肿瘤基因疫苗——肿瘤免疫治疗的新途径
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国外医学肿瘤学分册 2000年6月第27卷第3期
肿瘤基因疫苗——肿瘤免疫治疗的新途径
中国医学科学院
血液学研究所 (天津 300020) 王 勇(综述) 吴克复(审校)
中国协和医科大学
摘 要 肿瘤细胞能表达肿瘤相关抗原(TAA)。TAA基因的克隆与鉴定为肿瘤基因疫苗的研究奠定了基础。肿瘤基因疫苗以TAA为攻击靶点，诱导机体产生TAA特异性抗肿瘤免疫，能够刺激宿主产生TAA特异性抗体和能溶解肿瘤细胞的细胞毒T淋巴细胞，并获得对相应肿瘤的免疫保护能力。接种肿瘤基因疫苗的小鼠能够排斥同种移植瘤的形成，延长荷瘤小鼠的生存期。
关键词：肿瘤基因疫苗 免疫治疗 肿瘤相关抗原
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基因疫苗也称DNA疫苗或基因免疫，是将编码某种抗原的基因片段克隆到真核表达质粒，再用该质粒DNA免疫动物。抗原编码基因能够在宿主体内表达。并刺激产生体液免疫和细胞免疫应答[1]。基因疫苗是由wolff等[2]在研究体内基因转染时意外发现的，对照组裸露的质粒DNA比实验组用脂质体包装的质粒DNA更容易转染；裸露的质粒DNS肌注后可以直接转染肌细胞，并表达其携带的报告基因。Tang等[3]首先证明DNA疫苗能够诱导小鼠产生抗人生长激素和α-1胰蛋白酶的抗体。目前，包括艾滋病DNA疫苗在内的一些基因疫苗已经进入Ⅰ～Ⅱ期临床试验[1.4]。
肿瘤相关抗原(TAA)不仅作为肿瘤标志物与肿瘤特异性的抗体结合用于免疫检测与诊断，而且也是抗肿瘤免疫攻击的靶点[5]。肿瘤抗原基因的克隆与鉴定，为肿瘤基因疫苗的研究奠定了基础。基因疫苗的突出优点是能通过不同途径诱导产生细胞毒T淋巴细胞(CTL)。由于CTL反应对控制病毒感染和抗肿瘤免疫起着重要作用。因此基因疫苗在诱导抗肿瘤免疫方面比常规疫苗更具有优势。
, 百拇医药
一、基因疫苗的构建
组成基因疫苗的两大要素是目的基因和表达载体。目的基因一般指编码抗原的cDNA序列，要求该基因片段能在哺乳动物细胞中表达；载体主要用质粒，因质粒可用大肠杆菌大量生产，但不会在哺乳细胞中复制整合。常用的有pSV2、pRSV、pcDNA3.1和pCI等质粒。基因疫苗的构建是在细菌质粒上引入一个真核启动子，如人巨细胞病毒早期启动子(CMV-IE)，在启动子的下游克隆进感兴趣的目的基因，其后接上PolyA和转录终止序列。简言之，在真核表达质粒上克隆进某抗原基因的cDNA序列，即构成了DNA疫苗或基因疫苗。由于质粒上不仅有大肠杆菌的复制起点，而且有真核启动子，所以基因疫苗既能在大肠杆菌中复制，又能在真核细胞表达。质粒经细菌扩增，再提取和纯化后溶于生理盐水溶液就可直接用于免疫接种[1-4]。
二、基因疫苗的免疫机制
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DNA疫苗能够有效地将其编码的抗原提呈给免疫系统，诱导广泛的免疫应答，包括诱导产生抗体、MHC-Ⅰ限制性CD8+的CTL和MHC-Ⅱ限制性的Th。
(一)基因疫苗的抗原递呈
质粒DNA注射到肌肉组织后，最容易被转染的是肌细胞。宿主肌细胞通过胞饮方式摄取外源性DNA。质粒编码的抗原基因在肌细胞内首先转录成mRNA，再翻译成抗原蛋白，经加工处理后，抗原分子与肌细胞表达的MHC-Ⅰ类抗原形成复合物，并将抗原递呈给CD8+细胞，诱导产生细胞免疫反应。Ulmer等[6]报道用流感病毒核蛋白(NP)基因转染C2C12肌肉细胞系，再将该细胞移植给C3H小鼠，尽管NP的表达仅局限于肌肉细胞，但还是检测到了NP特异性CTL的产生，提示在肌细胞表达的抗原能够诱导产生细胞免疫应答。
由于肌细胞不是专职的抗原递呈细胞(APC)，细胞表面无MHC-Ⅱ类抗原，也不表达B7等共刺激因子，因此单独由肌细胞递呈抗原是不够的，基因疫苗的抗原递呈机制中应包括单核-巨噬细胞在内的APC的作用，巨噬细胞可以吞噬受损伤的肌肉组织，并表达外源基因编码的抗原蛋白。转染的肌细胞释放表达的外来抗原，被巨噬细胞摄取，经加工后再提呈给Tc。或通过Th提呈给B细胞，诱导细胞与体液免疫[1，5]，肌肉组织中丰富的树突状细胞(dendritic cell ,DC)能表达MHC-Ⅱ和B7分子，是专职的APC。基因疫苗所编码的抗原是如何被DC递呈给VD4+细胞，并有效地诱导体液免疫的，目前尚不清楚。基因疫苗可能通过如下途径递呈抗原：①直接通过转染的肌细胞介导和递呈抗原；②专职的APC(如DC等细胞)被质粒DNA转染而表达和递呈抗原；③转染的肌细胞将表达的外来抗原转移给APC。
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尽管DNA疫苗最早是通过肌肉注射而获得有效免疫的，是使用最多、最方便的一种免疫方式，但是其它免疫途径，如皮下注射、皮内注射、静脉注射、基因枪轰击和鼻粘膜滴注等，均能获得有效的免疫应答。基因枪轰击可以直接转染皮肤的DC，被认为是目前最好的接种途径。
(二)基因疫苗的优越性
肿瘤疫苗的发展经历了肿瘤细胞疫苗、重组蛋白疫苗和基因疫苗三个阶段。基因疫苗具有制备容易、生产成本低廉、储存和运输方便、使用方法简单等常规疫苗无法比拟的优点。DNA疫苗的另一优势是可将多个抗原表位基因克隆同一表达载体，制备多表位DNA疫苗(多价疫苗)，诱导产生针对多种不同抗原表位的抗肿瘤免疫[7]。与病毒载体相比，质粒载体既不会引起抗质粒的免疫反应，也没有潜在的致病危险性。质粒DNA可长期存在于接种部位的组织细胞内，模拟自然感染过程，长期表达抗原蛋白(但不存在减毒活疫苗的毒力回复等危险)，持续刺激免疫系统，能够诱导产生强大而持久的免疫应答。DNA疫苗所表达的内源性抗原，有利于MHC-Ⅰ类分子的抗原呈递，有利于诱导CTL的产生，从而更有效的诱导抗肿瘤免疫反应。
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三、提高肿瘤疫苗的免疫效率
共刺激因子(costimulatory factors)是T细胞激活的第二信号。TCR与抗原结合产生T细胞活化的第一信号(初级信号)，而T细胞表面的的CD28与APC表达的B7分子结合产生第二信号，T细胞只有同时受到这两种信号的刺激，才能被完全活化，如果只有TCR介导的第一信号，缺乏B7等共刺激因子提供的第二信号，则可能导致T细胞的凋亡或产生免疫无反应性(免疫耐受)。作B细胞淋巴瘤和部分黑色素瘤外，肿瘤细胞不表达B7.1(CD80)或B7.2(CD86)分子,因此肿瘤细胞容易导致免疫耐受。
(一)转基因瘤苗
采用转基因手段用某些功能基因修饰肿瘤细胞，能提高瘤苗的免疫原性或激活效应细胞的功能，诱导产生保护性抗肿瘤免疫。为了提高肿瘤疫苗的免疫效率，主要采取的措施有：①共刺激因子和粘附分子基因修饰的瘤苗，能提供T细胞活化的第二信号，打破机体对肿瘤细胞的免疫耐受状态[5]；②用肿瘤细胞冲击DC或者用TAA基因转染DC，制备DC细胞疫苗，这种DC细胞既能将TAA提呈给免疫细胞，又能提供B7等共刺激因子，因此能够更有效地诱导抗肿瘤免疫反应[8.9]；③用GM-CSF或lL-12等细胞因子基因转染自体瘤细胞,以增强瘤苗的免疫反应性。最近，应用转染了GM-CSF或IL-12等基因的自体瘤苗治疗晚期黑色素瘤的计划，已进入早期临床试验阶段[10]。
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(二)基因疫苗的“免疫佐剂”
GM-CSF、lL-12或IL-15等细胞因子可以大大增强基因疫苗的免疫效率，共同注射DNA疫苗和细胞因子的表达质粒，其诱导产生免疫反应的效率高于单独用基因疫苗组[11]。疫苗注射局部产生高浓度的GM-CSF，其能够刺激DC的迁移，促进DC的增殖与成熟，增加DC对抗原的摄取，以促进产生免疫应答。IL-12激活CTL并诱导强大的抗肿瘤反应，因此认为这些细胞因子对基因疫苗具有“免疫佐剂”的作用[12]。
四、基因疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫反应
肿瘤基因疫苗能诱导肿瘤细胞特异性的CTL和TAA特异性的抗体产生，使宿主获得保护性的抗肿瘤免疫。
(一)黑色素瘤
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黑色素瘤的化疗效果很差，有效率低于25%，而黑色素瘤的免疫治疗开展较早，取得的经验也较丰富。动物实验证实无论是重组蛋白疫苗，还是DNA疫苗都获得了抗肿瘤免疫反应[5]。研究表明，黑色素瘤抗原MAGE-3的单表位疫苗能够刺激产生黑色素瘤特异性的CTL，并导致肿瘤的消失。黑色素瘤及其转移瘤的抗原表达变异很大，如36%的原位黑色素瘤和76%的转移瘤表达MAGE-3抗原；另外有大约50%的黑色素瘤表达酪氨酸激酶。因此，单表位的DNA疫苗难以对付黑色素瘤抗原的高度变异性，多表位DNA疫苗可以攻击黑色素瘤的多个靶抗原，以防止黑色素瘤因肿瘤抗原表达的差异而逃避免疫攻击[7]。
(二)独特型DNA疫苗
多数B细胞淋巴瘤具有单一B细胞克隆性增殖的特性，其特异性的B细胞受体，即独特型表面免疫球蛋白，不仅是B淋巴瘤的标志物，同时也是特异性的肿瘤抗原，可以诱导免疫应答，成为免疫系统攻击的靶点。实验证明独特型表面免疫球蛋白分子和独特型DNA疫苗都能够诱导抗独特型抗体(anti-Id)的产生，保护小鼠免遭移植瘤的攻击[13]。应用编码有Id和GM-CSf融合蛋白的DNA疫苗，证明GM-CSF能够提高独特型DNA疫苗的免疫效率，使免疫小鼠获得对B细胞淋巴瘤的免疫保护能力[14]。
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(三)SV40T抗原基因疫苗
猴病毒40型(SV40)是一种多瘤DNA病毒，SV40基因组编码两种肿瘤抗原，即大T和小T抗原。大T抗原能与抑癌基因产物p53和Rb蛋白结合，导致细胞转化。研究表明，SV40可能与多种脑瘤、骨肉瘤和胸膜间皮癌有关。SV40大T抗原是肿瘤特异性抗原，对大T抗原有特异性免疫反应的小鼠，可以免受某些肿瘤细胞的攻击。Bright等[15]用SV40大T抗原的DNA疫苗免疫BALB/C小鼠，尽管血清中大T抗原特异性的抗体滴度无明显升高，但是疫苗诱导产生了MHC-Ⅰ限制性的CTL，该CTL细胞能够特异性地溶解SV40转化细胞。肿瘤移植实验证实，大T抗原DNA疫苗可以使免疫小鼠免受致死剂量mKSA肿瘤细胞的攻击[16]。最近有作者认为，T抗原基因疫苗将为人类SV40相关肿瘤的防治提供了一崭新的途径，应用前景乐观[17]。
(四)CEA疫苗
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癌胚抗原(CEA)是最早发现的TAA，属于胚胎性癌蛋白。CEA已作为肿瘤标志物，用于一些肿瘤的辅助诊断与监测。近年，以CEA为靶点的肿瘤免疫治疗，特别是在CEA肿瘤疫苗的研究方面取得了很大进展。Robbins等克隆了人CEA的cDNA，并用该cDNA转染小鼠结肠癌细胞，建立了能表达人CEA小鼠结肠癌细胞系和CEA疫苗抗肿瘤的动物模型。将CEA的cDNA插入一病毒疫苗的基因组，制成重组病毒疫苗，用该疫苗免疫小鼠，可获得CEA特异性的体液和细胞免疫，并获得对能够表达人CEA小鼠结肠癌的免疫力。Conry等用CEA基因疫苗免疫C57小鼠，也获得CEA特异性的体液和细胞免疫；体内实验证实CEA基因疫苗具有抗肿瘤活性[18，19]。
(五)E6和PSA基因疫苗
由于绝大多数宫颈癌与人乳头瘤状病毒(HPV)有关，因此HPV编码的E6和E7癌蛋白成为宫颈癌免疫治疗的理想靶点。Tan等[20]用E6癌蛋白N未端(E6的非转化结构域)的编码序列建DNA疫苗，使免疫小鼠产生E6特异性的CTL，肿瘤移植实验证实免疫小鼠能够排斥移植瘤的形成，提示小鼠获得了保护性的抗肿瘤免疫。
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前列腺特异性抗原(prostate specific antigen， PSA)是在前列腺特异性表达的TAA。Kim等[21]报道PSA基因疫苗能够刺激小鼠产生PSA特异性的抗体和CTL，该CTL能特异性地杀伤和溶解PSA表达阳性的肿瘤细胞。该研究结果展示了PSA基因疫苗在前列腺癌防治中的潜在价值。
结 语
基因疫苗诱导产生肿瘤特异性的抗体和CTL的事实，已在动物实验得到了广泛证实。基因疫苗对人类肿瘤治疗与预防的有效性和安全性，是未来研究的重点。值得一提的是，CEA基因疫苗的研究最近已进入临床试验阶段[22]。经典的基因治疗是针对遗传缺陷在基因水平进行纠正。广义的基因治疗包括为达到治疗疾病目的，而在基因水平进行操作的所有治疗措施的总和。因此，基因疫苗实质上属于基因治疗的范畴，其重组载体的构建、基因转移及最终的医疗目的均与基因治疗无本质的差异。基因疫苗作为“第三次疫苗革命”的一项新技术，兼有基因治疗和免疫治疗的共同特性，必将随着肿瘤基因治疗和免疫技术的进步，逐步发展与完善，最终造福人类。
, 百拇医药
参考文献
1 Tuteja R,Crit Rev Biochem Mol Biol,1999,34(1):1～24
2 Wolff J A, Malone RW,Williams P,et al.Science ,1990;247(4949 Pt 1):1465～1468
3 Tang DC,Devit M,Johnston SA.Nature, 1992; 356(6365);152～154
4 MacGregor RR, Boyer JD, Ugen KE,et al.J Infect ,Dis ,1998;178(1)92～100
5 Hellstrom I,Hellstrom KE. J Immunother ,1998,21(2)119～126
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6 Ulmer JB,Deck RR, Dewitt CM,et al.lmmunology,1996;89(1):59～67
7 Suhrbier A.lmmunol Cell Biol,1997,75(4):402～408
8 Tuting T,Wilson CC, Martin DM, et al.J Immunol ,1998;160(3):1139～147
9 Philip R, Brunette E, Ashton J,et al.Cancer Gene Ther,1998;5(4):236～246
10 Sun Y,Jurgovsky K,Moller P,et al.Gene Ther,1998;5(4):236～246
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11 Xin KQ,Hamajima K, Sasaki S ,et al.Vaccine ,1999,17(7-8):858～866
12 Sin JI, Kim JJ, Arnold RL, et al.J Immunol,1999;162(5):2912～2921
13 Kwak LW ,Pennington R,Longo DL.Blood ,1996;87(7):3053～3060
14 Schultze JL Hematol Oncol,1997;15(3);129～139
15 Bright RK, Beames B, Shearer MH, et al. Cancer Res ,1996;56(5):1126～1130
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16 Schirmbeck R, Bohm W, Reimann J.J Immunol ,1996;157(8):3550～3558
17 Xie YC, Hwang, C,Overwijk W, et al.J Natl Cancer lnst ,1999;91(2):169～175
18 Conry RM, LoBuglio AF, Kantor,J et al Cancer Res ,1994;54(5):1164～1168
19 Smith BF, Baker HJ, Curier DT, et al Gene Ther ,1998;5(7):865～868
20 Tan J, Yang NS, Turner JG, et al.Cancer Gene Ther ,1999;6(4):331～339
21 Kim JJ, Trivedi NN, Wilson DM,et al. Oncogene, 1998,17(24):3125～3135
22 Zhu MZ, Marshall J,Cole D, et al. Clin Cancer Res,2000,6(1):24～33, 百拇医药
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血液学研究所 (天津 300020) 王 勇(综述) 吴克复(审校)
中国协和医科大学
摘 要 肿瘤细胞能表达肿瘤相关抗原(TAA)。TAA基因的克隆与鉴定为肿瘤基因疫苗的研究奠定了基础。肿瘤基因疫苗以TAA为攻击靶点，诱导机体产生TAA特异性抗肿瘤免疫，能够刺激宿主产生TAA特异性抗体和能溶解肿瘤细胞的细胞毒T淋巴细胞，并获得对相应肿瘤的免疫保护能力。接种肿瘤基因疫苗的小鼠能够排斥同种移植瘤的形成，延长荷瘤小鼠的生存期。
关键词：肿瘤基因疫苗 免疫治疗 肿瘤相关抗原
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基因疫苗也称DNA疫苗或基因免疫，是将编码某种抗原的基因片段克隆到真核表达质粒，再用该质粒DNA免疫动物。抗原编码基因能够在宿主体内表达。并刺激产生体液免疫和细胞免疫应答[1]。基因疫苗是由wolff等[2]在研究体内基因转染时意外发现的，对照组裸露的质粒DNA比实验组用脂质体包装的质粒DNA更容易转染；裸露的质粒DNS肌注后可以直接转染肌细胞，并表达其携带的报告基因。Tang等[3]首先证明DNA疫苗能够诱导小鼠产生抗人生长激素和α-1胰蛋白酶的抗体。目前，包括艾滋病DNA疫苗在内的一些基因疫苗已经进入Ⅰ～Ⅱ期临床试验[1.4]。
肿瘤相关抗原(TAA)不仅作为肿瘤标志物与肿瘤特异性的抗体结合用于免疫检测与诊断，而且也是抗肿瘤免疫攻击的靶点[5]。肿瘤抗原基因的克隆与鉴定，为肿瘤基因疫苗的研究奠定了基础。基因疫苗的突出优点是能通过不同途径诱导产生细胞毒T淋巴细胞(CTL)。由于CTL反应对控制病毒感染和抗肿瘤免疫起着重要作用。因此基因疫苗在诱导抗肿瘤免疫方面比常规疫苗更具有优势。
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一、基因疫苗的构建
组成基因疫苗的两大要素是目的基因和表达载体。目的基因一般指编码抗原的cDNA序列，要求该基因片段能在哺乳动物细胞中表达；载体主要用质粒，因质粒可用大肠杆菌大量生产，但不会在哺乳细胞中复制整合。常用的有pSV2、pRSV、pcDNA3.1和pCI等质粒。基因疫苗的构建是在细菌质粒上引入一个真核启动子，如人巨细胞病毒早期启动子(CMV-IE)，在启动子的下游克隆进感兴趣的目的基因，其后接上PolyA和转录终止序列。简言之，在真核表达质粒上克隆进某抗原基因的cDNA序列，即构成了DNA疫苗或基因疫苗。由于质粒上不仅有大肠杆菌的复制起点，而且有真核启动子，所以基因疫苗既能在大肠杆菌中复制，又能在真核细胞表达。质粒经细菌扩增，再提取和纯化后溶于生理盐水溶液就可直接用于免疫接种[1-4]。
二、基因疫苗的免疫机制
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DNA疫苗能够有效地将其编码的抗原提呈给免疫系统，诱导广泛的免疫应答，包括诱导产生抗体、MHC-Ⅰ限制性CD8+的CTL和MHC-Ⅱ限制性的Th。
(一)基因疫苗的抗原递呈
质粒DNA注射到肌肉组织后，最容易被转染的是肌细胞。宿主肌细胞通过胞饮方式摄取外源性DNA。质粒编码的抗原基因在肌细胞内首先转录成mRNA，再翻译成抗原蛋白，经加工处理后，抗原分子与肌细胞表达的MHC-Ⅰ类抗原形成复合物，并将抗原递呈给CD8+细胞，诱导产生细胞免疫反应。Ulmer等[6]报道用流感病毒核蛋白(NP)基因转染C2C12肌肉细胞系，再将该细胞移植给C3H小鼠，尽管NP的表达仅局限于肌肉细胞，但还是检测到了NP特异性CTL的产生，提示在肌细胞表达的抗原能够诱导产生细胞免疫应答。
由于肌细胞不是专职的抗原递呈细胞(APC)，细胞表面无MHC-Ⅱ类抗原，也不表达B7等共刺激因子，因此单独由肌细胞递呈抗原是不够的，基因疫苗的抗原递呈机制中应包括单核-巨噬细胞在内的APC的作用，巨噬细胞可以吞噬受损伤的肌肉组织，并表达外源基因编码的抗原蛋白。转染的肌细胞释放表达的外来抗原，被巨噬细胞摄取，经加工后再提呈给Tc。或通过Th提呈给B细胞，诱导细胞与体液免疫[1，5]，肌肉组织中丰富的树突状细胞(dendritic cell ,DC)能表达MHC-Ⅱ和B7分子，是专职的APC。基因疫苗所编码的抗原是如何被DC递呈给VD4+细胞，并有效地诱导体液免疫的，目前尚不清楚。基因疫苗可能通过如下途径递呈抗原：①直接通过转染的肌细胞介导和递呈抗原；②专职的APC(如DC等细胞)被质粒DNA转染而表达和递呈抗原；③转染的肌细胞将表达的外来抗原转移给APC。
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尽管DNA疫苗最早是通过肌肉注射而获得有效免疫的，是使用最多、最方便的一种免疫方式，但是其它免疫途径，如皮下注射、皮内注射、静脉注射、基因枪轰击和鼻粘膜滴注等，均能获得有效的免疫应答。基因枪轰击可以直接转染皮肤的DC，被认为是目前最好的接种途径。
(二)基因疫苗的优越性
肿瘤疫苗的发展经历了肿瘤细胞疫苗、重组蛋白疫苗和基因疫苗三个阶段。基因疫苗具有制备容易、生产成本低廉、储存和运输方便、使用方法简单等常规疫苗无法比拟的优点。DNA疫苗的另一优势是可将多个抗原表位基因克隆同一表达载体，制备多表位DNA疫苗(多价疫苗)，诱导产生针对多种不同抗原表位的抗肿瘤免疫[7]。与病毒载体相比，质粒载体既不会引起抗质粒的免疫反应，也没有潜在的致病危险性。质粒DNA可长期存在于接种部位的组织细胞内，模拟自然感染过程，长期表达抗原蛋白(但不存在减毒活疫苗的毒力回复等危险)，持续刺激免疫系统，能够诱导产生强大而持久的免疫应答。DNA疫苗所表达的内源性抗原，有利于MHC-Ⅰ类分子的抗原呈递，有利于诱导CTL的产生，从而更有效的诱导抗肿瘤免疫反应。
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三、提高肿瘤疫苗的免疫效率
共刺激因子(costimulatory factors)是T细胞激活的第二信号。TCR与抗原结合产生T细胞活化的第一信号(初级信号)，而T细胞表面的的CD28与APC表达的B7分子结合产生第二信号，T细胞只有同时受到这两种信号的刺激，才能被完全活化，如果只有TCR介导的第一信号，缺乏B7等共刺激因子提供的第二信号，则可能导致T细胞的凋亡或产生免疫无反应性(免疫耐受)。作B细胞淋巴瘤和部分黑色素瘤外，肿瘤细胞不表达B7.1(CD80)或B7.2(CD86)分子,因此肿瘤细胞容易导致免疫耐受。
(一)转基因瘤苗
采用转基因手段用某些功能基因修饰肿瘤细胞，能提高瘤苗的免疫原性或激活效应细胞的功能，诱导产生保护性抗肿瘤免疫。为了提高肿瘤疫苗的免疫效率，主要采取的措施有：①共刺激因子和粘附分子基因修饰的瘤苗，能提供T细胞活化的第二信号，打破机体对肿瘤细胞的免疫耐受状态[5]；②用肿瘤细胞冲击DC或者用TAA基因转染DC，制备DC细胞疫苗，这种DC细胞既能将TAA提呈给免疫细胞，又能提供B7等共刺激因子，因此能够更有效地诱导抗肿瘤免疫反应[8.9]；③用GM-CSF或lL-12等细胞因子基因转染自体瘤细胞,以增强瘤苗的免疫反应性。最近，应用转染了GM-CSF或IL-12等基因的自体瘤苗治疗晚期黑色素瘤的计划，已进入早期临床试验阶段[10]。
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(二)基因疫苗的“免疫佐剂”
GM-CSF、lL-12或IL-15等细胞因子可以大大增强基因疫苗的免疫效率，共同注射DNA疫苗和细胞因子的表达质粒，其诱导产生免疫反应的效率高于单独用基因疫苗组[11]。疫苗注射局部产生高浓度的GM-CSF，其能够刺激DC的迁移，促进DC的增殖与成熟，增加DC对抗原的摄取，以促进产生免疫应答。IL-12激活CTL并诱导强大的抗肿瘤反应，因此认为这些细胞因子对基因疫苗具有“免疫佐剂”的作用[12]。
四、基因疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫反应
肿瘤基因疫苗能诱导肿瘤细胞特异性的CTL和TAA特异性的抗体产生，使宿主获得保护性的抗肿瘤免疫。
(一)黑色素瘤
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黑色素瘤的化疗效果很差，有效率低于25%，而黑色素瘤的免疫治疗开展较早，取得的经验也较丰富。动物实验证实无论是重组蛋白疫苗，还是DNA疫苗都获得了抗肿瘤免疫反应[5]。研究表明，黑色素瘤抗原MAGE-3的单表位疫苗能够刺激产生黑色素瘤特异性的CTL，并导致肿瘤的消失。黑色素瘤及其转移瘤的抗原表达变异很大，如36%的原位黑色素瘤和76%的转移瘤表达MAGE-3抗原；另外有大约50%的黑色素瘤表达酪氨酸激酶。因此，单表位的DNA疫苗难以对付黑色素瘤抗原的高度变异性，多表位DNA疫苗可以攻击黑色素瘤的多个靶抗原，以防止黑色素瘤因肿瘤抗原表达的差异而逃避免疫攻击[7]。
(二)独特型DNA疫苗
多数B细胞淋巴瘤具有单一B细胞克隆性增殖的特性，其特异性的B细胞受体，即独特型表面免疫球蛋白，不仅是B淋巴瘤的标志物，同时也是特异性的肿瘤抗原，可以诱导免疫应答，成为免疫系统攻击的靶点。实验证明独特型表面免疫球蛋白分子和独特型DNA疫苗都能够诱导抗独特型抗体(anti-Id)的产生，保护小鼠免遭移植瘤的攻击[13]。应用编码有Id和GM-CSf融合蛋白的DNA疫苗，证明GM-CSF能够提高独特型DNA疫苗的免疫效率，使免疫小鼠获得对B细胞淋巴瘤的免疫保护能力[14]。
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(三)SV40T抗原基因疫苗
猴病毒40型(SV40)是一种多瘤DNA病毒，SV40基因组编码两种肿瘤抗原，即大T和小T抗原。大T抗原能与抑癌基因产物p53和Rb蛋白结合，导致细胞转化。研究表明，SV40可能与多种脑瘤、骨肉瘤和胸膜间皮癌有关。SV40大T抗原是肿瘤特异性抗原，对大T抗原有特异性免疫反应的小鼠，可以免受某些肿瘤细胞的攻击。Bright等[15]用SV40大T抗原的DNA疫苗免疫BALB/C小鼠，尽管血清中大T抗原特异性的抗体滴度无明显升高，但是疫苗诱导产生了MHC-Ⅰ限制性的CTL，该CTL细胞能够特异性地溶解SV40转化细胞。肿瘤移植实验证实，大T抗原DNA疫苗可以使免疫小鼠免受致死剂量mKSA肿瘤细胞的攻击[16]。最近有作者认为，T抗原基因疫苗将为人类SV40相关肿瘤的防治提供了一崭新的途径，应用前景乐观[17]。
(四)CEA疫苗
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癌胚抗原(CEA)是最早发现的TAA，属于胚胎性癌蛋白。CEA已作为肿瘤标志物，用于一些肿瘤的辅助诊断与监测。近年，以CEA为靶点的肿瘤免疫治疗，特别是在CEA肿瘤疫苗的研究方面取得了很大进展。Robbins等克隆了人CEA的cDNA，并用该cDNA转染小鼠结肠癌细胞，建立了能表达人CEA小鼠结肠癌细胞系和CEA疫苗抗肿瘤的动物模型。将CEA的cDNA插入一病毒疫苗的基因组，制成重组病毒疫苗，用该疫苗免疫小鼠，可获得CEA特异性的体液和细胞免疫，并获得对能够表达人CEA小鼠结肠癌的免疫力。Conry等用CEA基因疫苗免疫C57小鼠，也获得CEA特异性的体液和细胞免疫；体内实验证实CEA基因疫苗具有抗肿瘤活性[18，19]。
(五)E6和PSA基因疫苗
由于绝大多数宫颈癌与人乳头瘤状病毒(HPV)有关，因此HPV编码的E6和E7癌蛋白成为宫颈癌免疫治疗的理想靶点。Tan等[20]用E6癌蛋白N未端(E6的非转化结构域)的编码序列建DNA疫苗，使免疫小鼠产生E6特异性的CTL，肿瘤移植实验证实免疫小鼠能够排斥移植瘤的形成，提示小鼠获得了保护性的抗肿瘤免疫。
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前列腺特异性抗原(prostate specific antigen， PSA)是在前列腺特异性表达的TAA。Kim等[21]报道PSA基因疫苗能够刺激小鼠产生PSA特异性的抗体和CTL，该CTL能特异性地杀伤和溶解PSA表达阳性的肿瘤细胞。该研究结果展示了PSA基因疫苗在前列腺癌防治中的潜在价值。
结 语
基因疫苗诱导产生肿瘤特异性的抗体和CTL的事实，已在动物实验得到了广泛证实。基因疫苗对人类肿瘤治疗与预防的有效性和安全性，是未来研究的重点。值得一提的是，CEA基因疫苗的研究最近已进入临床试验阶段[22]。经典的基因治疗是针对遗传缺陷在基因水平进行纠正。广义的基因治疗包括为达到治疗疾病目的，而在基因水平进行操作的所有治疗措施的总和。因此，基因疫苗实质上属于基因治疗的范畴，其重组载体的构建、基因转移及最终的医疗目的均与基因治疗无本质的差异。基因疫苗作为“第三次疫苗革命”的一项新技术，兼有基因治疗和免疫治疗的共同特性，必将随着肿瘤基因治疗和免疫技术的进步，逐步发展与完善，最终造福人类。
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参考文献
1 Tuteja R,Crit Rev Biochem Mol Biol,1999,34(1):1～24
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