p16与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子联合基因疗法治疗小鼠肾癌的研究
疗法治疗小鼠肾癌的研究
王林辉 孙颖浩 钱松溪 闵志廉 弭静 鞠佃文 曹雪涛
摘 要 目的 探讨瘤体内直接注射途径的p16抑癌基因疗法与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因疗法联合应用对小鼠肾癌(renca)的治疗效果及其免疫学机理。方法 建立皮下荷瘤肾癌小鼠模型，于接种肿瘤细胞3 d后将荷瘤小鼠随机分为5组，分别给予不同的治疗，检测每组小鼠的免疫功能，观察每组小鼠的存活期，并行肿瘤病理学分析。结果 Adp16+AdGM-CSF联合治疗组小鼠有2只长期存活(存活时间>90 d)，其他4组荷瘤小鼠均在52 d内死亡。联合治疗组小鼠与其他4组相比，存活期明显延长，差异有非常显著性(P<0.01)。联合治疗组小鼠自然杀伤细胞(NK)杀伤率为33%，与其他4组相比，差异有非常显著性(P<0.01)。结论 p16与GM-CSF联合基因疗法的应用可增强小鼠抗肿瘤免疫反应，并抑制肿瘤生长，延长荷瘤小鼠的存活期。
关键词：基因疗法 肿瘤抑制基因 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 腺病毒 肾癌
我们以皮下荷瘤的肾癌(renca)小鼠为模型，观察了瘤体内直接注射途径的p16抑癌基因疗法与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)基因疗法联合应用对恶性肿瘤的治疗效果，并对其治疗的免疫学机理进行分析，现将结果报道如下。
材料和方法
1.动物及细胞株：Balb/c小鼠，10～12周龄，体重21～23 g。293病毒包装细胞由德国柏林MDC分子医学中心Thomas Blankenstein博士惠赠。小鼠肾癌renca细胞株由美国国立癌症研究室Wiltrout博士惠赠。
2.主要试剂：Na251CrCO4购自Amersham公司；荧光标记的大鼠抗小鼠主要组织相容性复合体Ⅰ类抗原(MHCI)单抗m5/114购自Boehringer Heim;绿荧光(FITC)标记的大鼠抗小鼠凋亡分子受体(Fas)单抗购自Pharmingen。
3.重组腺病毒的扩增：293细胞采用RPMI 1640完全培养基培养，按感染重复度(MOI)值100分别加入携带p16基因、GM-CSF基因或LacZ基因的重组腺病毒，当293细胞大部分脱落时，分别收集细胞，反复冻融3～5次，镜下观察细胞完全碎解，4 ℃、5 000 r/min，离心20 min，收集上清-70 ℃保存备用。
4.重组腺病毒的滴度测定：采用微量细胞病变法[1]。
5.皮下荷瘤肾癌小鼠模型的建立和治疗：Renca细胞以5×108个/L悬浮于无血清RPMI 1640培养液中，经小鼠右股骨外侧皮下注射0.1 ml，共注射75只小鼠。接种肿瘤细胞3 d后将荷瘤小鼠随机分为5组，分别给予下述不同的治疗，于荷瘤后15 d每组处死5只小鼠，检测其免疫功能，并取瘤称重，进行病理学分析；剩余的每组10只小鼠作存活期观察。A组：(对照组)每天1次瘤体内注射PRMI 1640液0.1 ml；B组：(AdLacZ组)每天1次瘤体内注射AdLacZ 0.1 ml(1×108 PFU)；C组：(Adp16组)每天1次瘤体内注射Adp16 0.1 ml(1×108 PFU)；D组：(AdGM-CSF组)每天1次瘤体内注射AdGM-CSF 0.1 ml(1×108 PFU)；E组：(Adp16+AdGM-CSF组)每天1次瘤体内注射Adp16与AdGM-CSF各0.1 ml(各为1×108 PFU)，每组均连续注射1周。
6.小鼠NK细胞杀伤活性的检测：采用4 h 51Cr释放法进行NK活性测定，方法参见文献[2，3]。
7.皮下荷瘤组织细胞表型分析：分离所得肿瘤细胞中分别加入大鼠抗小鼠MHCI抗体和Fas抗体，FACS检测荧光强度。
8.常规肿瘤病理学分析：于荷瘤第16 d取肿瘤组织作常规组织学分析。
结 果
1.Adp16和AdGM-CSF联合瘤体内注射对荷瘤小鼠存活期的影响：经不同治疗后各组小鼠平均存活期分别为：RPMI 1640对照组为(27.0±2.2) d；AdLacZ组为(29.0±2.5) d，Adp16组为(52.0±3.4) d；AdGM-CSF组为(45.0±2.6) d；Adp16+AdGM-CSF组有2只长期存活，其余存活期为(61.0±3.5) d。
2.Adp16与AdGM-CSF联合瘤体内注射对荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性的影响：与对照组相比，单用Adp16或AdGM-CSF治疗的荷瘤小鼠NK活性无明显升高；当与AdGM-CSF合用时，NK活性有明显升高(P<0.05)，升高幅度达33%。
3.皮下荷瘤组织细胞表型分析：Adp16基因转染的Renca细胞Fas和MHCl分子表达水平与AdLacZ基因转染组细胞及野生型Renca细胞相比有明显上调。
4.Adp16与AdGM-CSF联合瘤体内注射后荷瘤小鼠肿瘤病理：对照组瘤区癌细胞呈多角性及嗜碱性着色，癌细胞结构完整，胞核畸形明显，核/浆比例增大，显示肿瘤细胞生长旺盛，周围未见炎性细胞浸润，而Adp16与AdGM-CSF联合治疗组，肿瘤细胞界限不清，胞浆崩解，局部坏死明显，周围有较多的炎性细胞。免疫组织化学结果显示，肿瘤周围浸润的单个核细胞主要是T淋巴细胞。
讨 论
GM-CSF能增强机体NK细胞的杀伤活性，同时能促进肿瘤细胞MHCI类分子和Fas分子的表达，提高肿瘤细胞的免疫原性并诱导肿瘤细胞的凋亡。p16与GM-CSF基因联合疗法可以显著抑制肿瘤生长，使荷瘤小鼠存活期明显延长，并且有20%的小鼠能长期存活，说明上述联合基因疗法能有效治疗肾癌小鼠。联合治疗使小鼠体内NK杀伤活性明显升高，与对照组相比，升高33%。因此，p16与GM-CSF联合基因疗法的应用可促进机体多细胞介导的抗瘤反应，这些介导的细胞主要包括巨噬细胞、粒细胞、淋巴细胞及浆细胞等炎性细胞。
作者单位：王林辉(200433上海，第二军医大学附属长海医院泌尿外科)
孙颖浩(200433上海，第二军医大学附属长海医院泌尿外科)
钱松溪(200433上海，第二军医大学附属长海医院泌尿外科)
闵志廉(第二军医大学长征医院泌尿外科)
弭静(第二军医大学免疫学教研室)
鞠佃文(第二军医大学免疫学教研室)
曹雪涛(第二军医大学免疫学教研室)
参考文献
[1]Mccray PB, Armstrong K, Zabner J, et al. Adenoviral-mediated gene transfer to fetal pulmonary epithelia in vitro and in vivo. J Clin Invest, 1995,95:2 620-2 632.
[2]Celluzzi CM, Mayordomo J, Storkus W, et al. Piptide-pulsed den-
dritic cells induce antigen-specific, CTL-mediated protective tumor immunity. J Exp Med, 1996,183:283-287.
[3]Cao X, Wang J, Zhang W, et al. Treatment of human hepatocellular carcinoma by fibroblast-mediated human interferon a gene therapy in combination with adoptive chemoimmunotherapy. J Cancer Res Clin Oncol, 1995,121:457-462.
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