抗中性粒细胞胞浆抗体在炎性肠病中的意义
王晓娣 董恩钰
摘要 目的：研究抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)在炎性肠病(IBD)中的发生率、其针对的靶抗原及其与临床疾病活动性的关系。方法：用间接免疫荧光法对76例溃疡性结肠炎(UC)、36例克隆病(CD)及210例正常者进行ANCA的筛选测定，用ELISA检测ANCA针对的不同靶抗原。结果：76例UC患者中血清ANCA阳性者占71.1%，均为核周型染色，明显高于CD患者ANCA的阳性率(8.3%,P<0.001)。UC病人ANCA针对的抗原主要是增加通透性杀菌蛋白(BPI)。BPI-ANCA的阳性率与UC疾病活动度(Truelove-Witts 分类法)呈明显的正相关。血清BPI-ANCA的水平与临床疾病活动参数如C-反应蛋白、血沉、肿瘤坏死因子-α和血清白蛋白的水平均呈显著相关(P值均<0.001)，但BPI-ANCA的存在与UC的病变部位、是否应用免疫抑制剂治疗无明显关系。结论：BPI 是UC 患者 ANCA的主要靶抗原，BPI-ANCA 的检测不但有助于UC 和 CD的鉴别诊断，而且是判定UC疾病活动性的重要免疫学指标。该结果提示了UC 和CD免疫病理机制的不同和UC发病机制的多样性。
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关键词：抗体，抗中性白细胞胞质 结肠炎，溃疡性 Crohn病
抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是一组针对中性粒细胞胞浆成分，如蛋白水解酶-3(PR3)、髓过氧化物酶(MPO)、 弹性蛋白酶(EL)、 组织蛋白酶G(CG)、溶菌酶( LY)、乳铁蛋白(LF) 及通透性杀菌蛋白(BPI)等抗体的总称。用间接免疫荧光法(IIF)可将其分为2型： 胞浆型(cANCA)和核周型(pANCA)，另有少数为不典型染色的ANCA(aANCA)。不同类型ANCA所针对的抗原成分不同[1]。ANCA与系统性血管炎的发生及发展有密切地关系，特别是cANCA是韦格纳肉芽肿病的1项非常特异及敏感的免疫学诊断指标。而pANCA除见于血管炎性疾病以外，也可见于其他炎性疾病[1]。近年来，有人报道ANCA在炎性肠病(IBD)中起一定作用，但尚无统一的结论，IBD中ANCA作用的靶抗原也不清楚[2-4]。因此，本研究的目的是为了解IBD中ANCA所针对的特异性抗原及其与疾病活动性的关系。
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对象与方法
一、 对象
溃疡性结肠炎(UC)病人76例，男44例，女32例，平均年龄45岁，为1990年至1997年在德国Lubeck大学医院住院的患者。UC的诊断依据患者的临床表现、结肠镜、组织病理学及放射学检查确定。按结肠镜下所见的病变部位不同将UC病人分为2组：远端结肠受累组 (结肠镜下见病变区在60 cm以内)37例和广泛结肠受累组(病变区大于60 cm)39例。疾病的活动性根据Truelove-Witts 分类法[5]分3组：轻度组17例，中度组39例，重度组20例。在76例UC病人中，有50例病人接受了免疫抑制剂治疗(主要为硫唑嘌呤和环胞素等)，另外26例则未曾使用过免疫抑制剂治疗。CD患者36例，男20例，女16例，平均年龄42岁，为1990年至1997年在德国Lubeck大学医院住院的患者。克隆病(CD)的诊断根据疾病的临床表现以及结肠镜、组织病理、放射线检查而确定。36例CD患者中，有29例接受免疫抑制剂治疗，7例未用免疫抑制剂治疗。正常对照组210例，均来源于医院血液中心的献血者，男性110例，女性100例，平均年龄38岁。
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二、IIF测定ANCA
根据欧洲ANCA研究协作组制定的方法加以改进[6]。主要步骤为：纯化的中性粒细胞用酒精固定于载玻片上,干燥后加入不同稀释度的待测血清、阴性和阳性对照，室温孵育后加入用荧光素标记的羊抗人IgG，在荧光显微镜下分析ANCA的荧光染色类型。如果血清pANCA阳性，则进一步与抗核抗体鉴别，即改为甲醛固定中性粒细胞，再用上述方法检测其荧光染色类型，如为胞浆型染色则可确定该标本为pANCA阳性，如果不是明确的胞浆型染色，可进一步用酒精固定Hep-2 细胞再测定其荧光类型，若结果为核周型染色且滴定大于原来用酒精固定细胞时测得滴度的4倍，则也可认为pANCA阳性，反之则为aANCA。
三、ELISA测定ANCA的靶抗原
1.BPI-ANCA: 在96孔板中每孔加入100 μl的重组BPI (2 mg/L)，置于4℃过夜。洗板3次后用小牛血清白蛋白封闭1 h，加入100 μl/孔阳性标准对照及待测血清标本。室温孵育1 h并洗板后每孔加入100 μl的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，置室温1 h，洗板，加入底物后室温反应1 h，405 nm波长处测定每孔的吸光度(A)值，大于20单位为阳性。
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2. BPI-ANCA的竞争性抑制试验：所有用上述方法测定的BPI-ANCA阳性的血清均进行竞争性抑制ELISA分析[3]，用以证明BPI-ANCA的阳性结果的特异性。
3. ANCA针对其他靶抗原的测定：PR3-ANCA和MPO-ANCA用DLD诊断公司(德国，汉堡)提供的试剂盒测定，大于20单位为阳性，ANCA针对其他靶抗原：EL、CG、LY、LF的测定方法与检测BPI-ANCA的方法相同，其A值大于正常对照组的均值+3个标准差时则被认为是阳性标本。
4.肿瘤坏死因子-α (TNFα)的检测：用BSI公司的ELISA试剂盒进行测定。
四、统计分析
各组间ANCA阳性率的差异用χ2检验，血清BPI-ANCA水平与临床其他活动参数的相关性分析用Pearson相关性检验。
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结果
一、正常对照组中ANCA的阳性率
210例正常对照者中，有2例ANCA血清阳性 (1%)，其中pANCA和aANCA各1例。pANCA阳性的血清经ELISA测定为MPO-ANCA，aANCA阳性者未发现其特异性抗原(表1)。
表1 IBD患者及正常对照者血清ANCA阳性率(%)
检测指标
UC组
(76例)
CD组
(36例)
正常组
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(210例)
IIF的总阳性率
54 (71.1%)**#
3 (8.3%)*
2 (1.0%)
pANCA
54 (71.1%)**#
3 (8.3%)*
1 (0.5%)
aANCA
0
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0
1(0.5%)
ELISA的总阳性率
43 (56.6%)**#
2 (5.6%)*
1 (0.5%)
MPO-ANCA
2 (2.6%)
0
1 (0.5%)
LF-ANCA
4 (5.3%)
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1 (2.8%)
0
BPI-ANCA
37 (48.8%)**
1 (2.8%)
0
注：3组中cANCA、PR3-ANCA、CG-ANCA、EL-ANCA、LY-ANCA的阳性率均为0。与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.001； 与CD组比较:# P<0.001
二、UC患者血清ANCA的阳性率及其与临床活动性的关系
1.IIF测定：76例UC病人中，有54例(71.1%)ANCA阳性, 且均为pANCA型(表1)，UC组ANCA的阳性率明显高于CD组及正常对照组(P值均<0.001)。
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2.ELISA测定：我们共检测了7种ANCA的靶抗原，结果发现76例UC病人中有37例(48.8%)血清BPI-ANCA阳性，竞争性ELISA试验证明它们均能被重组BPI竞争抑制达30%以上，说明它们的BPI-ANCA具有特异性。另有4例(5.3%)为LF-ANCA阳性，2例(2.6%)为MPO-ANCA阳性。未发现有针对PR3、EL、CG及LY抗原的阳性血清(表1)。
3.IIF与ELISA的结果比较：在54例IIF测定为血清ANCA阳性的病人中，有35例BPI-ANCA阳性，占64.8%，LF-ANCA阳性的3例(5.6%)，MPO-ANCA阳性血清2例(3.7%)。另14例IIF测定为ANCA阳性的血清未能发现它们所针对的特异性抗原，相反在22例IIF测定为ANCA阴性的血清中有2例为BPI-ANCA阳性(占9.1%)，1例为LF-ANCA阳性(占4.5%)。
4.ANCA的阳性率与疾病活动性的关系：在17例轻度UC病人中，pANCA阳性者13例(76.5%)，但BPI-ANCA阳性者只有2例(11.8%)。39例中度组中pANCA阳性的24例(61.5%), BPI-ANCA阳性的18例(46.1%)。20例重度组中pANCA和BPI-ANCA阳性者均为17例(85.0%)。统计学分析表明，3组间的pANCA阳性率无明显不同(P>0.05)，但BPI-ANCA的阳性率差异具有显著性，中度组明显高于轻度组(P<0.05)，重度组明显高于中度组和轻度组(P值均<0.01)。分析了血清BPI-ANCA的浓度与UC其他临床疾病活动参数的相关性。发现BPI-ANCA的浓度与血清中C-反应蛋白的浓度(r=0.74, P<0.001)、血沉(r=0.66, P<0.001)以及TNFα的浓度(r=0.59, P<0.001)均呈显著正相关，与血清白蛋白浓度呈明显负相关(r=-0.44, P<0.001)。
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5.ANCA与疾病不同受累部位的关系：在37例远端结肠受累组，有23例(62.2%) 患者pANCA阳性，16例(43.2%)BPI-ANCA阳性。39例广泛结肠受累组中，血清pANCA阳性者占31例(79.5%)，BPI-ANCA阳性者占21例(53.8%)，无论是pANCA还是BPI-ANCA的阳性率两组间均无统计学差异(P值均>0.05)。
6.ANCA与免疫抑制剂治疗的关系：在50例接受免疫抑制剂治疗者中，有34例(68.0%) pANCA阳性，20例(40.0%)BPI-ANCA阳性。26例未使用免疫抑制剂治疗者中，pANCA阳性的20例(76.9%)，BPI-ANCA阳性的17例(65.4%)。二者的阳性率在不同的治疗组间均无明显差异(P值均>0.05)。
三、CD患者ANCA的阳性率
36例CD患者中，用IIF法检测有3例(8.3%)ANCA阳性，且均为pANCA型。其阳性率高于正常对照组(P<0.05)，但明显低于UC患者ANCA的阳性率(P<0.001)。用ELISA测定发现BPI-ANCA和LF-ANCA阳性的各1例。另外1例pANCA阳性的血清其特异性抗原不明(表1)。
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讨论
ANCA在IBD中的发生率目前的报道各不相同。UC的ANCA阳性率在27%～83%之间，CD则为0～24%[7]。造成这种差异的原因可能与病例的选择及病例数目的不同有关，更主要的是与测定方法的不同有关。为了避免假阳性或假阴性结果，在每次ANCA的检测中均设有阴性和阳性对照。我们证明UC患者ANCA的阳性率为71.1%，且均为pANCA，明显高于CD患者(8.3%)。最近Freeman等[4]报道了500例IBD大样本的ANCA测定，其结果(ANCA阳性率在UC为66.3%，CD为11.8%)与本文相似。ANCA在UC和CD中阳性率的明显不同，说明两者在发病机制上的差别，也提示UC与自身抗体介导的体液免疫关系更为密切。
许多研究证明 IBD中ANCA所针对的抗原并非单一，具有多元性[3]。这可能反映了IBD发病机制的多样性。但未发现有PR3-ANCA和EL-ANCA[7]。Mayet等[8]曾报道CG是IBD中ANCA的主要靶抗原，Peen等[9]和Mulder等[10]则发现LF-ANCA在IBD中的阳性率最高(40%)。但这些结果都不能被其他研究者所重复[5]，我们也未测得有针对PR3、CG、EL及LY抗原的ANCA，而MPO-ANCA和LF-ANCA的阳性率也很低，分别为2.6%和5.3%。相反，我们发现BPI可能是UC患者ANCA的主要靶抗原。76例UC病人中约有一半的病人(48.8%)为BPI-ANCA阳性。在IIF法测得ANCA阳性的患者中有64.8%的患者为BPI-ANCA阳性。IBD的发生一直被认为与微生物的感染有关。BPI是一类阴离子抗菌蛋白，对革兰阴性杆菌如大肠杆菌等具有杀伤作用，同时它又有结合脂多糖、中和内毒素的作用[3]。因此，它是粒细胞防御和清除外界感染的重要因子。UC病人BPI-ANCA的出现可能与机体在某种微生物感染后，触发中性粒细胞BPI的合成和释放增加，而机体的免疫识别及调节的异常可产生针对BPI的自身抗体。当然BPI-ANCA的产生及其确切的病理作用尚有待于进一步的深入研究。
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在UC病人BPI-ANCA阳性的血清中，还有2例用IIF法检测时为阴性，这可能是由于粒细胞内BPI在用酒精固定时很容易受到其他酶颗粒如PR3、CG等影响而使其抗原性消失，从而不能测到明确的荧光类型。虽然BPI-ANCA的阳性率与UC受累部位及是否使用免疫抑制剂治疗无关，但我们发现它与疾病的活动性呈明显正相关。在重度组有85.0%的病人BPI-ANCA阳性，明显高于中度组(46.1%)和轻度组(11.8%)。另外血清BPI-ANCA的水平与UC的其他临床活动指标如血沉、C-反应蛋白、TNFα及白蛋白的水平均呈显著相关，说明BPI-ANCA的水平变化反映了疾病的活动性，是判定疾病活动性的重要指标。 36例CD患者中，只有1例BPI-ANCA呈阳性(2.8%)，明显低于UC患者的阳性率，这也说明两者发病机制的差异。因此，BPI-ANCA的测定也有助于两者的鉴别诊断。
总之，ANCA在UC中的阳性率明显增高，对UC的诊断有一定的特异性，有助于UC和CD的鉴别诊断，但它不是一个敏感的指标，ANCA抗体滴度的变化与UC疾病活动无相关性。而BPI-ANCA不但是UC的一个比较特异性的免疫学诊断指标，而且其抗体水平的变化反映了UC疾病活动性的改变。因此,开展BPI-ANCA的测定不但有助于UC和CD的鉴别诊断，还可用于监测UC疾病活动性的变化，指导UC的治疗。
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志谢 本文的实验部分在德国Lubeck大学完成。感谢C.Moeck医生在病例收集方面给予的帮助
作者单位：王晓娣(北京，中日友好医院消化内科 100029)
董恩钰(北京，中日友好医院消化内科 100029)
参考文献
1 Gross WL, Csernok E. Immunodiagnostic and pathophysiological aspects of antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in vasculitis. Curr Opin Rheumatol， 1995，7:11-19.
2 Abad E, Tural C, Mirapeix E, et al. Relationship between ANCA and clinical activity in inflammatory bowel disease: variation in prevalence of ANCA and evidence of heterogeneity. J Autoimmun, 1997, 10: 175-180.
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3 Stoffel MP, Csernok E, Herzberg C, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) directed against bactericidal/permeability increasing protein (BPI): a new seromarker for inflammatory bowel disease and associated disorders. Clin Exp Immunol, 1996, 104:54-59.
4 Freeman H, Roeck B, Devine D, et al. Prospective evaluation of antineutrophil autoantibodies in 500 consecutive patients with inflammatory bowel disease. Can J Gastroenterol, 1997, 11:203-207.
, http://www.100md.com
5 Tabaqchahi S, Jumaa P. Diagnosis and management of ulcerative colitis. BMJ, 1995, 317:1041-1048.
6 Hagen EC, Andrassy K, Csernok E, et al. The value of indirect immunofluorescence and solid phase techniques for ANCA detection: a report on the first phase of an international cooperative study on the standardization of ANCA assays. J Immunol Method, 1993, 159:1-16.
7 Duerr RH， Targan SR, Landers CJ, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies in ulcerative colitis. Comparsion with other colitides/diarrhoeal illness. Gastroenterology, 1991, 100:1590-1596.
, 百拇医药
8 Mayet WJ, Hermann E, Finsterwalder J, et al. Antibodies to cathepsin G in Crohn′s disease. Eur J Invest，1992, 22:427-433.
9 Peen E, Almer S, Bodemar G, et al. Antilactoferrin antibodies and other types of ANCA in ulcerative colitis, primary sclerosing cholangitis and Crohn′s disease. Gut, 1993, 34:56-62.
10 Mulder AHL, Broekroelofs J, Horst G, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies in inflammatory bowel disease: characterization and clinical correlates. Clin Exp Immunol, 1994, 95:490-497., 百拇医药
摘要 目的：研究抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)在炎性肠病(IBD)中的发生率、其针对的靶抗原及其与临床疾病活动性的关系。方法：用间接免疫荧光法对76例溃疡性结肠炎(UC)、36例克隆病(CD)及210例正常者进行ANCA的筛选测定，用ELISA检测ANCA针对的不同靶抗原。结果：76例UC患者中血清ANCA阳性者占71.1%，均为核周型染色，明显高于CD患者ANCA的阳性率(8.3%,P<0.001)。UC病人ANCA针对的抗原主要是增加通透性杀菌蛋白(BPI)。BPI-ANCA的阳性率与UC疾病活动度(Truelove-Witts 分类法)呈明显的正相关。血清BPI-ANCA的水平与临床疾病活动参数如C-反应蛋白、血沉、肿瘤坏死因子-α和血清白蛋白的水平均呈显著相关(P值均<0.001)，但BPI-ANCA的存在与UC的病变部位、是否应用免疫抑制剂治疗无明显关系。结论：BPI 是UC 患者 ANCA的主要靶抗原，BPI-ANCA 的检测不但有助于UC 和 CD的鉴别诊断，而且是判定UC疾病活动性的重要免疫学指标。该结果提示了UC 和CD免疫病理机制的不同和UC发病机制的多样性。
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关键词：抗体，抗中性白细胞胞质 结肠炎，溃疡性 Crohn病
抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是一组针对中性粒细胞胞浆成分，如蛋白水解酶-3(PR3)、髓过氧化物酶(MPO)、 弹性蛋白酶(EL)、 组织蛋白酶G(CG)、溶菌酶( LY)、乳铁蛋白(LF) 及通透性杀菌蛋白(BPI)等抗体的总称。用间接免疫荧光法(IIF)可将其分为2型： 胞浆型(cANCA)和核周型(pANCA)，另有少数为不典型染色的ANCA(aANCA)。不同类型ANCA所针对的抗原成分不同[1]。ANCA与系统性血管炎的发生及发展有密切地关系，特别是cANCA是韦格纳肉芽肿病的1项非常特异及敏感的免疫学诊断指标。而pANCA除见于血管炎性疾病以外，也可见于其他炎性疾病[1]。近年来，有人报道ANCA在炎性肠病(IBD)中起一定作用，但尚无统一的结论，IBD中ANCA作用的靶抗原也不清楚[2-4]。因此，本研究的目的是为了解IBD中ANCA所针对的特异性抗原及其与疾病活动性的关系。
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对象与方法
一、 对象
溃疡性结肠炎(UC)病人76例，男44例，女32例，平均年龄45岁，为1990年至1997年在德国Lubeck大学医院住院的患者。UC的诊断依据患者的临床表现、结肠镜、组织病理学及放射学检查确定。按结肠镜下所见的病变部位不同将UC病人分为2组：远端结肠受累组 (结肠镜下见病变区在60 cm以内)37例和广泛结肠受累组(病变区大于60 cm)39例。疾病的活动性根据Truelove-Witts 分类法[5]分3组：轻度组17例，中度组39例，重度组20例。在76例UC病人中，有50例病人接受了免疫抑制剂治疗(主要为硫唑嘌呤和环胞素等)，另外26例则未曾使用过免疫抑制剂治疗。CD患者36例，男20例，女16例，平均年龄42岁，为1990年至1997年在德国Lubeck大学医院住院的患者。克隆病(CD)的诊断根据疾病的临床表现以及结肠镜、组织病理、放射线检查而确定。36例CD患者中，有29例接受免疫抑制剂治疗，7例未用免疫抑制剂治疗。正常对照组210例，均来源于医院血液中心的献血者，男性110例，女性100例，平均年龄38岁。
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二、IIF测定ANCA
根据欧洲ANCA研究协作组制定的方法加以改进[6]。主要步骤为：纯化的中性粒细胞用酒精固定于载玻片上,干燥后加入不同稀释度的待测血清、阴性和阳性对照，室温孵育后加入用荧光素标记的羊抗人IgG，在荧光显微镜下分析ANCA的荧光染色类型。如果血清pANCA阳性，则进一步与抗核抗体鉴别，即改为甲醛固定中性粒细胞，再用上述方法检测其荧光染色类型，如为胞浆型染色则可确定该标本为pANCA阳性，如果不是明确的胞浆型染色，可进一步用酒精固定Hep-2 细胞再测定其荧光类型，若结果为核周型染色且滴定大于原来用酒精固定细胞时测得滴度的4倍，则也可认为pANCA阳性，反之则为aANCA。
三、ELISA测定ANCA的靶抗原
1.BPI-ANCA: 在96孔板中每孔加入100 μl的重组BPI (2 mg/L)，置于4℃过夜。洗板3次后用小牛血清白蛋白封闭1 h，加入100 μl/孔阳性标准对照及待测血清标本。室温孵育1 h并洗板后每孔加入100 μl的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，置室温1 h，洗板，加入底物后室温反应1 h，405 nm波长处测定每孔的吸光度(A)值，大于20单位为阳性。
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2. BPI-ANCA的竞争性抑制试验：所有用上述方法测定的BPI-ANCA阳性的血清均进行竞争性抑制ELISA分析[3]，用以证明BPI-ANCA的阳性结果的特异性。
3. ANCA针对其他靶抗原的测定：PR3-ANCA和MPO-ANCA用DLD诊断公司(德国，汉堡)提供的试剂盒测定，大于20单位为阳性，ANCA针对其他靶抗原：EL、CG、LY、LF的测定方法与检测BPI-ANCA的方法相同，其A值大于正常对照组的均值+3个标准差时则被认为是阳性标本。
4.肿瘤坏死因子-α (TNFα)的检测：用BSI公司的ELISA试剂盒进行测定。
四、统计分析
各组间ANCA阳性率的差异用χ2检验，血清BPI-ANCA水平与临床其他活动参数的相关性分析用Pearson相关性检验。
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结果
一、正常对照组中ANCA的阳性率
210例正常对照者中，有2例ANCA血清阳性 (1%)，其中pANCA和aANCA各1例。pANCA阳性的血清经ELISA测定为MPO-ANCA，aANCA阳性者未发现其特异性抗原(表1)。
表1 IBD患者及正常对照者血清ANCA阳性率(%)
检测指标
UC组
(76例)
CD组
(36例)
正常组
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(210例)
IIF的总阳性率
54 (71.1%)**#
3 (8.3%)*
2 (1.0%)
pANCA
54 (71.1%)**#
3 (8.3%)*
1 (0.5%)
aANCA
0
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1(0.5%)
ELISA的总阳性率
43 (56.6%)**#
2 (5.6%)*
1 (0.5%)
MPO-ANCA
2 (2.6%)
0
1 (0.5%)
LF-ANCA
4 (5.3%)
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1 (2.8%)
0
BPI-ANCA
37 (48.8%)**
1 (2.8%)
0
注：3组中cANCA、PR3-ANCA、CG-ANCA、EL-ANCA、LY-ANCA的阳性率均为0。与正常对照组比较：*P<0.05，**P<0.001； 与CD组比较:# P<0.001
二、UC患者血清ANCA的阳性率及其与临床活动性的关系
1.IIF测定：76例UC病人中，有54例(71.1%)ANCA阳性, 且均为pANCA型(表1)，UC组ANCA的阳性率明显高于CD组及正常对照组(P值均<0.001)。
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2.ELISA测定：我们共检测了7种ANCA的靶抗原，结果发现76例UC病人中有37例(48.8%)血清BPI-ANCA阳性，竞争性ELISA试验证明它们均能被重组BPI竞争抑制达30%以上，说明它们的BPI-ANCA具有特异性。另有4例(5.3%)为LF-ANCA阳性，2例(2.6%)为MPO-ANCA阳性。未发现有针对PR3、EL、CG及LY抗原的阳性血清(表1)。
3.IIF与ELISA的结果比较：在54例IIF测定为血清ANCA阳性的病人中，有35例BPI-ANCA阳性，占64.8%，LF-ANCA阳性的3例(5.6%)，MPO-ANCA阳性血清2例(3.7%)。另14例IIF测定为ANCA阳性的血清未能发现它们所针对的特异性抗原，相反在22例IIF测定为ANCA阴性的血清中有2例为BPI-ANCA阳性(占9.1%)，1例为LF-ANCA阳性(占4.5%)。
4.ANCA的阳性率与疾病活动性的关系：在17例轻度UC病人中，pANCA阳性者13例(76.5%)，但BPI-ANCA阳性者只有2例(11.8%)。39例中度组中pANCA阳性的24例(61.5%), BPI-ANCA阳性的18例(46.1%)。20例重度组中pANCA和BPI-ANCA阳性者均为17例(85.0%)。统计学分析表明，3组间的pANCA阳性率无明显不同(P>0.05)，但BPI-ANCA的阳性率差异具有显著性，中度组明显高于轻度组(P<0.05)，重度组明显高于中度组和轻度组(P值均<0.01)。分析了血清BPI-ANCA的浓度与UC其他临床疾病活动参数的相关性。发现BPI-ANCA的浓度与血清中C-反应蛋白的浓度(r=0.74, P<0.001)、血沉(r=0.66, P<0.001)以及TNFα的浓度(r=0.59, P<0.001)均呈显著正相关，与血清白蛋白浓度呈明显负相关(r=-0.44, P<0.001)。
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5.ANCA与疾病不同受累部位的关系：在37例远端结肠受累组，有23例(62.2%) 患者pANCA阳性，16例(43.2%)BPI-ANCA阳性。39例广泛结肠受累组中，血清pANCA阳性者占31例(79.5%)，BPI-ANCA阳性者占21例(53.8%)，无论是pANCA还是BPI-ANCA的阳性率两组间均无统计学差异(P值均>0.05)。
6.ANCA与免疫抑制剂治疗的关系：在50例接受免疫抑制剂治疗者中，有34例(68.0%) pANCA阳性，20例(40.0%)BPI-ANCA阳性。26例未使用免疫抑制剂治疗者中，pANCA阳性的20例(76.9%)，BPI-ANCA阳性的17例(65.4%)。二者的阳性率在不同的治疗组间均无明显差异(P值均>0.05)。
三、CD患者ANCA的阳性率
36例CD患者中，用IIF法检测有3例(8.3%)ANCA阳性，且均为pANCA型。其阳性率高于正常对照组(P<0.05)，但明显低于UC患者ANCA的阳性率(P<0.001)。用ELISA测定发现BPI-ANCA和LF-ANCA阳性的各1例。另外1例pANCA阳性的血清其特异性抗原不明(表1)。
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讨论
ANCA在IBD中的发生率目前的报道各不相同。UC的ANCA阳性率在27%～83%之间，CD则为0～24%[7]。造成这种差异的原因可能与病例的选择及病例数目的不同有关，更主要的是与测定方法的不同有关。为了避免假阳性或假阴性结果，在每次ANCA的检测中均设有阴性和阳性对照。我们证明UC患者ANCA的阳性率为71.1%，且均为pANCA，明显高于CD患者(8.3%)。最近Freeman等[4]报道了500例IBD大样本的ANCA测定，其结果(ANCA阳性率在UC为66.3%，CD为11.8%)与本文相似。ANCA在UC和CD中阳性率的明显不同，说明两者在发病机制上的差别，也提示UC与自身抗体介导的体液免疫关系更为密切。
许多研究证明 IBD中ANCA所针对的抗原并非单一，具有多元性[3]。这可能反映了IBD发病机制的多样性。但未发现有PR3-ANCA和EL-ANCA[7]。Mayet等[8]曾报道CG是IBD中ANCA的主要靶抗原，Peen等[9]和Mulder等[10]则发现LF-ANCA在IBD中的阳性率最高(40%)。但这些结果都不能被其他研究者所重复[5]，我们也未测得有针对PR3、CG、EL及LY抗原的ANCA，而MPO-ANCA和LF-ANCA的阳性率也很低，分别为2.6%和5.3%。相反，我们发现BPI可能是UC患者ANCA的主要靶抗原。76例UC病人中约有一半的病人(48.8%)为BPI-ANCA阳性。在IIF法测得ANCA阳性的患者中有64.8%的患者为BPI-ANCA阳性。IBD的发生一直被认为与微生物的感染有关。BPI是一类阴离子抗菌蛋白，对革兰阴性杆菌如大肠杆菌等具有杀伤作用，同时它又有结合脂多糖、中和内毒素的作用[3]。因此，它是粒细胞防御和清除外界感染的重要因子。UC病人BPI-ANCA的出现可能与机体在某种微生物感染后，触发中性粒细胞BPI的合成和释放增加，而机体的免疫识别及调节的异常可产生针对BPI的自身抗体。当然BPI-ANCA的产生及其确切的病理作用尚有待于进一步的深入研究。
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在UC病人BPI-ANCA阳性的血清中，还有2例用IIF法检测时为阴性，这可能是由于粒细胞内BPI在用酒精固定时很容易受到其他酶颗粒如PR3、CG等影响而使其抗原性消失，从而不能测到明确的荧光类型。虽然BPI-ANCA的阳性率与UC受累部位及是否使用免疫抑制剂治疗无关，但我们发现它与疾病的活动性呈明显正相关。在重度组有85.0%的病人BPI-ANCA阳性，明显高于中度组(46.1%)和轻度组(11.8%)。另外血清BPI-ANCA的水平与UC的其他临床活动指标如血沉、C-反应蛋白、TNFα及白蛋白的水平均呈显著相关，说明BPI-ANCA的水平变化反映了疾病的活动性，是判定疾病活动性的重要指标。 36例CD患者中，只有1例BPI-ANCA呈阳性(2.8%)，明显低于UC患者的阳性率，这也说明两者发病机制的差异。因此，BPI-ANCA的测定也有助于两者的鉴别诊断。
总之，ANCA在UC中的阳性率明显增高，对UC的诊断有一定的特异性，有助于UC和CD的鉴别诊断，但它不是一个敏感的指标，ANCA抗体滴度的变化与UC疾病活动无相关性。而BPI-ANCA不但是UC的一个比较特异性的免疫学诊断指标，而且其抗体水平的变化反映了UC疾病活动性的改变。因此,开展BPI-ANCA的测定不但有助于UC和CD的鉴别诊断，还可用于监测UC疾病活动性的变化，指导UC的治疗。
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志谢 本文的实验部分在德国Lubeck大学完成。感谢C.Moeck医生在病例收集方面给予的帮助
作者单位：王晓娣(北京，中日友好医院消化内科 100029)
董恩钰(北京，中日友好医院消化内科 100029)
参考文献
1 Gross WL, Csernok E. Immunodiagnostic and pathophysiological aspects of antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in vasculitis. Curr Opin Rheumatol， 1995，7:11-19.
2 Abad E, Tural C, Mirapeix E, et al. Relationship between ANCA and clinical activity in inflammatory bowel disease: variation in prevalence of ANCA and evidence of heterogeneity. J Autoimmun, 1997, 10: 175-180.
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3 Stoffel MP, Csernok E, Herzberg C, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA) directed against bactericidal/permeability increasing protein (BPI): a new seromarker for inflammatory bowel disease and associated disorders. Clin Exp Immunol, 1996, 104:54-59.
4 Freeman H, Roeck B, Devine D, et al. Prospective evaluation of antineutrophil autoantibodies in 500 consecutive patients with inflammatory bowel disease. Can J Gastroenterol, 1997, 11:203-207.
, http://www.100md.com
5 Tabaqchahi S, Jumaa P. Diagnosis and management of ulcerative colitis. BMJ, 1995, 317:1041-1048.
6 Hagen EC, Andrassy K, Csernok E, et al. The value of indirect immunofluorescence and solid phase techniques for ANCA detection: a report on the first phase of an international cooperative study on the standardization of ANCA assays. J Immunol Method, 1993, 159:1-16.
7 Duerr RH， Targan SR, Landers CJ, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies in ulcerative colitis. Comparsion with other colitides/diarrhoeal illness. Gastroenterology, 1991, 100:1590-1596.
, 百拇医药
8 Mayet WJ, Hermann E, Finsterwalder J, et al. Antibodies to cathepsin G in Crohn′s disease. Eur J Invest，1992, 22:427-433.
9 Peen E, Almer S, Bodemar G, et al. Antilactoferrin antibodies and other types of ANCA in ulcerative colitis, primary sclerosing cholangitis and Crohn′s disease. Gut, 1993, 34:56-62.
10 Mulder AHL, Broekroelofs J, Horst G, et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies in inflammatory bowel disease: characterization and clinical correlates. Clin Exp Immunol, 1994, 95:490-497., 百拇医药