磁导向下磁性药物载体脑定位分布的研究
于耀宇 李安民 章翔 易声禹 张剑宁 步星耀 陈义军 易林华
摘 要 目的 探讨磁导向下磁性药物载体脑定位分布特性及恶性脑肿瘤的磁导向化疗新途径。方法 将合成的磁微球-白蛋白-氨甲喋呤载体(FM-HAS-MTX)，经尾静脉注入30只SD大鼠体循环内，在大脑右侧放置1个梯度磁场，观察不同时间(15、30、45 min)时氨甲喋呤(MTX)在SD大鼠大脑的分布状况以及相同时间内左右大脑内MTX含量比较，同时研究磁导向与非磁导向时脑内MTX含量变化。结果 45 min时磁导向组右侧大脑MTX含量0.56±0.02是非磁导向组右侧大脑MTX含量0.06±0.02的9.3倍，不同时间内右大脑(磁导向侧)与左侧大脑MTX含量比较差异有非常显著性(P<0.01)；相同时间内，右侧大脑MTX含量明显高于左侧大脑(P<0.01)。结论 磁性药物载体在磁导向下能够成功地在大脑定位分布。
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关键词：磁性药物载体 磁场 大脑
我们将合成的磁微球-白蛋白-氨甲喋呤载体(FM-HAS-MTX)经尾静脉注入大鼠体循环内，研究不同情况下大脑内氨甲喋呤(MTX)含量的变化，探讨磁导向磁性药物脑内定向分布的特征，现报道如下。材料与方法
1.磁微球-白蛋白-氨甲喋呤载体制备：精确称取氨甲喋呤，N-羟基琥珀酰亚胺和二环已基碳化二亚胺等摩尔混合，溶解于尽可能少的N，N-甲酰胺中，室温下搅拌2 h，然后于4 ℃放置18 h，在干燥条件下减压抽滤得上清液，于4 ℃保持待用。取人血清白蛋白1.0 g,加60 ml 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，搅拌溶解，于温室在搅拌下缓慢滴加氨甲喋呤活化液(上清液)4.5 ml，继续搅拌3 h，4℃时将其透析3 h，换水5次，至直透析液无色为止，将35%磁液等体积加入上述磁微球-白蛋白结合物溶液中，4 ℃下搅拌3 h，制备的磁微球-白蛋白-氨甲喋呤载体为混悬液，微球直径0.5～3 μm,平均1 μm，药物交联率达45%左右，具有很强的磁反应性。
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2.动物分组：(1)磁导向组：取健康SD大鼠30只，体重200～220 g，雌雄不拘，随机分组，每组10只。腹腔内注射戊巴比妥钠(45 mg/kg体重)，麻醉后，固定在操作台上。近头部右侧置以梯度聚焦磁场及磁导向下使磁性药物载体脑定向分布。尾静脉注入磁性药物混悬液(含MTX 3 mg/kg体重)，分别在10、30、45 min移去磁场，腹主动脉抽血处死动物，迅速取出大脑，蒸馏水洗去血迹，滤纸浸干后称重，-20 ℃低温冰箱冻存待用。(2)非磁导向组：动物分组、给药、标本采集、观察时间及方法同磁导向组，但不置外加磁场。(3)MTX组：同样随机分3组，每组10只，给予单纯MTX溶液3 mg/kg体重，盐水稀释后尾静脉注射，观察时间及方法同磁导向组。
表2 磁导向组、非磁导向组及MTX组大鼠大脑内不同时间MTX含量(mg/g,X±s)
组别
左大脑
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右大脑
15 min
30min
45 min
15 min
30min
45 min
磁导向组
0.20±0.12
0.27±0.02
0.29±0.34
0.28±0.23
, 百拇医药
0.38±0.04Δ
0.56±0.02Δ
非磁导向组
0.10±0.01*
0.10±0.01*
0.06±0.03*
0.10±0.02*
0.14±0.01*
0.06±0.02*
MTX组
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0.14±0.02
0.10±0.01
0.08±0.02
0.13±0.34
0.11±0.02
0.07±0.05
注：相同时间与另2组比较，ΔP<0.01；相同时间与MTX组比较，*P>0.05
3.MTX含量测定：采用高效液相色谱仪测定。
4.统计学方法：t检验和方差分析。
结 果
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1.磁导向下磁性药物载体(FM-HAS-MTX)的脑定向分布：由表1可见右侧大脑(磁导向侧)与左侧大脑比较，MTX含量在30、45 min时差异有非常显著性(P<0.01)，而且随着时间的延长，右侧大脑内MTX含量明显增高(P<0.01)。
表1 磁导向不同时间大鼠左右大脑内MTX含量(mg/g,X±s)
组 别
15 min
30 min
45min
左大脑
0.20±0.01
0.27±0.02
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0.28±0.03
右大脑
0.28±0.02
0.38±0.05*
0.56±0.02Δ*
注：与左大脑比较，*P<0.01；与15、30 min比较，ΔP<0.01 2.磁导向与非磁导向下及对照组左右大脑内MTX含量比较：由表2可见同一时间磁导向组脑内MTX含量明显高于其他2组，非磁导向组及MTX组大脑内MTX含量无明显变化，而2组间差异无显著性(P>0.05)。
讨 论
磁性药物载体的磁导向定位已成功地应用于胃癌、膀胱癌的实验研究，以及胸部肿瘤和消化道肿瘤的临床治疗。Devineni等[1]分析了磁性药物载体在大鼠胶质瘤模型大脑及其他组织的分布，发现靶区药物浓度高出其他部位近6倍左右，但没有比较左右大脑在磁导向时其药物分布情况。其合成的磁性微球中药物的交联率只有5%，所以为了增加药物浓度必须给予大量磁性药物载体，大量的磁性微球在磁场作用下很容易集聚，导致血栓成，阻塞血管，故动物死亡率很高。
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本实验结果表明，45 min时磁导向组右侧大脑MTX含量是非磁导向组的9.3倍，相同时间内，磁导向侧大脑MTX含量是非磁导向组的9.3倍，相同时间内，磁导向侧大脑(右)较左侧大脑高出2倍左右，而且随着时间的延长，磁导组大脑MTX含量明显增加。非磁导向组与对照组差异无显著性。时间越长，磁性药物载体聚集越多，同时也揭示了磁性药物载体缓释药物的特性。磁导向改变了化疗药物随血液分布的特征，使得靶区药物浓度逐渐增高，从而保持局部化疗的有效浓度，而肝、肾及骨髓的药物浓度下降，因而减轻了化疗药物的肝、肾损害和骨髓的抑制作用。
磁性药物微球(FM-HAS-MTX)为混悬液，微球直径为0.5～3 μm，平均1 μm，能顺利通过毛细血管。其磁响应性没有因为结合HAS而减小。在外加磁场的作用下，可以定向积聚。微球直径越大，则受力越大。MTX交联率达45%，且交联的MTX以受控的方式释放出来，靶区MTX保持一定的浓度，此为磁导向化疗的前提条件。磁场的性质、强度、梯度的大小及作用时间，也是影响磁导向的直接因素。我们在本实验中选用西北工业大学制造的聚焦磁场，强度0.72 T，具有一定的梯度0.27 T/cm2。Ovadia等[2]通过研究，提出当磁场强度大于0.4 T后，即使增加磁场磁度，作用在磁性微球上的磁引力也不再增加，而磁场梯度则可增加对磁微球的作用力。这说明磁性微球在定向聚集方面，磁场梯度比磁场强度更重要。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270668)
作者单位：于耀宇(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科 现在河南省濮阳中原油田总医院神经外科，457001)
李安民(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
章翔(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
易声禹(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
张剑宁(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
步星耀(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
陈义军(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
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易林华(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
参考文献
[1]Devineni D,Gallo JM,Klein Szanto A. Tissue distribution of methotrexate following administration as a solution and as a magnetic microsphere conjugate in rats bearing brain tumors. J Neurooncol,1995,24:143-152.
[2]Ovadia H,Paterson PY,Hale JR. Magnetic micospheres as drug carriers:factors influencing tocalization at different anatomical sites in rats. Israel J Med Sci, 1983,19:631-637., 百拇医药
摘 要 目的 探讨磁导向下磁性药物载体脑定位分布特性及恶性脑肿瘤的磁导向化疗新途径。方法 将合成的磁微球-白蛋白-氨甲喋呤载体(FM-HAS-MTX)，经尾静脉注入30只SD大鼠体循环内，在大脑右侧放置1个梯度磁场，观察不同时间(15、30、45 min)时氨甲喋呤(MTX)在SD大鼠大脑的分布状况以及相同时间内左右大脑内MTX含量比较，同时研究磁导向与非磁导向时脑内MTX含量变化。结果 45 min时磁导向组右侧大脑MTX含量0.56±0.02是非磁导向组右侧大脑MTX含量0.06±0.02的9.3倍，不同时间内右大脑(磁导向侧)与左侧大脑MTX含量比较差异有非常显著性(P<0.01)；相同时间内，右侧大脑MTX含量明显高于左侧大脑(P<0.01)。结论 磁性药物载体在磁导向下能够成功地在大脑定位分布。
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关键词：磁性药物载体 磁场 大脑
我们将合成的磁微球-白蛋白-氨甲喋呤载体(FM-HAS-MTX)经尾静脉注入大鼠体循环内，研究不同情况下大脑内氨甲喋呤(MTX)含量的变化，探讨磁导向磁性药物脑内定向分布的特征，现报道如下。材料与方法
1.磁微球-白蛋白-氨甲喋呤载体制备：精确称取氨甲喋呤，N-羟基琥珀酰亚胺和二环已基碳化二亚胺等摩尔混合，溶解于尽可能少的N，N-甲酰胺中，室温下搅拌2 h，然后于4 ℃放置18 h，在干燥条件下减压抽滤得上清液，于4 ℃保持待用。取人血清白蛋白1.0 g,加60 ml 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，搅拌溶解，于温室在搅拌下缓慢滴加氨甲喋呤活化液(上清液)4.5 ml，继续搅拌3 h，4℃时将其透析3 h，换水5次，至直透析液无色为止，将35%磁液等体积加入上述磁微球-白蛋白结合物溶液中，4 ℃下搅拌3 h，制备的磁微球-白蛋白-氨甲喋呤载体为混悬液，微球直径0.5～3 μm,平均1 μm，药物交联率达45%左右，具有很强的磁反应性。
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2.动物分组：(1)磁导向组：取健康SD大鼠30只，体重200～220 g，雌雄不拘，随机分组，每组10只。腹腔内注射戊巴比妥钠(45 mg/kg体重)，麻醉后，固定在操作台上。近头部右侧置以梯度聚焦磁场及磁导向下使磁性药物载体脑定向分布。尾静脉注入磁性药物混悬液(含MTX 3 mg/kg体重)，分别在10、30、45 min移去磁场，腹主动脉抽血处死动物，迅速取出大脑，蒸馏水洗去血迹，滤纸浸干后称重，-20 ℃低温冰箱冻存待用。(2)非磁导向组：动物分组、给药、标本采集、观察时间及方法同磁导向组，但不置外加磁场。(3)MTX组：同样随机分3组，每组10只，给予单纯MTX溶液3 mg/kg体重，盐水稀释后尾静脉注射，观察时间及方法同磁导向组。
表2 磁导向组、非磁导向组及MTX组大鼠大脑内不同时间MTX含量(mg/g,X±s)
组别
左大脑
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右大脑
15 min
30min
45 min
15 min
30min
45 min
磁导向组
0.20±0.12
0.27±0.02
0.29±0.34
0.28±0.23
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0.38±0.04Δ
0.56±0.02Δ
非磁导向组
0.10±0.01*
0.10±0.01*
0.06±0.03*
0.10±0.02*
0.14±0.01*
0.06±0.02*
MTX组
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0.14±0.02
0.10±0.01
0.08±0.02
0.13±0.34
0.11±0.02
0.07±0.05
注：相同时间与另2组比较，ΔP<0.01；相同时间与MTX组比较，*P>0.05
3.MTX含量测定：采用高效液相色谱仪测定。
4.统计学方法：t检验和方差分析。
结 果
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1.磁导向下磁性药物载体(FM-HAS-MTX)的脑定向分布：由表1可见右侧大脑(磁导向侧)与左侧大脑比较，MTX含量在30、45 min时差异有非常显著性(P<0.01)，而且随着时间的延长，右侧大脑内MTX含量明显增高(P<0.01)。
表1 磁导向不同时间大鼠左右大脑内MTX含量(mg/g,X±s)
组 别
15 min
30 min
45min
左大脑
0.20±0.01
0.27±0.02
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0.28±0.03
右大脑
0.28±0.02
0.38±0.05*
0.56±0.02Δ*
注：与左大脑比较，*P<0.01；与15、30 min比较，ΔP<0.01 2.磁导向与非磁导向下及对照组左右大脑内MTX含量比较：由表2可见同一时间磁导向组脑内MTX含量明显高于其他2组，非磁导向组及MTX组大脑内MTX含量无明显变化，而2组间差异无显著性(P>0.05)。
讨 论
磁性药物载体的磁导向定位已成功地应用于胃癌、膀胱癌的实验研究，以及胸部肿瘤和消化道肿瘤的临床治疗。Devineni等[1]分析了磁性药物载体在大鼠胶质瘤模型大脑及其他组织的分布，发现靶区药物浓度高出其他部位近6倍左右，但没有比较左右大脑在磁导向时其药物分布情况。其合成的磁性微球中药物的交联率只有5%，所以为了增加药物浓度必须给予大量磁性药物载体，大量的磁性微球在磁场作用下很容易集聚，导致血栓成，阻塞血管，故动物死亡率很高。
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本实验结果表明，45 min时磁导向组右侧大脑MTX含量是非磁导向组的9.3倍，相同时间内，磁导向侧大脑MTX含量是非磁导向组的9.3倍，相同时间内，磁导向侧大脑(右)较左侧大脑高出2倍左右，而且随着时间的延长，磁导组大脑MTX含量明显增加。非磁导向组与对照组差异无显著性。时间越长，磁性药物载体聚集越多，同时也揭示了磁性药物载体缓释药物的特性。磁导向改变了化疗药物随血液分布的特征，使得靶区药物浓度逐渐增高，从而保持局部化疗的有效浓度，而肝、肾及骨髓的药物浓度下降，因而减轻了化疗药物的肝、肾损害和骨髓的抑制作用。
磁性药物微球(FM-HAS-MTX)为混悬液，微球直径为0.5～3 μm，平均1 μm，能顺利通过毛细血管。其磁响应性没有因为结合HAS而减小。在外加磁场的作用下，可以定向积聚。微球直径越大，则受力越大。MTX交联率达45%，且交联的MTX以受控的方式释放出来，靶区MTX保持一定的浓度，此为磁导向化疗的前提条件。磁场的性质、强度、梯度的大小及作用时间，也是影响磁导向的直接因素。我们在本实验中选用西北工业大学制造的聚焦磁场，强度0.72 T，具有一定的梯度0.27 T/cm2。Ovadia等[2]通过研究，提出当磁场强度大于0.4 T后，即使增加磁场磁度，作用在磁性微球上的磁引力也不再增加，而磁场梯度则可增加对磁微球的作用力。这说明磁性微球在定向聚集方面，磁场梯度比磁场强度更重要。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(39270668)
作者单位：于耀宇(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科 现在河南省濮阳中原油田总医院神经外科，457001)
李安民(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
章翔(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
易声禹(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
张剑宁(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
步星耀(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
陈义军(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
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易林华(710032西安，第四军医大学西京医院神经外科)
参考文献
[1]Devineni D,Gallo JM,Klein Szanto A. Tissue distribution of methotrexate following administration as a solution and as a magnetic microsphere conjugate in rats bearing brain tumors. J Neurooncol,1995,24:143-152.
[2]Ovadia H,Paterson PY,Hale JR. Magnetic micospheres as drug carriers:factors influencing tocalization at different anatomical sites in rats. Israel J Med Sci, 1983,19:631-637., 百拇医药