他克莫司对猪胸腺细胞表面抗原表达的影响
明长生 J. Mellert
摘 要 目的 探讨他克莫司(FK506)对猪胸腺细胞表面抗原表达的影响。方法 对5头猪按1 mg/kg肌肉注射FK506 21 d，然后取猪胸腺制成细胞悬液，双色法间接免疫荧光染色后，以流式细胞仪检测。结果 FK506组的胸腺T淋巴细胞数较对照组显著降低(P<0.001)，表面抗原阴性的前T淋巴细胞较对照组显著增高(P<0.01)；FK506组CD1-CD5-、CD2-CD5-和CD4-CD8-双阴性细胞的百分比较对照组显著升高，而双阳性细胞的百分比较对照组显著降低。结论 他克莫司可抑制猪T淋巴细胞在胸腺内分化发育，即抑制CD4-CD8-双阴性细胞向CD4+CD8+双阳性细胞分化。
关键词：猪 胸腺 基因表达 抗原，表面 免疫抑制剂
, 百拇医药
他克莫司(tacrolimus，FK506)是T淋巴细胞特异性免疫抑制剂，本实验利用流式细胞仪(FCM)测定猪应用FK506后胸腺淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化，以了解FK506对胸腺细胞表面抗原表达的影响。
材料和方法
一、 实验动物及给药方法
德国种猪(St. Johann, Bad Urach饲养)10只，雌雄不限，体重30～35 kg，FK506组和对照组各5只。FK506组肌肉注射FK506(Fujisawa Pharmaceutical Co., Osaka, 日本)1 mg/kg，于用药第3、7、10、16和21 d测定FK506全血浓度。对照组注射生理盐水。
二、 胸腺细胞的分离
用药第22 d处死动物，切取胸腺，称重后放入4 ℃磷酸盐缓冲液(PBS)中剪碎，用孔径为0.05 mm金属筛挤压，冲洗过滤，400 r/min离心10 min(4 ℃)，经红细胞溶解液处理后，再用RPMI 1640培养液洗2次，离心，计数。
, 百拇医药
三、 T淋巴细胞染色及检测
采用间接免疫荧光法双色标记胸腺单个核细胞，鼠抗猪单克隆抗体(国际猪白细胞分化抗原协作组提供)SWC1/SWC3(T淋巴细胞)、76-7-74(CD1)/b53b7(CD5)、MSA4(CD2)/b53b7(CD5)、74-12-4(CD4)/11/295/33(CD8)及羊抗鼠荧光抗体IgG2a和IgG2b FITC/IgG 1PE以及IgG2aPE(Southern Biotechnologies，美国)均为100 μl，阴性对照仅用羊抗鼠荧光抗体。完成染色后，标本即进行FCM测定。
FCM为带工作站的FACStar型(Becton-Dic-kinson，美国)，每试管计数0.5×106个细胞，通过两个荧光道及前角像、侧角像等参数对计数细胞记录，经计算机分析，分别计算双阳性、双阴性和单阳性细胞的百分率。
四、 统计学处理
, 百拇医药
本实验所得数据用均数±标准差表示，t检验处理，当P<0.05时，差异有显著性。
结 果
一、 胸腺内细胞总数及各种细胞计数
FK506组的胸腺单个核细胞数为(0.56±0.01)×108个/g胸腺组织，对照组为(1.28±0.14)×108个/g胸腺组织，两组比较，差异有高度显著性(P<0.001)。胸腺内各种细胞计数结果见表1。
表1 胸腺内各细胞数的变化
组 别
n
大单核细胞
(%)
, 百拇医药
前T淋巴细胞
(%)
T淋巴细胞
(%)
FK506组
5
8.60±1.52
46.13±7.04*
44.50±4.36**
对照组
5
8.00±1.31
, http://www.100md.com
3.56±1.45
90.25±12.77
注：大单核细胞为SWC1+SWC3+，前T淋巴细胞为SWC1-SWC3-，T淋巴细胞为SWC1+SWC3-；与对照组相比，* P<0.01；** P<0.001
二、 胸腺T淋巴细胞亚群(表2)
FK506组CD1-CD5-、CD2-CD5-和CD4-CD8-双阴性细胞较对照组显著增多，而CD1+CD5+、CD2+CD5+和CD4+CD8+双阳性细胞较对照组显著减少，FK506组表达CD1、CD2、CD4、CD5和CD8的单阳性细胞除CD1+CD5-和CD1+CD5-细胞显著增多外，其余的单阳性细胞与对照组比较，差异不显著。
, 百拇医药
表2 胸腺T淋巴细胞亚群的变化
组 别
n
CD1+CD5-
(%)*
CD1-CD5-
(%)**
CD1+CD5+
(%)**
CD1-CD5+
, 百拇医药
(%)*
FK506组
5
24.75±4.23
43.63±6.80
11.81±1.69
26.25±14.50
对照组
5
11.13±3.44
6.01±1.62
71.50±5.73
, 百拇医药
12.00±4.69
组 别
CD2+CD5-
(%)
CD2-CD5-
(%)**
CD2+CD5+
(%)**
CD2-CD5+
(%)
, http://www.100md.com
FK506组
2.54±1.44
60.20±3.57
28.65±8.14
8.23±2.98
对照组
1.49±0.90
2.02±0.62
92.14±5.43
6.78±1.92
组 别
CD4+CD8-
, http://www.100md.com
(%)
CD4-CD8-
(%)**
CD4+CD8+
(%)*
CD4-CD8+
(%)
FK506组
11.05±3.65
67.38±9.36
, 百拇医药
10.13±3.52
11.25±3.24
对照组
14.63±5.83
28.78±3.76
48.50±5.04
9.63±2.32
注：两组比较，* P<0.01；** P<0.001
讨 论
胸腺是T淋巴细胞发育成熟的主要场所。本实验结果显示，正常猪的胸腺内大多数为T淋巴细胞，其余为大单核细胞和前T淋巴细胞(表1)。应用FK506后，T淋巴细胞显著减少，而前T淋巴细胞增多。T淋巴细胞亚群分析显示，FK506组CD1+CD2+CD4+CD5+CD8+胸腺细胞显著减少，表明FK506可抑制T淋巴细胞在胸腺内的发育成熟。
, 百拇医药
淋巴细胞在胸腺内分化、发育的过程中，逐渐由胸腺皮质外层向皮质内层及胸腺髓质移行，位于胸腺被膜下的前T淋巴细胞，仅部分细胞表达CD7。胸腺皮质外层的早期胸腺细胞为CD4-CD8-双阴性T淋巴细胞(第Ⅰ阶段)，只表达CD2和CD5，进入胸腺皮质深层后，其表面除表达CD1和CD3外，还表达CD4和CD8，成为CD4+CD8+双阳性细胞(第Ⅱ阶段)，经过阳性选择，分化为CD4+CD8-或CD4-CD8+单阳性T淋巴细胞(第Ⅲ阶段)，最后进入胸腺髓质，经过阴性选择，排除自身反应性T淋巴细胞克隆，分化发育为具有免疫功能的成熟T淋巴细胞[1]。Tsuchida等[2]和Konishi等[3]在大鼠实验中观察到，FK506抑制胸腺细胞表达CD4或CD8，提示FK506抑制胸腺细胞分化发育的阴性选择过程。但本实验结果显示，经FK506处理后，猪胸腺CD4-CD8-双阴性细胞显著增多，CD4+CD8+双阳性细胞则显著减少，而CD4+或CD8+单阳性细胞的改变不明显，提示FK506抑制猪胸腺细胞由CD4-CD8-双阴性细胞向CD4+CD8+双阳性细胞分化、发育的过程。进一步分析CD1、CD2、CD5的表达，结果显示CD1-CD2-CD5-细胞明显增多，而CD1+CD2+CD5+细胞显著减少，表明由于胸腺细胞早期分化、发育过程受到抑制而使前T淋巴细胞和早期胸腺细胞聚集。
, 百拇医药
作者单位：明长生(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院器官移植研究所)
J. Mellert(德国，Transplantationszentrum Universitt Tbingen, Hoppe-Seyler-Straβe 3)
参考文献
[1]Bachert C. Zellen und Organe. In: Bachert C，eds. Medizinische Immunologie. Landesberg/Lech: Ecomed, 1995. I-3, 23-26.
[2]Tsuchida M，Konishi M，Takai K，et al. Effects of irradiation, glucocorticoid and FK506 on cell-surface antigen expression by rat thymocytes: a three-colour flow cytofluorometric analysis. Immu-nology，1994, 83: 469-475.
[3]Konishi M, Takai K, Jojima K, et al. Effects of FK506 on surface antigen expression by regenerating thymocytes after sublethal irradiation in the rat. Thymus, 1994, 23: 53-66., 百拇医药
摘 要 目的 探讨他克莫司(FK506)对猪胸腺细胞表面抗原表达的影响。方法 对5头猪按1 mg/kg肌肉注射FK506 21 d，然后取猪胸腺制成细胞悬液，双色法间接免疫荧光染色后，以流式细胞仪检测。结果 FK506组的胸腺T淋巴细胞数较对照组显著降低(P<0.001)，表面抗原阴性的前T淋巴细胞较对照组显著增高(P<0.01)；FK506组CD1-CD5-、CD2-CD5-和CD4-CD8-双阴性细胞的百分比较对照组显著升高，而双阳性细胞的百分比较对照组显著降低。结论 他克莫司可抑制猪T淋巴细胞在胸腺内分化发育，即抑制CD4-CD8-双阴性细胞向CD4+CD8+双阳性细胞分化。
关键词：猪 胸腺 基因表达 抗原，表面 免疫抑制剂
, 百拇医药
他克莫司(tacrolimus，FK506)是T淋巴细胞特异性免疫抑制剂，本实验利用流式细胞仪(FCM)测定猪应用FK506后胸腺淋巴细胞及T淋巴细胞亚群的变化，以了解FK506对胸腺细胞表面抗原表达的影响。
材料和方法
一、 实验动物及给药方法
德国种猪(St. Johann, Bad Urach饲养)10只，雌雄不限，体重30～35 kg，FK506组和对照组各5只。FK506组肌肉注射FK506(Fujisawa Pharmaceutical Co., Osaka, 日本)1 mg/kg，于用药第3、7、10、16和21 d测定FK506全血浓度。对照组注射生理盐水。
二、 胸腺细胞的分离
用药第22 d处死动物，切取胸腺，称重后放入4 ℃磷酸盐缓冲液(PBS)中剪碎，用孔径为0.05 mm金属筛挤压，冲洗过滤，400 r/min离心10 min(4 ℃)，经红细胞溶解液处理后，再用RPMI 1640培养液洗2次，离心，计数。
, 百拇医药
三、 T淋巴细胞染色及检测
采用间接免疫荧光法双色标记胸腺单个核细胞，鼠抗猪单克隆抗体(国际猪白细胞分化抗原协作组提供)SWC1/SWC3(T淋巴细胞)、76-7-74(CD1)/b53b7(CD5)、MSA4(CD2)/b53b7(CD5)、74-12-4(CD4)/11/295/33(CD8)及羊抗鼠荧光抗体IgG2a和IgG2b FITC/IgG 1PE以及IgG2aPE(Southern Biotechnologies，美国)均为100 μl，阴性对照仅用羊抗鼠荧光抗体。完成染色后，标本即进行FCM测定。
FCM为带工作站的FACStar型(Becton-Dic-kinson，美国)，每试管计数0.5×106个细胞，通过两个荧光道及前角像、侧角像等参数对计数细胞记录，经计算机分析，分别计算双阳性、双阴性和单阳性细胞的百分率。
四、 统计学处理
, 百拇医药
本实验所得数据用均数±标准差表示，t检验处理，当P<0.05时，差异有显著性。
结 果
一、 胸腺内细胞总数及各种细胞计数
FK506组的胸腺单个核细胞数为(0.56±0.01)×108个/g胸腺组织，对照组为(1.28±0.14)×108个/g胸腺组织，两组比较，差异有高度显著性(P<0.001)。胸腺内各种细胞计数结果见表1。
表1 胸腺内各细胞数的变化
组 别
n
大单核细胞
(%)
, 百拇医药
前T淋巴细胞
(%)
T淋巴细胞
(%)
FK506组
5
8.60±1.52
46.13±7.04*
44.50±4.36**
对照组
5
8.00±1.31
, http://www.100md.com
3.56±1.45
90.25±12.77
注：大单核细胞为SWC1+SWC3+，前T淋巴细胞为SWC1-SWC3-，T淋巴细胞为SWC1+SWC3-；与对照组相比，* P<0.01；** P<0.001
二、 胸腺T淋巴细胞亚群(表2)
FK506组CD1-CD5-、CD2-CD5-和CD4-CD8-双阴性细胞较对照组显著增多，而CD1+CD5+、CD2+CD5+和CD4+CD8+双阳性细胞较对照组显著减少，FK506组表达CD1、CD2、CD4、CD5和CD8的单阳性细胞除CD1+CD5-和CD1+CD5-细胞显著增多外，其余的单阳性细胞与对照组比较，差异不显著。
, 百拇医药
表2 胸腺T淋巴细胞亚群的变化
组 别
n
CD1+CD5-
(%)*
CD1-CD5-
(%)**
CD1+CD5+
(%)**
CD1-CD5+
, 百拇医药
(%)*
FK506组
5
24.75±4.23
43.63±6.80
11.81±1.69
26.25±14.50
对照组
5
11.13±3.44
6.01±1.62
71.50±5.73
, 百拇医药
12.00±4.69
组 别
CD2+CD5-
(%)
CD2-CD5-
(%)**
CD2+CD5+
(%)**
CD2-CD5+
(%)
, http://www.100md.com
FK506组
2.54±1.44
60.20±3.57
28.65±8.14
8.23±2.98
对照组
1.49±0.90
2.02±0.62
92.14±5.43
6.78±1.92
组 别
CD4+CD8-
, http://www.100md.com
(%)
CD4-CD8-
(%)**
CD4+CD8+
(%)*
CD4-CD8+
(%)
FK506组
11.05±3.65
67.38±9.36
, 百拇医药
10.13±3.52
11.25±3.24
对照组
14.63±5.83
28.78±3.76
48.50±5.04
9.63±2.32
注：两组比较，* P<0.01；** P<0.001
讨 论
胸腺是T淋巴细胞发育成熟的主要场所。本实验结果显示，正常猪的胸腺内大多数为T淋巴细胞，其余为大单核细胞和前T淋巴细胞(表1)。应用FK506后，T淋巴细胞显著减少，而前T淋巴细胞增多。T淋巴细胞亚群分析显示，FK506组CD1+CD2+CD4+CD5+CD8+胸腺细胞显著减少，表明FK506可抑制T淋巴细胞在胸腺内的发育成熟。
, 百拇医药
淋巴细胞在胸腺内分化、发育的过程中，逐渐由胸腺皮质外层向皮质内层及胸腺髓质移行，位于胸腺被膜下的前T淋巴细胞，仅部分细胞表达CD7。胸腺皮质外层的早期胸腺细胞为CD4-CD8-双阴性T淋巴细胞(第Ⅰ阶段)，只表达CD2和CD5，进入胸腺皮质深层后，其表面除表达CD1和CD3外，还表达CD4和CD8，成为CD4+CD8+双阳性细胞(第Ⅱ阶段)，经过阳性选择，分化为CD4+CD8-或CD4-CD8+单阳性T淋巴细胞(第Ⅲ阶段)，最后进入胸腺髓质，经过阴性选择，排除自身反应性T淋巴细胞克隆，分化发育为具有免疫功能的成熟T淋巴细胞[1]。Tsuchida等[2]和Konishi等[3]在大鼠实验中观察到，FK506抑制胸腺细胞表达CD4或CD8，提示FK506抑制胸腺细胞分化发育的阴性选择过程。但本实验结果显示，经FK506处理后，猪胸腺CD4-CD8-双阴性细胞显著增多，CD4+CD8+双阳性细胞则显著减少，而CD4+或CD8+单阳性细胞的改变不明显，提示FK506抑制猪胸腺细胞由CD4-CD8-双阴性细胞向CD4+CD8+双阳性细胞分化、发育的过程。进一步分析CD1、CD2、CD5的表达，结果显示CD1-CD2-CD5-细胞明显增多，而CD1+CD2+CD5+细胞显著减少，表明由于胸腺细胞早期分化、发育过程受到抑制而使前T淋巴细胞和早期胸腺细胞聚集。
, 百拇医药
作者单位：明长生(430030 武汉，同济医科大学附属同济医院器官移植研究所)
J. Mellert(德国，Transplantationszentrum Universitt Tbingen, Hoppe-Seyler-Straβe 3)
参考文献
[1]Bachert C. Zellen und Organe. In: Bachert C，eds. Medizinische Immunologie. Landesberg/Lech: Ecomed, 1995. I-3, 23-26.
[2]Tsuchida M，Konishi M，Takai K，et al. Effects of irradiation, glucocorticoid and FK506 on cell-surface antigen expression by rat thymocytes: a three-colour flow cytofluorometric analysis. Immu-nology，1994, 83: 469-475.
[3]Konishi M, Takai K, Jojima K, et al. Effects of FK506 on surface antigen expression by regenerating thymocytes after sublethal irradiation in the rat. Thymus, 1994, 23: 53-66., 百拇医药