未能作出确诊，最后通过骨骼肌活检病理结果得以确诊，提示对一些临床表现不典型或发病年龄较大的患者，需要与其他肌病，尤其是肌营养不良症鉴别，骨骼肌活检是诊断的一个重要手段。
本组肌肉病理改变以束性肌萎缩为主，在免疫组化中显示以Ⅱ型肌纤维萎缩为主，或两型肌纤维均有萎缩，符合失神经支配后肌肉病理改变。半数病例显示同型肌群化改变，提示有失神经后的神经再支配现象。文献报告在婴儿肌肉活检失神经支配肌纤维呈圆形改变，而不是象成人的呈角形改变，提示肌肉病理改变在胎儿期就由于先天性的脊髓前角细胞功能障碍而发生[2]。本组出现细胞变圆的全都为1岁以内发病的患者，而1岁以后发病的患者则多出现角形变化的肌纤维，与陈碧芬等[5]报道相符，提示发病年龄较早的患者可能在胚胎期已经存在脊髓前角细胞的病理改变，而发病年龄较大的患者，脊髓前角的病变可能于出生后才发生，我们曾在部分1岁以前发病的SMA患者脊髓MR图像中见明显的脊髓全长缩短，脊髓变小，也符合本病肌纤维病理改变的发生机制。
, 百拇医药
本组肌肉活检病理切片经图像分析，以每例正常肌细胞与萎缩肌细胞面积的比值作为判断肌细胞萎缩程度的指标，结果不同分型的脊肌萎缩症其面积比值无明显差别。但面积比值的变化与患者的发病年龄呈负相关而与病程呈正相关，即发病越早，病程越长，其面积比值越大，提示肌肉的萎缩越明显，而这种变化与年龄无关。这与临床上患者发病年龄越小，临床症状越严重，预后越差和病程越长肌肉萎缩程度越重的现象相一致，提示本指标有可能作为临床上判断患者病变程度的有意义指标之一。
课题部分获广东省科委博士启动基金资助(课题编号：974150)
李洵桦(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
田伟(广东药学院病理教研室)
马耘田(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
陈燕奎(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
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参考文献
1.Munsat T L, Eavies K E. International SMA consortium meeting.(26-28 June 1992, Bonn, Germany). Neuromusc Disord, 1992, 2(5-6):423
2.陈碧芬. 骨骼肌疾病病理学. 福州：福建科学技术出版社，1993. 120～131
3.申 洪，沈忠英. 实用生物体视学技术. 广州：中山大学出版社，1991. 50～112
4.陈建明，胡昌仁，张国华，等. 疫苗对日本血吸虫肝虫卵肉芽肿细胞作用的定量形态学的研究. 中国体视学与图像分析，1997，2(3)：165
5.陈碧芬，龚华实，姚宜卿， 等. 婴儿型进行性脊肌萎缩症骨骼肌活检的肌酶和免疫组织化学研究. 中华病理学杂志，1991， 20(1)：38, 百拇医药
摘 要：目的 探讨骨骼肌病理活检和病变肌细胞形态定量分析对婴儿及儿童期发病脊肌萎缩症的临床诊断意义。方法 15岁以下脊肌萎缩症31例，肌肉活检标本作常规HE染色和肌肉酶组化染色，应用图像分析系统对肌肉活检切片进行定量分析，计算每例正常细胞平均面积与病变细胞平均面积的比值。结果 肌肉病理和免疫组化改变为神经性肌萎缩，肌细胞变圆或呈角形，出现病变细胞变圆的都为1岁以前的患者，而1岁以后发病的患者大多出现呈角形细胞；半数有明显的同型肌群化现象。两种细胞的面积比值与发病年龄呈负相关(r=-0.27，P<0.05)，而与病程呈正相关(r=0.37,P<0.01)，与年龄没有相关关系。结论 应用图像分析系统对肌肉切片进行定量分析，以正常细胞与病变细胞面积比值可作为判断脊肌萎缩症病变程度的指标之一。
关键词：脊肌萎缩症 肌肉活检 图像分析
发生在儿童及少年期的进行性脊肌萎缩症是最常见的近端型脊肌萎缩症，具有特殊的肌肉病理特征，现就一组15岁以下的脊肌萎缩症患者肌肉病理及其形态定量分析结果报告如下。
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1 资料与方法
1.1 研究资料 1988～1998年间在我科就诊的15岁以下近端型脊肌萎缩症患者，均获得肌肉活检确诊并保留了完整的肌活检资料(切片标本)，共31例，平均年龄6.6岁。其中，男21例，平均年龄6.9岁，女10例，平均年龄6.1岁。发病年龄：2个月龄～9岁，平均2.0岁，其中1岁以内发病的16例(51%)。病程6个月～14年，平均4.44年。根据1992年欧洲神经肌肉疾病中心(European Neuromuscular Center)召开的SMA国际研讨会(International SMA Consortium Meeting)上提出的脊肌萎缩症的分型标准[1]，本组Ⅰ型脊肌萎缩症(SMAⅠ，又名Werdnig-Hoffmann病)8例；Ⅱ型脊肌萎缩症(SMAⅡ，又名中间型脊肌萎缩症)10例；Ⅲ型脊肌萎缩症(SMAⅢ，又名少年型进行性脊肌萎缩症或Wohlfart-Kugelberg-Welander病)13例。
, 百拇医药 1.2 病理活检 分别从腓肠肌、三角肌或股直肌各取肌肉一小块，异戊烷速冻并在液氮中保存，恒冷冰冻连续切片，作常规HE染色，并作肌肉酶组化肌球蛋白ATP酶，辅酶Ⅰ四唑氮氧化酶(NADH-TR)等染色以观察肌纤维的组化分型[2]。
1.3 图像分析 采用奥林巴斯BX-50型显微镜及HPIAX-1000型图像分析仪。在40×物镜下每张切片随机选取5个视野，每个视野分别对正常肌束和病变肌束中的5个细胞测量其细胞面积、细胞周长及核面积、核周长4项参数。并计算每1例正常细胞平均面积与病变细胞平均面积的比值[3，4]。
1.4 统计学分析 均数用t检验，相关分析用直线相关分析法。
2 结果
2.1 临床、电生理和肌肉活检的关系 本组有20例患者临床诊断为进行性脊肌萎缩症，4例为脊肌萎缩症与肌营养不良鉴别，3例为肌营养不良或先天性肌病，3例为四肢无力查因，1例怀疑腰骶神经损害或脑瘫。18例作了肌电图检查，结果全部均为神经性损害，其中10例检出巨大运动单位，提示前角细胞损害。全部肌肉活检结果均为神经性肌萎缩。
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2.2 肌肉病理和组化改变 普通病理改变以束性肌肉萎缩为主，可见萎缩与正常的肌纤维束同时存在；细胞核凝聚或固缩，部分呈链状排列；肌细胞变圆或呈角形，出现病变细胞变圆的都为1岁以前发病的患者，共11例，而出现呈角形细胞的20例患者有16例在1岁以后发病，1岁以前发病的只有4例。所有标本均见结缔组织增生，无炎症细胞浸润。免疫组化改变，在ATP酶染色多见以Ⅱ型肌纤维萎缩明显(15例，48.39%)，也有两型肌纤维均萎缩(13例，41.94%)或以Ⅰ型萎缩明显(3例，9.68%)。15例(48.39%)见明显的同型肌群化现象。Ⅰ型纤维占优势者8例，Ⅱ型纤维占优势者7例。个别可见靶型纤维(2例)和肥大纤维(2例)。
2.3 肌活检形态定量分析 结果显示病变肌细胞面积和周长较正常明显缩小，但细胞核改变不明显。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3组患者正常肌细胞与萎缩肌细胞面积比值分别为40.24±21.99，52.21±39.29，42.80±34.57，各组间均没有显著性差异(P>0.05)。相关分析结果显示：正常肌细胞与萎缩肌细胞面积比值与发病年龄呈负相关(r=-0.27，P<0.05)，而与病程呈正相关(r=0.37，P<0.01)，与年龄没有相关关系(r=0.09，P>0.05)。
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3 讨论
根据本病的发病年龄，以及进行性四肢无力，肌肉萎缩，肌张力极低，腱反射减低或消失，肌电图表现为神经性损害的临床特征，诊断不难。但本组有1/3(11例)的患者根据其临床表现未能作出确诊，最后通过骨骼肌活检病理结果得以确诊，提示对一些临床表现不典型或发病年龄较大的患者，需要与其他肌病，尤其是肌营养不良症鉴别，骨骼肌活检是诊断的一个重要手段。
本组肌肉病理改变以束性肌萎缩为主，在免疫组化中显示以Ⅱ型肌纤维萎缩为主，或两型肌纤维均有萎缩，符合失神经支配后肌肉病理改变。半数病例显示同型肌群化改变，提示有失神经后的神经再支配现象。文献报告在婴儿肌肉活检失神经支配肌纤维呈圆形改变，而不是象成人的呈角形改变，提示肌肉病理改变在胎儿期就由于先天性的脊髓前角细胞功能障碍而发生[2]。本组出现细胞变圆的全都为1岁以内发病的患者，而1岁以后发病的患者则多出现角形变化的肌纤维，与陈碧芬等[5]报道相符，提示发病年龄较早的患者可能在胚胎期已经存在脊髓前角细胞的病理改变，而发病年龄较大的患者，脊髓前角的病变可能于出生后才发生，我们曾在部分1岁以前发病的SMA患者脊髓MR图像中见明显的脊髓全长缩短，脊髓变小，也符合本病肌纤维病理改变的发生机制。
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本组肌肉活检病理切片经图像分析，以每例正常肌细胞与萎缩肌细胞面积的比值作为判断肌细胞萎缩程度的指标，结果不同分型的脊肌萎缩症其面积比值无明显差别。但面积比值的变化与患者的发病年龄呈负相关而与病程呈正相关，即发病越早，病程越长，其面积比值越大，提示肌肉的萎缩越明显，而这种变化与年龄无关。这与临床上患者发病年龄越小，临床症状越严重，预后越差和病程越长肌肉萎缩程度越重的现象相一致，提示本指标有可能作为临床上判断患者病变程度的有意义指标之一。
课题部分获广东省科委博士启动基金资助(课题编号：974150)
李洵桦(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
田伟(广东药学院病理教研室)
马耘田(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
陈燕奎(中山医科大学附属第一医院神经科 510080)
, 百拇医药
参考文献
1.Munsat T L, Eavies K E. International SMA consortium meeting.(26-28 June 1992, Bonn, Germany). Neuromusc Disord, 1992, 2(5-6):423
2.陈碧芬. 骨骼肌疾病病理学. 福州：福建科学技术出版社，1993. 120～131
3.申 洪，沈忠英. 实用生物体视学技术. 广州：中山大学出版社，1991. 50～112
4.陈建明，胡昌仁，张国华，等. 疫苗对日本血吸虫肝虫卵肉芽肿细胞作用的定量形态学的研究. 中国体视学与图像分析，1997，2(3)：165
5.陈碧芬，龚华实，姚宜卿， 等. 婴儿型进行性脊肌萎缩症骨骼肌活检的肌酶和免疫组织化学研究. 中华病理学杂志，1991， 20(1)：38, 百拇医药