神经生长因子和脑源性神经营养因子基因转入雪旺细胞的实验研究
作者：冯世庆 郭世绂 陈君长 陈家童 孔晓红 王沛 马信龙
单位：冯世庆 郭世绂 王沛 马信龙(天津医科大学总医院骨科 300052)；孔晓红(内分泌科)；陈君长(西安医科大学第二附属医院骨科)；陈家童(南开大学分子生物所)
关键词：许旺氏细胞；神经生长因子；脑源性神经营养因子；转染
中华骨科杂志00811
【摘要】目的神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)和脑源性神经营养因子(brain-d erivedneurotrophicfactor,BDNF)是具有感觉和运动神经元营养活性的因子。为提高雪旺 细胞(Schwanncell,SC)分泌NGF和BDNF的能力，将NGF和BDNF基因转入SC进行探讨。方法用消 化后的组织块法和差速离心法分离、纯化雪旺细胞。用脂质体转染法将NGF和BDNF基因导入 雪旺细胞，ELISA双抗体夹心法检测NGF和BDNF的表达。结果经免疫组化S-100法鉴定SC纯度 达95%以上。ELISA双抗体夹心法测定转染后不同时期的NGF和BDNF的浓度，2周后表达增加 ，4周后明显增加，差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论SC作为受体细胞，有以下优点:(1 )易于获取并能在体外大量培养繁殖；(2)能较长时间表达所携带基因而不衰减，并能稳定大 量地表达。
, 百拇医药
A study on the nerve growth factor and brain- derived neurotrophic factor genetically modified Schwann cells
FENG Shiqing GUO Shifu CHEN Junchang et al
( Department of Orthopaedics, Tianjin Medical University Hospital, Tianjin 300052, China)
【 Abstract】 Objective Nerve growth factor (NGF) and brain- derived neurotrophic factor (BDNF) are effective stimulatory factors of sensory and motor neurons. Schwann cells (SC) are important components for the regeneration of the nervous system. The purpose of this study is to culture adult Schwann cells and modify them genetically by human NGF and BDNF genes to increase the formation of neurotrophic factors. Methods SCs were separated and purified with post-digestion tissue blot and time- speed difference stick. Plasmids expressing NGF and BDNF genes were transfected to SC with lipofectamine, and NGF and BDNF s levels in conditioned medium of SC were measured with enzyme- linked immunoassay sensitive assay(ELISA) in different phases of gene transfected.Results The purity of SCs was 95% by S- 100 immunhistochemistry. Compared with nontranduced Schwann cells group, the levels of NGF and BDNF began increasing after two weeks of gene transfer, and both of them were increased obviously after 4 weeks. The results have statistical significance (P< 0.01). Conclusion As receptor cells, SCs have following advatages: 1) They can be obtained easily and also can be cultured and reproduced massively in vitro. 2) They can be transduced to secrete augmented levels of neurotrophic factors and to express the transgene for a prolonged time.
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【 Key words】 Schwann cells; Nerve growth factors; Brain- derived neurotrophic factor; Transfection
神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophi cfactor,BDNF)是对神经细胞的生长发育、分化、再生及功能发挥起调节作用的蛋白质[1]。雪旺细胞(Schwanncell,SC)是神经组织再生微环境的重要成分，能分泌神经营养物质，但有时效局限性[2]。本实验为了提高SC分泌NGF和BDNF的活性，将NGF和BDNF基因转入SC进行探讨。
材料与方法
一、材料
(一)主要试剂:胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、多聚赖氨酸均购自美国Sigma公司；DMEM、G418、脂质体转染试剂盒购自美国生命技术公司(GIBCO/BRL)；S-100、抗溶菌酶、ABC药盒均购自美国Sigma公司；载体选用pLRNL质粒，其中含NGF、BDNF基因的pLNGFRNL(7.7kb)和pLBDNFRNL(7.39kb)质粒由美国UniversityofCaliforniaSchoolofMedicine(SanDiego)的FredGage教授和LynneMoore教授惠赠;HindⅢ、EcoRⅠ、HaeⅢ、EspⅠ、MaeⅡ、PstⅠ酶均购自美国Sigma公司。
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(二)主要仪器:台式离心机(北京医用离心机厂，型号LD4-2)，超净台(北京半导体设备厂)，CO2孵育箱(美国FormaScientific)，倒置相差显微镜(Olympus)，光学显微镜(日本Nikon)。
二、SC的分离与培养
幼年Wistar大鼠，体重80～100g，每次3只。乙醚麻醉，消毒后，快速取其双侧坐骨神经，Hank液洗两次，显微镜下剥取外膜，切成0.2mm×0.2mm碎块，经0.25%胰蛋白酶、1000u/ml胶原酶、37℃细胞培养箱孵育消化30min，离心沉淀(1200r/min,3min)，取沉淀物接种于六孔板内，并添加10%血清DMEM培养液1.5ml。1周后，胰蛋白酶消化，在37℃培养箱内，经双30min差速粘附法纯化SC。并经过免疫组化抗S-100蛋白染色鉴定，其纯净度达95%以上。接种于50ml培养瓶，每瓶5ml，置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。
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三、NGFDNA和BDNFDNA质粒提取、鉴定和纯化
将存于Whatman滤纸上的质粒剪下，放入Eppendorf管中，用50μlTE溶液水化纸片，振荡混匀，充分溶解质粒。转移上清于另一Eppendorf管中，吸取10μl上述溶液，加入11μl的1×ssc、22μl0.1mol/LCaCl2,100μl感受态菌E.coli.DH5α。充分混匀后，0℃冰浴5min，置于42℃热休克2min，立即置于冰浴中5min。将上述体系共143μl涂铺于LB固体培养基上，37℃培养过夜。选取生长于上述固体培养基上的单克隆菌落于3mlLB液体培养基上，37℃振荡培养过夜。取1.5ml培养后菌液于Eppendorf管中，离心(3000r/min,2min)，弃上清，再取1.5ml菌液，操作及离心条件同前。弃上清，加入STE溶液1000μl，充分振荡混匀，离心同前。弃上清，加入SolutionⅠ溶液100μl，振荡混匀，室温静置5min，然后分别加入SolutionⅡ、SolutionⅢ溶液200μl、150μl，颠倒3～4次，在0℃静置5min。离心(15000r/min，5min)，用牙签宽头挑出附着于壁上的沉淀物。加入等体积(400μl)酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，剧烈混匀，离心(12000r/min,2min)，吸上清液于另一Eppendorf管中。加入2.5倍体积无水乙醇(1000μl)，振荡混匀3～4次，离心(4℃，15000r/min，15min)。弃上清，加入体积分数75%乙醇于沉淀中，轻洗3～4次，离心(4℃，500r/min,5～10min)。弃上清，37℃温箱中烘干质粒。用40μlddH2O溶解质粒，取4μl溶解后的质粒进行酶切鉴定。即用HindⅢ限制性内切酶将含NGF、BDNF的重组质粒进行酶切；然后对含插入NGF、BDNF基因片段的产物进行硬胶回收，并对回收产物序列进行酶切鉴定。其中NGF选用EcoRⅠ、HaeⅢ、EspⅠ限制性内切酶,BDNF选用MaeⅡ、EspⅠ、PstⅠ限制性内切酶。最后经OD260测定吸光度值，以此换算浓度(1OD=40μg)，并通过OD260/OD280(核酸/蛋白)确定NGFDNA和BDNFDNA的纯度。将提取质粒在-70℃保存备用。
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四、脂质体转染酶介导的NGFDNA和BDNFDNA转染
基因转染的载体是已构建好的pLNGFRNL(7.7kb)和pLBDNFRNL(7.39kb)质粒。转染前首先收获细胞，将1×105～2×105的细胞重悬于2ml完全培养液中，转种于35mm培养皿中。37℃，体积分数5%CO2培养箱培养18～12h，使细胞达到50%～80%的融合。然后在12mm×75mm无菌玻璃试管中制备下列溶液。溶液A:将4μg质粒DNA溶于100μl无血清DMEM培养液中。溶液B:20μl脂质体转染酶稀释于80μl无血清DMEM培养液中；合并溶液A和溶液B，轻轻混合，置室温15min。弃去细胞培养液，并用无血清培养液洗涤细胞一次。加0.8ml无血清培养液至脂质体转染酶-DNA混合物中，混匀后，小心滴加至细胞上，轻轻混匀。37℃，5%CO2培养箱培养24h。次日弃去转染液，加2ml完全培养液，继续培养。转染后48h，更换选择培养液筛选。待细胞生长接近融合时，按1∶4密度传代。继续培养，至细胞密度达50%～70%融合。弃培养液，更换浓度为400μg/ml的G418培养液进行筛选，同时用未加转染液的细胞作对照。当对照细胞大部分死亡时(约3d后)，再换一次筛选液，G418浓度可降至200μg/ml，以维持筛选作用。约14d后，可见有抗性克隆形成，待其逐渐增大后，将其逐一移至24孔板继续培养。将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置，并将每个克隆的位置用标记笔标记准确。用镊子夹取一块滤纸块，用0.25%胰蛋白酶消化液浸润。置于所标记克隆位置处，5～20s。先将24孔培养板每孔加G418选择培养液2ml，用镊子取出已粘附克隆细胞的滤纸块，涮洗滤纸块数次，以使粘附的细胞脱下。镜下观察确认细胞已脱落后，将滤纸块取出弃掉，其它克隆转移方法同上。将移有克隆细胞的24孔板，继续置于37℃，体积分数为5%CO2培养箱培养5d。待细胞长满后，0.25%胰蛋白酶消化，并将细胞转移至多个瓶中进行扩增。细胞恢复正常生长条件后3d，ELISA双抗体夹心法测定NGF和BDNF的表达。
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1BDNF-pLRNL质粒经酶切后产生1160bp、6.5kb条带
2marke(DL-2000):1000bp,2000bp
3NGF-pLRNL质粒经HindⅢ酶切后产生1300bp、6.5kb条带
图1重组NGF-pLRNL、BDNF-pLRNL质粒的HindⅢ限制性内切酶酶切鉴定
1重组NGF-pLRNL质粒经HindⅢ酶切后回收产物
2marke(DL-2000):100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp
3EcoRⅠ对回收产物酶切后产生100bp和600bp两条带
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4HaeⅢ对回收产物酶切后产生90bp、330bp和880bp三条带
5EspⅠ对回收产物酶切后产生410bp和890bp两条带
图2NGFDNA经EcoRⅠ、HaeⅢ、EspⅠ限制性内切酶酶切鉴定
1重组BDNF-pLRNL质粒经HindⅢ酶切后回收产物
2marke(DL-2000):100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp
3EspⅠ对回收产物酶切后产生380bp和780bp两条带
4PstⅠ对回收产物酶切后产生120bp、220bp和840bp三条带
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5MaeⅡ对回收产物酶切后产生440bp和720bp两条带
图3BDNFDNA经MaeⅡ、EspⅠ、PstⅠ限制性内切酶酶切鉴定
五、转染前后培养液中NGF和BDNF含量测定
在相同细胞计数前提下，收集不同阶段的无血清培养液，采用ELISA双抗体夹心法测定样本中NGF和BDNF含量。本方法是根据Kenigs-Berg的双抗体夹心法改良，其灵敏度为5.0ng/ml。重复性检验表明平均批内变异系数为3.855%，平均批间变异系数8.456%则稳定性良好。中和实验表明各抑制孔抑制率大于50%，特异性好。
结果
一、限制性内切酶酶切质粒鉴定的琼脂糖电泳结果
用HindⅢ限制性内切酶将含NGF、BDNF的重组质粒进行酶切后，分别有1300bp和1160bp条带产生，证明插入片段与NGF、BDNF基因片段相符(图1)。对含插入NGF、BDNF基因片段的产物进行硬胶回收，并对回收产物序列进行酶切鉴定。NGFDNA酶切结果：EcoRⅠ可见分别为100bp和600bp的两条带，其中600bp处有两条大小相近的带；HaeⅢ可见分别为90bp、330bp和880bp三条带；EspⅠ可见分别为410bp和890bp两条带(图2)。BDNFDNA的酶切结果：MaeⅡ可见分别为440bp和720bp两条带;EspⅠ可见分别为380bp和780bp两条带;PstⅠ可见分别为120bp、220bp和840bp三条带(图3)。含有NGFDNA和BDNFDNA质粒纯化后，纯度分别为93.5%和92.8%，浓度分别为0.6μg/ml和0.56μg/ml。
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二、倒置显微镜观察
SC经S-100免疫组化染色，阳性率均为95%以上(图4)。
三、雪旺细胞纯度检测
脂质体转染后，经过G418的多次筛选，发现转染3周后，细胞生长速度加快，雪旺细胞突起互相结网明显，并经Gimsa染色、S-100染色证实雪旺细胞纯度达到95%以上(图5，6)。
四、转染前后雪旺细胞电镜观察结果
转染前雪旺细胞表面有丰富的微绒毛状突起,胞浆内含有线粒体、粗面内质网和溶酶体及高尔基体，未见粗面内质网的扩张及粗、细肌丝的出现。转染后最突出的表现是胞体多呈长梭形，胞浆丰富，核卵圆形，可见到丰富的粗面内质网、线粒体和发育良好的高尔基体(图7～9)。
五、未转染及转染NGF和BDNF基因后不同时期培养液中NGF和BDNF含量的测定
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结果见表1。
讨论
脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)的治疗迄今为止一直没有突破。神经营养因子(neurotrophicfactor,NTF)的发现为脊髓损伤的治疗带来了新的希望[3]。NGF、BDNF是NTF的重要成员。NGF主要能促进发育中的交感和感觉神经细胞的分化和成熟，维持交感神经元正常功能，促进该神经元突起的长出，并诱导突起向神经纤维生长，有趋化性[4]。而BDNF具有很强的运动神经元营养活性，尤其是胆碱能神经元和红核神经元[5]。总之，损伤后特殊的神经元依赖特殊NTF的支持。
NTF目前在脊髓损伤中应用的最大障碍是不能从血管给药，不易通过血脑(脊髓)屏障。有些学者试图通过一种微泵将其导入损伤部位，以促进皮质脊髓束轴突生长，但将营养因子泵入脊髓的导管可能成为感染来源[6]。Kim等[7]将NGF和BDNF基因导入成纤维细胞后植入脊髓损伤部位，促进轴突再生，但成纤维细胞易形成瘢痕，又阻碍了神经组织的修复。Martin等[8]证实将雪旺细胞移植至脊髓损伤部位可诱导感觉和运动神经轴突发芽，增生的SC可以起到导管作用，引导再生的轴突到达靶组织，减轻胶质瘢痕，缩小损伤腔，并能分泌少量神经营养因子，但有时效局限性。故寻求能大量转染NGF、BDNF的SC成为一项重要课题。
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图4经差速粘附法纯化雪旺细胞S-100免疫组化染色×200图5G418加压筛选后阳性克隆雪旺细胞Gimsa染色×200图61∶4传代正常培养条件下生长雪旺细胞Gimsa染色×200图7雪旺细胞转染前超微结构×600图8NGF基因转入雪旺细胞后的超微结构×800图9BDNF基因转入雪旺细胞后的超微结构×600
表1未转染及转染NGF和BDNF基因的SC不同时期NGF和BDNF变化(
±s，ng/ml)
时间 NGF BDNF 未转染 转染后 未转染 转染后 3d 0.33±0.25 0.38±0.30 0.35±0.28 0.33±0.26 1周 0.41±0.25 0.63±0.20 0.38±0.29 0.39±0.25 2周 0.49±0.41 0.89±0.29* 0.40±0.31 0.76±0.22* 4周 0.50±0.20 1.80±0.28* 0.42±0.29 1.36±0.38* 6周 0.53±0.38 1.88±0.25* 0.43±0.28 1.38±0.25* 8周 0.55±0.37 1.92±0.35* 0.45±0.22 1.42±0.35* 12周 0.57±0.38 2.10±0.38* 0.47±0.20 1.80±0.28*
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注:*未转染与转染后相比P<0.01
对雪旺细胞的分离纯化，我们采用消化后组织块法和差速离心法。组织块消化后，大量的雪旺细胞从组织块中爬出，1周后经胰蛋白酶消化，差速贴壁纯化两次。经免疫组化S-100和抗凝血酶鉴定纯度达95%以上。我们认为该法是获取大量高纯度SC的有效方法。我们用脂质体转染法将含NGF和BDNF表达基因的质粒导入SC，G418加压筛选，ELISA双抗体夹心ABC法测定未转染及转染后不同时期NGF和BDNF的浓度。2周后表达增加，4周后明显增加，差异有非常显著性意义(P<0.01)。NGFmRNA和BDNFmRNA水平的检测有待于进一步研究。转染后雪旺细胞的电镜观察其胞体多呈长梭形,细胞器丰富,可见到丰富的粗面内质网和线粒体,这可能与SC的分泌功能提高有关。
总之，SC作为受体细胞，NGF和BDNF可以稳定表达，并有以下优越性:(1)易于获取并能在体外大量培养繁殖；(2)能较长时间表达所携带基因而不衰减，并能稳定大量的表达，充分发挥两者的作用；(3)无显著的免疫原性；(4)减轻神经胶质瘢痕程度及缩小创腔；(5)植入损伤部位能诱导和促进轴突再生。总之，转NGF和BDNF基因的雪旺细胞将为修复脊髓和周围神经损伤提供前提条件。
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基金项目:国家自然科学青年基金资助项目(39900151)；天津市科委21世纪青年基金资助 项目(99166)；天津市卫生局科研基金资助项目(A13-85)
1，胥少汀,郭世绂.脊髓损伤基础与临床.第1版.北京:人民卫生出版社，1993.24-227.
2，Tuszynski MH, Gabriel K, Gage FH, et al. Nerve growth factor delivery by gene transfer induces differential outgrowth of sensory, motor, and noradrenergic neurites after adult spinal cord injury. Exp Neurol, 1996, 137:157- 173.
3，Spenger C, Hyman C, Studer L, et al. Effects of BDNF on dopaminergic, serotonergic, and GABAergic neurons in cultures of human fetal ventral mesencephalon. Exp Neurol, 1995, 133:50- 63.
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4，Cowan WM, Fawcett JW, Oleary DD, et al. Regressive events in neurogenesis. Science, 1984, 225:1258- 1265.
5，Lindsay RM, Peters C. Spinal cord contains neurotrophic activity for spinal nerve sensory neurons:late developmental appearance of a survival factor distinct from nerve growth factor. Neuroscience, 1984, 12:45- 51.
6，Fernandez E, Pallini R, Lauretti, et al. Spinal cord transection in adult rats:effects of local infusion of nerve growth factor on the corticospinal tract axons. Neurosurgery, 1993, 33:889- 893.
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7，Kim DH, Gutin PH, Noble LJ, et al. Treatment with genetically engineered fibroblasts producing NGF or BDNF can accelerate recovery from traumatic spinal cord injury in the adult rat. Neuroreport, 1996, 7: 2221- 2225.
8，Martin D, Robe P, Franzen R, et al. Effects of Schwann cell transplantation in a contusion model of rat spinal cord injury. J Neurosci Res, 1996, 45:588- 597.
(收稿日期:1999-08-30), 百拇医药
单位：冯世庆 郭世绂 王沛 马信龙(天津医科大学总医院骨科 300052)；孔晓红(内分泌科)；陈君长(西安医科大学第二附属医院骨科)；陈家童(南开大学分子生物所)
关键词：许旺氏细胞；神经生长因子；脑源性神经营养因子；转染
中华骨科杂志00811
【摘要】目的神经生长因子(nervegrowthfactor,NGF)和脑源性神经营养因子(brain-d erivedneurotrophicfactor,BDNF)是具有感觉和运动神经元营养活性的因子。为提高雪旺 细胞(Schwanncell,SC)分泌NGF和BDNF的能力，将NGF和BDNF基因转入SC进行探讨。方法用消 化后的组织块法和差速离心法分离、纯化雪旺细胞。用脂质体转染法将NGF和BDNF基因导入 雪旺细胞，ELISA双抗体夹心法检测NGF和BDNF的表达。结果经免疫组化S-100法鉴定SC纯度 达95%以上。ELISA双抗体夹心法测定转染后不同时期的NGF和BDNF的浓度，2周后表达增加 ，4周后明显增加，差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论SC作为受体细胞，有以下优点:(1 )易于获取并能在体外大量培养繁殖；(2)能较长时间表达所携带基因而不衰减，并能稳定大 量地表达。
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FENG Shiqing GUO Shifu CHEN Junchang et al
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【 Abstract】 Objective Nerve growth factor (NGF) and brain- derived neurotrophic factor (BDNF) are effective stimulatory factors of sensory and motor neurons. Schwann cells (SC) are important components for the regeneration of the nervous system. The purpose of this study is to culture adult Schwann cells and modify them genetically by human NGF and BDNF genes to increase the formation of neurotrophic factors. Methods SCs were separated and purified with post-digestion tissue blot and time- speed difference stick. Plasmids expressing NGF and BDNF genes were transfected to SC with lipofectamine, and NGF and BDNF s levels in conditioned medium of SC were measured with enzyme- linked immunoassay sensitive assay(ELISA) in different phases of gene transfected.Results The purity of SCs was 95% by S- 100 immunhistochemistry. Compared with nontranduced Schwann cells group, the levels of NGF and BDNF began increasing after two weeks of gene transfer, and both of them were increased obviously after 4 weeks. The results have statistical significance (P< 0.01). Conclusion As receptor cells, SCs have following advatages: 1) They can be obtained easily and also can be cultured and reproduced massively in vitro. 2) They can be transduced to secrete augmented levels of neurotrophic factors and to express the transgene for a prolonged time.
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【 Key words】 Schwann cells; Nerve growth factors; Brain- derived neurotrophic factor; Transfection
神经生长因子(nerve growth factor,NGF)和脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophi cfactor,BDNF)是对神经细胞的生长发育、分化、再生及功能发挥起调节作用的蛋白质[1]。雪旺细胞(Schwanncell,SC)是神经组织再生微环境的重要成分，能分泌神经营养物质，但有时效局限性[2]。本实验为了提高SC分泌NGF和BDNF的活性，将NGF和BDNF基因转入SC进行探讨。
材料与方法
一、材料
(一)主要试剂:胰蛋白酶、胶原蛋白酶、透明质酸酶、多聚赖氨酸均购自美国Sigma公司；DMEM、G418、脂质体转染试剂盒购自美国生命技术公司(GIBCO/BRL)；S-100、抗溶菌酶、ABC药盒均购自美国Sigma公司；载体选用pLRNL质粒，其中含NGF、BDNF基因的pLNGFRNL(7.7kb)和pLBDNFRNL(7.39kb)质粒由美国UniversityofCaliforniaSchoolofMedicine(SanDiego)的FredGage教授和LynneMoore教授惠赠;HindⅢ、EcoRⅠ、HaeⅢ、EspⅠ、MaeⅡ、PstⅠ酶均购自美国Sigma公司。
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(二)主要仪器:台式离心机(北京医用离心机厂，型号LD4-2)，超净台(北京半导体设备厂)，CO2孵育箱(美国FormaScientific)，倒置相差显微镜(Olympus)，光学显微镜(日本Nikon)。
二、SC的分离与培养
幼年Wistar大鼠，体重80～100g，每次3只。乙醚麻醉，消毒后，快速取其双侧坐骨神经，Hank液洗两次，显微镜下剥取外膜，切成0.2mm×0.2mm碎块，经0.25%胰蛋白酶、1000u/ml胶原酶、37℃细胞培养箱孵育消化30min，离心沉淀(1200r/min,3min)，取沉淀物接种于六孔板内，并添加10%血清DMEM培养液1.5ml。1周后，胰蛋白酶消化，在37℃培养箱内，经双30min差速粘附法纯化SC。并经过免疫组化抗S-100蛋白染色鉴定，其纯净度达95%以上。接种于50ml培养瓶，每瓶5ml，置37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。
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三、NGFDNA和BDNFDNA质粒提取、鉴定和纯化
将存于Whatman滤纸上的质粒剪下，放入Eppendorf管中，用50μlTE溶液水化纸片，振荡混匀，充分溶解质粒。转移上清于另一Eppendorf管中，吸取10μl上述溶液，加入11μl的1×ssc、22μl0.1mol/LCaCl2,100μl感受态菌E.coli.DH5α。充分混匀后，0℃冰浴5min，置于42℃热休克2min，立即置于冰浴中5min。将上述体系共143μl涂铺于LB固体培养基上，37℃培养过夜。选取生长于上述固体培养基上的单克隆菌落于3mlLB液体培养基上，37℃振荡培养过夜。取1.5ml培养后菌液于Eppendorf管中，离心(3000r/min,2min)，弃上清，再取1.5ml菌液，操作及离心条件同前。弃上清，加入STE溶液1000μl，充分振荡混匀，离心同前。弃上清，加入SolutionⅠ溶液100μl，振荡混匀，室温静置5min，然后分别加入SolutionⅡ、SolutionⅢ溶液200μl、150μl，颠倒3～4次，在0℃静置5min。离心(15000r/min，5min)，用牙签宽头挑出附着于壁上的沉淀物。加入等体积(400μl)酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)，剧烈混匀，离心(12000r/min,2min)，吸上清液于另一Eppendorf管中。加入2.5倍体积无水乙醇(1000μl)，振荡混匀3～4次，离心(4℃，15000r/min，15min)。弃上清，加入体积分数75%乙醇于沉淀中，轻洗3～4次，离心(4℃，500r/min,5～10min)。弃上清，37℃温箱中烘干质粒。用40μlddH2O溶解质粒，取4μl溶解后的质粒进行酶切鉴定。即用HindⅢ限制性内切酶将含NGF、BDNF的重组质粒进行酶切；然后对含插入NGF、BDNF基因片段的产物进行硬胶回收，并对回收产物序列进行酶切鉴定。其中NGF选用EcoRⅠ、HaeⅢ、EspⅠ限制性内切酶,BDNF选用MaeⅡ、EspⅠ、PstⅠ限制性内切酶。最后经OD260测定吸光度值，以此换算浓度(1OD=40μg)，并通过OD260/OD280(核酸/蛋白)确定NGFDNA和BDNFDNA的纯度。将提取质粒在-70℃保存备用。
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四、脂质体转染酶介导的NGFDNA和BDNFDNA转染
基因转染的载体是已构建好的pLNGFRNL(7.7kb)和pLBDNFRNL(7.39kb)质粒。转染前首先收获细胞，将1×105～2×105的细胞重悬于2ml完全培养液中，转种于35mm培养皿中。37℃，体积分数5%CO2培养箱培养18～12h，使细胞达到50%～80%的融合。然后在12mm×75mm无菌玻璃试管中制备下列溶液。溶液A:将4μg质粒DNA溶于100μl无血清DMEM培养液中。溶液B:20μl脂质体转染酶稀释于80μl无血清DMEM培养液中；合并溶液A和溶液B，轻轻混合，置室温15min。弃去细胞培养液，并用无血清培养液洗涤细胞一次。加0.8ml无血清培养液至脂质体转染酶-DNA混合物中，混匀后，小心滴加至细胞上，轻轻混匀。37℃，5%CO2培养箱培养24h。次日弃去转染液，加2ml完全培养液，继续培养。转染后48h，更换选择培养液筛选。待细胞生长接近融合时，按1∶4密度传代。继续培养，至细胞密度达50%～70%融合。弃培养液，更换浓度为400μg/ml的G418培养液进行筛选，同时用未加转染液的细胞作对照。当对照细胞大部分死亡时(约3d后)，再换一次筛选液，G418浓度可降至200μg/ml，以维持筛选作用。约14d后，可见有抗性克隆形成，待其逐渐增大后，将其逐一移至24孔板继续培养。将已形成克隆的培养皿置于显微镜下观察克隆位置，并将每个克隆的位置用标记笔标记准确。用镊子夹取一块滤纸块，用0.25%胰蛋白酶消化液浸润。置于所标记克隆位置处，5～20s。先将24孔培养板每孔加G418选择培养液2ml，用镊子取出已粘附克隆细胞的滤纸块，涮洗滤纸块数次，以使粘附的细胞脱下。镜下观察确认细胞已脱落后，将滤纸块取出弃掉，其它克隆转移方法同上。将移有克隆细胞的24孔板，继续置于37℃，体积分数为5%CO2培养箱培养5d。待细胞长满后，0.25%胰蛋白酶消化，并将细胞转移至多个瓶中进行扩增。细胞恢复正常生长条件后3d，ELISA双抗体夹心法测定NGF和BDNF的表达。
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1BDNF-pLRNL质粒经酶切后产生1160bp、6.5kb条带
2marke(DL-2000):1000bp,2000bp
3NGF-pLRNL质粒经HindⅢ酶切后产生1300bp、6.5kb条带
图1重组NGF-pLRNL、BDNF-pLRNL质粒的HindⅢ限制性内切酶酶切鉴定
1重组NGF-pLRNL质粒经HindⅢ酶切后回收产物
2marke(DL-2000):100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp
3EcoRⅠ对回收产物酶切后产生100bp和600bp两条带
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4HaeⅢ对回收产物酶切后产生90bp、330bp和880bp三条带
5EspⅠ对回收产物酶切后产生410bp和890bp两条带
图2NGFDNA经EcoRⅠ、HaeⅢ、EspⅠ限制性内切酶酶切鉴定
1重组BDNF-pLRNL质粒经HindⅢ酶切后回收产物
2marke(DL-2000):100bp,250bp,500bp,750bp,1000bp,2000bp
3EspⅠ对回收产物酶切后产生380bp和780bp两条带
4PstⅠ对回收产物酶切后产生120bp、220bp和840bp三条带
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5MaeⅡ对回收产物酶切后产生440bp和720bp两条带
图3BDNFDNA经MaeⅡ、EspⅠ、PstⅠ限制性内切酶酶切鉴定
五、转染前后培养液中NGF和BDNF含量测定
在相同细胞计数前提下，收集不同阶段的无血清培养液，采用ELISA双抗体夹心法测定样本中NGF和BDNF含量。本方法是根据Kenigs-Berg的双抗体夹心法改良，其灵敏度为5.0ng/ml。重复性检验表明平均批内变异系数为3.855%，平均批间变异系数8.456%则稳定性良好。中和实验表明各抑制孔抑制率大于50%，特异性好。
结果
一、限制性内切酶酶切质粒鉴定的琼脂糖电泳结果
用HindⅢ限制性内切酶将含NGF、BDNF的重组质粒进行酶切后，分别有1300bp和1160bp条带产生，证明插入片段与NGF、BDNF基因片段相符(图1)。对含插入NGF、BDNF基因片段的产物进行硬胶回收，并对回收产物序列进行酶切鉴定。NGFDNA酶切结果：EcoRⅠ可见分别为100bp和600bp的两条带，其中600bp处有两条大小相近的带；HaeⅢ可见分别为90bp、330bp和880bp三条带；EspⅠ可见分别为410bp和890bp两条带(图2)。BDNFDNA的酶切结果：MaeⅡ可见分别为440bp和720bp两条带;EspⅠ可见分别为380bp和780bp两条带;PstⅠ可见分别为120bp、220bp和840bp三条带(图3)。含有NGFDNA和BDNFDNA质粒纯化后，纯度分别为93.5%和92.8%，浓度分别为0.6μg/ml和0.56μg/ml。
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二、倒置显微镜观察
SC经S-100免疫组化染色，阳性率均为95%以上(图4)。
三、雪旺细胞纯度检测
脂质体转染后，经过G418的多次筛选，发现转染3周后，细胞生长速度加快，雪旺细胞突起互相结网明显，并经Gimsa染色、S-100染色证实雪旺细胞纯度达到95%以上(图5，6)。
四、转染前后雪旺细胞电镜观察结果
转染前雪旺细胞表面有丰富的微绒毛状突起,胞浆内含有线粒体、粗面内质网和溶酶体及高尔基体，未见粗面内质网的扩张及粗、细肌丝的出现。转染后最突出的表现是胞体多呈长梭形，胞浆丰富，核卵圆形，可见到丰富的粗面内质网、线粒体和发育良好的高尔基体(图7～9)。
五、未转染及转染NGF和BDNF基因后不同时期培养液中NGF和BDNF含量的测定
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结果见表1。
讨论
脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)的治疗迄今为止一直没有突破。神经营养因子(neurotrophicfactor,NTF)的发现为脊髓损伤的治疗带来了新的希望[3]。NGF、BDNF是NTF的重要成员。NGF主要能促进发育中的交感和感觉神经细胞的分化和成熟，维持交感神经元正常功能，促进该神经元突起的长出，并诱导突起向神经纤维生长，有趋化性[4]。而BDNF具有很强的运动神经元营养活性，尤其是胆碱能神经元和红核神经元[5]。总之，损伤后特殊的神经元依赖特殊NTF的支持。
NTF目前在脊髓损伤中应用的最大障碍是不能从血管给药，不易通过血脑(脊髓)屏障。有些学者试图通过一种微泵将其导入损伤部位，以促进皮质脊髓束轴突生长，但将营养因子泵入脊髓的导管可能成为感染来源[6]。Kim等[7]将NGF和BDNF基因导入成纤维细胞后植入脊髓损伤部位，促进轴突再生，但成纤维细胞易形成瘢痕，又阻碍了神经组织的修复。Martin等[8]证实将雪旺细胞移植至脊髓损伤部位可诱导感觉和运动神经轴突发芽，增生的SC可以起到导管作用，引导再生的轴突到达靶组织，减轻胶质瘢痕，缩小损伤腔，并能分泌少量神经营养因子，但有时效局限性。故寻求能大量转染NGF、BDNF的SC成为一项重要课题。
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图4经差速粘附法纯化雪旺细胞S-100免疫组化染色×200图5G418加压筛选后阳性克隆雪旺细胞Gimsa染色×200图61∶4传代正常培养条件下生长雪旺细胞Gimsa染色×200图7雪旺细胞转染前超微结构×600图8NGF基因转入雪旺细胞后的超微结构×800图9BDNF基因转入雪旺细胞后的超微结构×600
表1未转染及转染NGF和BDNF基因的SC不同时期NGF和BDNF变化(
±s，ng/ml)时间 NGF BDNF 未转染 转染后 未转染 转染后 3d 0.33±0.25 0.38±0.30 0.35±0.28 0.33±0.26 1周 0.41±0.25 0.63±0.20 0.38±0.29 0.39±0.25 2周 0.49±0.41 0.89±0.29* 0.40±0.31 0.76±0.22* 4周 0.50±0.20 1.80±0.28* 0.42±0.29 1.36±0.38* 6周 0.53±0.38 1.88±0.25* 0.43±0.28 1.38±0.25* 8周 0.55±0.37 1.92±0.35* 0.45±0.22 1.42±0.35* 12周 0.57±0.38 2.10±0.38* 0.47±0.20 1.80±0.28*
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注:*未转染与转染后相比P<0.01
对雪旺细胞的分离纯化，我们采用消化后组织块法和差速离心法。组织块消化后，大量的雪旺细胞从组织块中爬出，1周后经胰蛋白酶消化，差速贴壁纯化两次。经免疫组化S-100和抗凝血酶鉴定纯度达95%以上。我们认为该法是获取大量高纯度SC的有效方法。我们用脂质体转染法将含NGF和BDNF表达基因的质粒导入SC，G418加压筛选，ELISA双抗体夹心ABC法测定未转染及转染后不同时期NGF和BDNF的浓度。2周后表达增加，4周后明显增加，差异有非常显著性意义(P<0.01)。NGFmRNA和BDNFmRNA水平的检测有待于进一步研究。转染后雪旺细胞的电镜观察其胞体多呈长梭形,细胞器丰富,可见到丰富的粗面内质网和线粒体,这可能与SC的分泌功能提高有关。
总之，SC作为受体细胞，NGF和BDNF可以稳定表达，并有以下优越性:(1)易于获取并能在体外大量培养繁殖；(2)能较长时间表达所携带基因而不衰减，并能稳定大量的表达，充分发挥两者的作用；(3)无显著的免疫原性；(4)减轻神经胶质瘢痕程度及缩小创腔；(5)植入损伤部位能诱导和促进轴突再生。总之，转NGF和BDNF基因的雪旺细胞将为修复脊髓和周围神经损伤提供前提条件。
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基金项目:国家自然科学青年基金资助项目(39900151)；天津市科委21世纪青年基金资助 项目(99166)；天津市卫生局科研基金资助项目(A13-85)
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(收稿日期:1999-08-30), 百拇医药