急性低血容量性休克后低剂量内毒素致早期急性呼吸窘迫综合征动物模型研制
徐远达 萧正伦 罗炜 黄海鹭
摘要 目的：模拟制作一种更接近临床早期急性呼吸窘迫综合征(ARDS)病理生理过程的动物模型。方法：22只新西兰白兔分成4组：①低血容量性休克组(6只)：急性失血后休克过程 持 续1小时，以心排血量(CO)低于基础40%为准，回输放出的血并抗休克处理90分钟后再观察4 小时；②内毒素组(6只)：静注内毒素(LPS)1 μg/kg，再观察4小时；③休克加内毒 素组(6只)：急性低血容量性休克恢复90分钟后再静注LPS 1 μg/kg；④对照组(4只)只 接受相同麻醉和手术操作。静脉麻醉后，4组动物均置入3F的导管监测实验过程的血流动 力学和5F的导管在 股动脉(放血用)。动物苏醒后分基础期、低血容量性休克期、休克恢复期、静注LPS 2小 时期和静注LPS 4小时期5个阶段观察，实验结束后取肺泡灌洗液测白介素1β(IL1β)浓度和右肺干重/湿重比。结果：第1、2、4组的CO、动脉血氧分压(PaO2)、肺内分流(
s/t)在静注LPS后4小时期与基础期比较无显著差异，而第 3组的PaO2从(11.2±1.8)kPa(1 kPa=7.5 mmHg)降至(9.3±2.3)kPa，s/t从1.9%±0.5%升至2.3%±1.5%，与其它组比较虽无显著差异但呈下降趋势，且血浆IL 1β在静注LPS 2小时和4小时后持续升高，分别为(198.9±55.0)ng/L和(25 1.0±119.5)ng/L，而对照组为(71.2±12.0)ng/L(P<0.05)，肺泡灌洗液 中IL1β显著升高到(18.9±10.0)ng/L，与对照组(4.2±3.0)ng/L比 较P<0.05；此外，该组的右肺干重/湿重比为0.17±0.02，与对照组0.30±0.03 比较有显著差异(P<0.05 )。结论：此实验的第3组动物的病理生理改变稳定于急性肺损伤发展为 炎症性肺水肿前的阶段。提示此动物模型可用于研究早期急性呼吸窘迫综合征的发病机制。
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关键词：呼吸窘迫综合征，急性，兔 肺损伤，急性 血流动力学
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)诊断率近年来有了 大幅提高；但病死率至今仍停留在40%～60%的水平，其原因之一是我们所采用的临床诊断指 标是疾病已发展到肺水肿和氧合功能明显下降的严重阶段。近年来已重视ARDS的早期诊治研 究。根据ARDS的病因分析，创伤和感染是大多数ARDS发病的主要原因(两者还可相互促进)， 因此，本实验应用新西兰白兔在急性失血休克后加静注小剂量内毒素(LPS)模拟早期ARDS 的病理生理过程〔1〕。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组：新西兰纯种白兔22只，雌雄不拘(由广州市药检所实验动物中心提供，达到4级标准)，体 重(1.75±0.25)kg，随机分成4组：1组低血容量性休克组(6只)：急性失血后休克过程 持续1小时，以心排血量(CO)低于基础40%为准，回输放出的血并抗休克处理90分钟后再 观察4小时；2组内毒素组(6只)：静注LPS 1 μg/kg，再观察4小时；3组休克加内毒 素组(6只)：急性低血容量性休克恢复90分钟后再静注LPS 1 μg/kg；4组对照组(4只)：只 接受相同的麻醉和手术置管操作，动物苏醒后观察相同时间。
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1.2 实验步骤：
1.2.1 氯胺酮0.5 mg/kg耳缘静脉注入麻醉，动物保持自主呼吸，在2% 利多卡因局麻下，用消毒器械分离一侧颈内静脉和对侧颈动脉，分别置入3 F的静脉和动脉 双腔导管(美国Arrow公司)，用热稀释法测CO，并以美国IVY监护仪连续监测体循环和肺循 环参数；分离右股动脉，置入5 F单腔动脉导管(放血用)；固定好各导管后缝合皮肤，把 动物置于特制架子(使兔子除头部外四肢活动不受限制)等待苏醒，动物苏醒后可进食、喝水 。当完全苏醒后记录基础参数：包括血压(BP)、中心静脉压(CVP)、心率(HR)、呼吸 频率(R)、体温(T)、动脉和静脉血氧分压(PaO2和PvO2)、肺内分流(s/t)及CO等。
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1.2.2 实验过程共分5个期：①基础期：各组动物完全苏醒后。②低血 容量性休克期：第1、3组动物从股动脉导管中快速放血，放出的血在室温下用12 kU/L 浓度的肝素抗凝保存，此过程的关键是使CO低于基础40%，共维持60分钟，每15分钟 测1次CO， 必要时可继续放血以维持这个水平，休克60分钟时记录各组参数。③休克恢复期：将放出的 血在30分钟内回输给动物，再稳定60分钟后记录各组参数。④静注LPS 2小时期：第3组动物静注LPS 1 μg/kg持续30分钟，隔2小 时后记录各组参数。⑤静注LPS 4小时期：静注LPS后连续观察4小时。实验动物如果出 现 血压或CO下降，可静滴林格氏液维持，将不能纠正的动物排除在实验范围之外(大约有10只 兔出现上述情况，经分析主要原因是手术过程较长，麻醉药量大，手术后苏醒不彻底等 ，另有部分是补液量过大、回输血过快所至)。
1.2.3 静注LPS后4小时用空气栓塞处死动物，仔细分离肺脏，右肺称重 后用15 ml冰冻生理盐水做肺灌洗，灌洗重复4次，收集的肺泡灌洗液进一步做生化检查，用 酶联免疫吸附法(ELISA)测灌洗液中白介素1β(ILβ)浓度，将此 肺过夜烤干后再称重，与烤干前对 比得出肺的干重/湿重比。动物左肺经10%甲醛溶液固定后石蜡切片，HE染色做组织学检查。
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1.3 统计学方法：数据用均数±标准差(x±s)表示。 采用配对t和成组t检验，P<0.05为有显著差异。
2 结 果
2.1 血流动力学变化：各组动物在基础期的血流动力学情况稳 定，如HR、BP、R、PaO2、s/t、CO等，各组间无显著差异(P >0.05)；第1、3组动物在 休克60分钟期CO从基础值的(0.30±0.10)L/min降至(0.15±0.05)L/min，下降幅度 达40%左右，HR从(165±24)次/min升高至(210±36)次/min，R从(45±30)次/min 升高至(64±35)次/min，动物出现轻到中度的呼吸困难，PaO2从(12.4±3.7)kPa( 1 kPa=7.5 mmHg)降至(8.5±2.8)kPa，s/t则从1.7%±0.2% 升至3.2%±1.6%；第1、3组动物休克60分钟期各项血流动力学指标与基础期相比均有 显著差异(P均<0.05)；当放出的血缓慢回输进入休克恢复期后，上述各项指标均有 改善并接近基础期的水平，与基础期相比无显著差异(P>0.05)；第2、4组动物在 这期间各项血流动力学指标均较平稳，各期比较无显著性差异(P>0.05)。接着第2 、3组动物予LPS 1 μg/kg静注，开始时第2组动物的全身反应较强烈，出现一过性低血压， 呼吸、心率加快，较烦躁，部分动物体温增加了2 ℃，约1小时后上述全身症状渐有缓 解， 静注LPS后2小时和4小时的血流动力学指标与基础期比较无显著差异(P>0.05)；而第 3组动物经历了低血容量性休克后，在开始静注LPS时并无显著生理反应，但随着时间推移， 大多数动物逐渐出现呼吸频率增快，静注LPS 4小时后PaO2从(11.2±1.8)kPa降 至(9.3±2.3)kPa，s/t从1.9%±0.5%升至2.3%±1.5%， 与第1、2、4组同期比较虽无显著差异(P>0.05)，但有明显恶化趋势(表1)。
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2.2 4组动物血浆IL1β在各期的动态变化：第1、3组在 低血容量性 休克60分钟期血浆IL1β均一过性显著升高，与基础期比较有显著差异，休 克恢复后逐渐 回落正常，但第3组在静注LPS 2小时和4小时后再次持续升高，与各组比较有显著差异( P<0.05，表2)。
2.3 右肺干重/湿重比和肺泡灌洗液中IL1β浓度 测定结果见表3。第3组动物的肺泡灌洗液中IL1β显著升高，与对照组 相 比P<0.05；此外该组动物的右肺干重/湿重比与对照组比较有显著差异(P<0 .05)。
2.4 肺组织光镜检查：4组动物HE染色切片光镜下的结构基本相似，大 部分肺泡结构清晰，肺泡隔无明显增宽，肺泡腔无明显渗出(图1)。但第3组动物的部分肺泡在光镜下可见肺泡隔有显著增宽，并有粒细胞和红细胞的渗出，但肺泡腔尚无显著渗 出(图2，3)。由于血压或CO不能维持而被排除实验范围的动物，其镜下大部分肺泡主 要可见毛细血管充血、肺泡有较多红细胞渗出(图4)，结合症状和体征考虑呈急性心源性肺 水肿的改变。 表1 4组动物实验过程中血流动力学变化((x±s)
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组别
动物数
(只)
PaO2(kPa)
基础期
低血容量性休克期
休克恢复期
静注LPS 2小时期
静注LPS 4小时期
1.低血容量性休克组
6
13.2±2.8
, 百拇医药
8.2±3.5*
10.4±2.2
10.3±2.1[ ]10.9±3.1
2.LPS组
6
11.5±4.5
12.1±3.6
12.6±2.3
10.8±1.7
11.3±2.0
3.休克加LPS组
6
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12.4±3.7
8.5±2.8*
11.2±1.8
10.7±1.6
9.3 ±2.3
4.对照组
4
12.1±3.2
12.3±2.4
12.2±1.8
12.0±1.6
11.6±2.2
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组别
动物数
(只)s/t (%)
基础期
低血容量性休克期
休克恢复期
静注LPS 2小时期
静注LPS 4小时期
, 百拇医药
1.低血容量性休克组
6
1.6±0.2
3.4±1.8*
2.1±1.0
1.9±0.6
2.0±1.1
2.LPS组
6
1.9±0.3
1.8±0.2
1.7±0.2
, 百拇医药
2.2±0.1
1.9±0.2
3.休克加LPS组
6
1.7±0.2
3.2±1.6*
1.9±0.5
2.0±1.0
2.3±1.5
4.对照组
4
1.7±0.2
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1.7±0.2
1.7±0.1
1.7±0.1
1.7±0.1
组别
动物数
(只)
R(次/min)
基础期
低血容量性休克期
休克恢复期
静注LPS 2小时期
, 百拇医药 静注LPS 4小时期
1.低血容量性休克组
6
45±30
63±33*
50±28
48±30
47±24
2.LPS组
6
45±30
45±30
, http://www.100md.com 45±30
60±20
48±26
3.休克加LPS组
6
45±30
64±35*
48±25
52±18
56±22
4.对照组
4
45±30
, 百拇医药
45±30
45±30
45±30
45±30
组别
动物数
(只)
CO(L/min)
基础期
低血容量性休克期
休克恢复期
静注LPS 2小时期
静注LPS 4小时期
, 百拇医药
1.低血容量性休克组
6
0.30±0.10
0.15±0.10*
0.35±0.10
0.30±0.10
0.28±0.20
2.LPS组
6
0.30±0.10
0.30±0.10
0.30±0.10
, 百拇医药
0.40±0.20
0.28±0.20
3.休克加LPS组
6
0.30±0.10
0.15±0.05*
0.40±0.10
0.33±0.20
0.33±0.20
4.对照组
4
0.30±0.10
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0.30±0.10
0.30±0.10
0.30±0.10
0.30±0.10
注：与同组基础期比较：*P<0.05 表2 4组动物在5个不同时期血浆IL1β的动态变化(x±s)ng/L
组别
动物数(只)
基础期
低血容量性休克期
休克恢复期
静注LPS 2小时 期
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静注LPS 4小时期
1.低血容量性休克组
6
80.1±25.0
380.5±289.0☆
183.7±108.0
108.5±92.0
93.7± 66.0
2.LPS组
6
106.9±56.0
106.9± 56.0
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106.9± 56.0
161.0±57.0
130.6± 56.0
3.休克加LPS组
6
100.2±48.0
213.6± 82.0☆
52.3± 21.0
198.9±55.0*
251.1±119.5*
4.对照组
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4
75.2±13.0
64.3± 13.0
71.2± 12.0
71.2±12.0
71.2± 12.0
注：与同组基础期比较：☆P<0.05；与其它组同期比较：*P<0.05表3 4组动物右肺干重/湿重比和肺泡灌洗液中IL1β测定结果(x±s)
组别
动物
数(只)
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肺泡灌洗液IL1β
(ng/L)
右肺干重/
湿重比
1.低血容量性休克组
6
9.2± 8.0
0.25±0.01
2.LPS组
6
8.2± 4.0
0.22±0.01
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3.休克加LPS组
6
18.9±10.0*
0.17±0.02*
4.对照组
4
4.2± 3.0
0.30±0.03
注：与对照组比较：*P<0.05 3 讨 论
ARDS的发病机制错综复杂， 目前认为重症感染、创伤、休克时，在内毒素(包括肠屏障功能受损后继发的肠道内生菌 和毒素)移位作用下，肺泡单核巨噬细胞和分叶核粒细胞最早产生肿瘤坏死 因子(TNFα)和IL1β，启动了炎症的级联反应(Cascade )， 直接损害肺部引起ARDS的只占少数。近年来提出急性肺损伤(ALI)是ARDS的早期阶段,ALI 包括在全身炎症反应综合征(SIRS)中〔1〕。1994年欧美ARDS专家协调会议提出这 样 一个观点：ARDS是ALI发展最严重的阶段，ARDS一定有ALI，但并非所有ALI均发展为ARDS， 大概只有4%的机率〔2〕。因此，对ARDS的防治策略主要是研究其早期发病机制，即A LI是如何转变为ARDS的。
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根据多发性外伤、低血容量性休克可因肠道屏障损伤导致肠内细菌或毒素易位产生败血症， 而它们与败血症同为产生ARDS的重要病因，William等〔3〕首先应用休克加LPS获得A RDS的动物模型，其实验过程是先让动物短暂失血休克，恢复24小时后再静注小剂量LPS，5 小时后静注5 U同位素碘125标记的白蛋白(125Ialbumin)，再过1小时 处死动物，通过计算肺泡灌洗液与血浆中125Ialbumin的比率得出肺的 渗透指数，结果发现 此比率上升超过了25倍，比较有力地证明此时动物已处于ARDS的状态；亦提出低血容量性休 克 可增加对内毒素损伤的敏感性。1995年Xiao等〔4〕采用短暂失血休克恢复后立即静 注低剂量内毒素并观察4小时，证实此条件下肺泡灌洗液与血浆中125Ia lbumin 的比率上升无显著差异，但其渗出指数(平均值和标准差)呈增加趋势；且出现血压偏低、CO下降明显、需较 多的静脉补液维持血压。本实验采用在短时间低血容量性休克恢复后即予静 注低剂 量内毒素，动物渐出现进行性呼吸困难，在静注LPS 4小时后，血流动力学指标与基础期相比虽未有显著差异，但成恶化的趋势；同时该组动物肺的干重/湿重比与对照组比较有显著 差异，提示开始有肺微血管渗漏，水分增多的情况；IL1β也显著升高，与 对照组比较有显著差异，而光镜下未有ARDS典型的渗出性改变。目前研究提示：当大量细菌 或毒素侵入机体，可激活吞噬细胞等炎症细胞释放大量炎性介质，其中TNF α、IL1β是最早释放的细胞因子；体外试验在LPS的刺激下，TNF α是前炎因子网络的主要启动物质，而体内试验ARDS的条件下，主要的前炎因子网络启动物 质是IL1β而非TNF，血浆中细胞因子IL1β持续升高提示ARDS患 者预后不良，有研究报道ARDS起病第7日血中的IL1β可作为预后的指标,因此 我们采用IL1β作为全身炎症反应严重程度的指标〔5,6〕。
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图1 4组动物HE染色切片光镜下的结构基本相似，大部分肺泡结构清晰，肺泡 隔无明显增宽，肺泡腔无明显渗出(HE×100)
图2、3 第3组动物的部分肺泡在光镜下可见肺泡隔有显著增宽，并有粒细胞 和红细胞渗出，但肺泡腔尚无显著渗出(HE×100，HE×400)
图4 被排除实验范围的动物，其镜下大部分肺泡主要可见毛细血管充血、肺泡有较 多红细胞渗出(HE×100)
综合William、Xiao和我们的实验资料分析，提示该实验受试动物是ARDS的早期阶段，我们 考虑是休克恢复当时，各种前炎细胞因子的合成尚未达到高峰，此时对LPS的刺激反应并非 最大。机体低血容量性休克再灌注后增强了对静注LPS的敏感性。近期的研究认为：短暂休 克机 体经历一过性反应后，继而可引起自身免疫系统的抑制，表现为血浆前炎细胞因子水平下降 〔7〕，但却伴随有以下现象：单核细胞、巨噬细胞数量的增加，且这些细胞内前炎 因子(IL1、TNF、IL6等)mRNA和核因子κB(NF κ B)的增加；中性粒细胞表面LPS结合蛋白的增加；缺血再灌注后可溶性细胞 间 粘附分子的增加；骨髓中细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子(CINC)mRNA表达增加〔 810〕；机体肠粘膜屏障和胃肠功能的损害。这些改变可能与缺血时内皮 细胞产生的 氧自由基有关〔11〕，并为下一步小剂量内毒素刺激引发的链式级联反应打下基础。
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本实验在设计上对失血致休克的控制，我们以CO 较基础降低40%、且回输后CO可恢复 为标准，排除了心源性肺水肿，因为以血压下降至某一界限为准，常会诱发左心力衰竭(心 衰)，特别是对小动物，大剂量内毒素的刺激，心衰的发生很常见。此外，尽量模拟临 床上ARDS的发病 经过，目前国内外常用ARDS模型如油酸型、静注大剂量LPS型、反复吸入LPS型、吸入烟雾型 等，很难控制诱发因素与ARDS发病经过间清晰的定量关系，如油酸型的发病机制是肺小血管 广泛化学性损伤；静注大剂量LPS型对小动物而言较难鉴别败血症休克、心衰等。
此实验动物有渗出倾向和炎症的表现，提示动物的病理生理改变可被稳定于急性肺损伤发展 为炎症肺水肿前的阶段，提示此动物模型可供研究早期急性呼吸窘迫综合征的发病机制。仍 存在的问题是：休克恢复后静注内毒素的时机，低剂量内毒素的准确剂量范围和实验观察的 时间长度等，亟需作进一步研究。
基金项目：广东省卫生厅科研基金资助项目(96Z58)
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作者简介：徐远达(1969)，男(汉族)，安徽岳西人，硕士，主治医师。曾获1998年广东省科技进步二等奖1项。
作者单位：徐远达(广州呼吸疾病研究所，广东 广州 510120)
萧正伦(广州呼吸疾病研究所，广东 广州 510120)
罗 炜(广州呼吸疾病研究所，广东 广州 510120)
黄海鹭(广州呼吸疾病研究所，广东 广州 510120)
参考文献
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摘要 目的：模拟制作一种更接近临床早期急性呼吸窘迫综合征(ARDS)病理生理过程的动物模型。方法：22只新西兰白兔分成4组：①低血容量性休克组(6只)：急性失血后休克过程 持 续1小时，以心排血量(CO)低于基础40%为准，回输放出的血并抗休克处理90分钟后再观察4 小时；②内毒素组(6只)：静注内毒素(LPS)1 μg/kg，再观察4小时；③休克加内毒 素组(6只)：急性低血容量性休克恢复90分钟后再静注LPS 1 μg/kg；④对照组(4只)只 接受相同麻醉和手术操作。静脉麻醉后，4组动物均置入3F的导管监测实验过程的血流动 力学和5F的导管在 股动脉(放血用)。动物苏醒后分基础期、低血容量性休克期、休克恢复期、静注LPS 2小 时期和静注LPS 4小时期5个阶段观察，实验结束后取肺泡灌洗液测白介素1β(IL1β)浓度和右肺干重/湿重比。结果：第1、2、4组的CO、动脉血氧分压(PaO2)、肺内分流(
s/t)在静注LPS后4小时期与基础期比较无显著差异，而第 3组的PaO2从(11.2±1.8)kPa(1 kPa=7.5 mmHg)降至(9.3±2.3)kPa，s/t从1.9%±0.5%升至2.3%±1.5%，与其它组比较虽无显著差异但呈下降趋势，且血浆IL 1β在静注LPS 2小时和4小时后持续升高，分别为(198.9±55.0)ng/L和(25 1.0±119.5)ng/L，而对照组为(71.2±12.0)ng/L(P<0.05)，肺泡灌洗液 中IL1β显著升高到(18.9±10.0)ng/L，与对照组(4.2±3.0)ng/L比 较P<0.05；此外，该组的右肺干重/湿重比为0.17±0.02，与对照组0.30±0.03 比较有显著差异(P<0.05 )。结论：此实验的第3组动物的病理生理改变稳定于急性肺损伤发展为 炎症性肺水肿前的阶段。提示此动物模型可用于研究早期急性呼吸窘迫综合征的发病机制。, http://www.100md.com
关键词：呼吸窘迫综合征，急性，兔 肺损伤，急性 血流动力学
急性呼吸窘迫综合征(ARDS)诊断率近年来有了 大幅提高；但病死率至今仍停留在40%～60%的水平，其原因之一是我们所采用的临床诊断指 标是疾病已发展到肺水肿和氧合功能明显下降的严重阶段。近年来已重视ARDS的早期诊治研 究。根据ARDS的病因分析，创伤和感染是大多数ARDS发病的主要原因(两者还可相互促进)， 因此，本实验应用新西兰白兔在急性失血休克后加静注小剂量内毒素(LPS)模拟早期ARDS 的病理生理过程〔1〕。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组：新西兰纯种白兔22只，雌雄不拘(由广州市药检所实验动物中心提供，达到4级标准)，体 重(1.75±0.25)kg，随机分成4组：1组低血容量性休克组(6只)：急性失血后休克过程 持续1小时，以心排血量(CO)低于基础40%为准，回输放出的血并抗休克处理90分钟后再 观察4小时；2组内毒素组(6只)：静注LPS 1 μg/kg，再观察4小时；3组休克加内毒 素组(6只)：急性低血容量性休克恢复90分钟后再静注LPS 1 μg/kg；4组对照组(4只)：只 接受相同的麻醉和手术置管操作，动物苏醒后观察相同时间。
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1.2 实验步骤：
1.2.1 氯胺酮0.5 mg/kg耳缘静脉注入麻醉，动物保持自主呼吸，在2% 利多卡因局麻下，用消毒器械分离一侧颈内静脉和对侧颈动脉，分别置入3 F的静脉和动脉 双腔导管(美国Arrow公司)，用热稀释法测CO，并以美国IVY监护仪连续监测体循环和肺循 环参数；分离右股动脉，置入5 F单腔动脉导管(放血用)；固定好各导管后缝合皮肤，把 动物置于特制架子(使兔子除头部外四肢活动不受限制)等待苏醒，动物苏醒后可进食、喝水 。当完全苏醒后记录基础参数：包括血压(BP)、中心静脉压(CVP)、心率(HR)、呼吸 频率(R)、体温(T)、动脉和静脉血氧分压(PaO2和PvO2)、肺内分流(
s/t)及CO等。, http://www.100md.com
1.2.2 实验过程共分5个期：①基础期：各组动物完全苏醒后。②低血 容量性休克期：第1、3组动物从股动脉导管中快速放血，放出的血在室温下用12 kU/L 浓度的肝素抗凝保存，此过程的关键是使CO低于基础40%，共维持60分钟，每15分钟 测1次CO， 必要时可继续放血以维持这个水平，休克60分钟时记录各组参数。③休克恢复期：将放出的 血在30分钟内回输给动物，再稳定60分钟后记录各组参数。④静注LPS 2小时期：第3组动物静注LPS 1 μg/kg持续30分钟，隔2小 时后记录各组参数。⑤静注LPS 4小时期：静注LPS后连续观察4小时。实验动物如果出 现 血压或CO下降，可静滴林格氏液维持，将不能纠正的动物排除在实验范围之外(大约有10只 兔出现上述情况，经分析主要原因是手术过程较长，麻醉药量大，手术后苏醒不彻底等 ，另有部分是补液量过大、回输血过快所至)。
1.2.3 静注LPS后4小时用空气栓塞处死动物，仔细分离肺脏，右肺称重 后用15 ml冰冻生理盐水做肺灌洗，灌洗重复4次，收集的肺泡灌洗液进一步做生化检查，用 酶联免疫吸附法(ELISA)测灌洗液中白介素1β(ILβ)浓度，将此 肺过夜烤干后再称重，与烤干前对 比得出肺的干重/湿重比。动物左肺经10%甲醛溶液固定后石蜡切片，HE染色做组织学检查。
, 百拇医药
1.3 统计学方法：数据用均数±标准差(x±s)表示。 采用配对t和成组t检验，P<0.05为有显著差异。
2 结 果
2.1 血流动力学变化：各组动物在基础期的血流动力学情况稳 定，如HR、BP、R、PaO2、
s/t、CO等，各组间无显著差异(P >0.05)；第1、3组动物在 休克60分钟期CO从基础值的(0.30±0.10)L/min降至(0.15±0.05)L/min，下降幅度 达40%左右，HR从(165±24)次/min升高至(210±36)次/min，R从(45±30)次/min 升高至(64±35)次/min，动物出现轻到中度的呼吸困难，PaO2从(12.4±3.7)kPa( 1 kPa=7.5 mmHg)降至(8.5±2.8)kPa，s/t则从1.7%±0.2% 升至3.2%±1.6%；第1、3组动物休克60分钟期各项血流动力学指标与基础期相比均有 显著差异(P均<0.05)；当放出的血缓慢回输进入休克恢复期后，上述各项指标均有 改善并接近基础期的水平，与基础期相比无显著差异(P>0.05)；第2、4组动物在 这期间各项血流动力学指标均较平稳，各期比较无显著性差异(P>0.05)。接着第2 、3组动物予LPS 1 μg/kg静注，开始时第2组动物的全身反应较强烈，出现一过性低血压， 呼吸、心率加快，较烦躁，部分动物体温增加了2 ℃，约1小时后上述全身症状渐有缓 解， 静注LPS后2小时和4小时的血流动力学指标与基础期比较无显著差异(P>0.05)；而第 3组动物经历了低血容量性休克后，在开始静注LPS时并无显著生理反应，但随着时间推移， 大多数动物逐渐出现呼吸频率增快，静注LPS 4小时后PaO2从(11.2±1.8)kPa降 至(9.3±2.3)kPa，s/t从1.9%±0.5%升至2.3%±1.5%， 与第1、2、4组同期比较虽无显著差异(P>0.05)，但有明显恶化趋势(表1)。, 百拇医药
2.2 4组动物血浆IL1β在各期的动态变化：第1、3组在 低血容量性 休克60分钟期血浆IL1β均一过性显著升高，与基础期比较有显著差异，休 克恢复后逐渐 回落正常，但第3组在静注LPS 2小时和4小时后再次持续升高，与各组比较有显著差异( P<0.05，表2)。
2.3 右肺干重/湿重比和肺泡灌洗液中IL1β浓度 测定结果见表3。第3组动物的肺泡灌洗液中IL1β显著升高，与对照组 相 比P<0.05；此外该组动物的右肺干重/湿重比与对照组比较有显著差异(P<0 .05)。
2.4 肺组织光镜检查：4组动物HE染色切片光镜下的结构基本相似，大 部分肺泡结构清晰，肺泡隔无明显增宽，肺泡腔无明显渗出(图1)。但第3组动物的部分肺泡在光镜下可见肺泡隔有显著增宽，并有粒细胞和红细胞的渗出，但肺泡腔尚无显著渗 出(图2，3)。由于血压或CO不能维持而被排除实验范围的动物，其镜下大部分肺泡主 要可见毛细血管充血、肺泡有较多红细胞渗出(图4)，结合症状和体征考虑呈急性心源性肺 水肿的改变。 表1 4组动物实验过程中血流动力学变化((x±s)
, 百拇医药
组别
动物数
(只)
PaO2(kPa)
基础期
低血容量性休克期
休克恢复期
静注LPS 2小时期
静注LPS 4小时期
1.低血容量性休克组
6
13.2±2.8
, 百拇医药
8.2±3.5*
10.4±2.2
10.3±2.1[ ]10.9±3.1
2.LPS组
6
11.5±4.5
12.1±3.6
12.6±2.3
10.8±1.7
11.3±2.0
3.休克加LPS组
6
, 百拇医药
12.4±3.7
8.5±2.8*
11.2±1.8
10.7±1.6
9.3 ±2.3
4.对照组
4
12.1±3.2
12.3±2.4
12.2±1.8
12.0±1.6
11.6±2.2
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组别
动物数
(只)
s/t (%)基础期
低血容量性休克期
休克恢复期
静注LPS 2小时期
静注LPS 4小时期
, 百拇医药
1.低血容量性休克组
6
1.6±0.2
3.4±1.8*
2.1±1.0
1.9±0.6
2.0±1.1
2.LPS组
6
1.9±0.3
1.8±0.2
1.7±0.2
, 百拇医药
2.2±0.1
1.9±0.2
3.休克加LPS组
6
1.7±0.2
3.2±1.6*
1.9±0.5
2.0±1.0
2.3±1.5
4.对照组
4
1.7±0.2
, http://www.100md.com
1.7±0.2
1.7±0.1
1.7±0.1
1.7±0.1
组别
动物数
(只)
R(次/min)
基础期
低血容量性休克期
休克恢复期
静注LPS 2小时期
, 百拇医药 静注LPS 4小时期
1.低血容量性休克组
6
45±30
63±33*
50±28
48±30
47±24
2.LPS组
6
45±30
45±30
, http://www.100md.com 45±30
60±20
48±26
3.休克加LPS组
6
45±30
64±35*
48±25
52±18
56±22
4.对照组
4
45±30
, 百拇医药
45±30
45±30
45±30
45±30
组别
动物数
(只)
CO(L/min)
基础期
低血容量性休克期
休克恢复期
静注LPS 2小时期
静注LPS 4小时期
, 百拇医药
1.低血容量性休克组
6
0.30±0.10
0.15±0.10*
0.35±0.10
0.30±0.10
0.28±0.20
2.LPS组
6
0.30±0.10
0.30±0.10
0.30±0.10
, 百拇医药
0.40±0.20
0.28±0.20
3.休克加LPS组
6
0.30±0.10
0.15±0.05*
0.40±0.10
0.33±0.20
0.33±0.20
4.对照组
4
0.30±0.10
, 百拇医药
0.30±0.10
0.30±0.10
0.30±0.10
0.30±0.10
注：与同组基础期比较：*P<0.05 表2 4组动物在5个不同时期血浆IL1β的动态变化(x±s)ng/L
组别
动物数(只)
基础期
低血容量性休克期
休克恢复期
静注LPS 2小时 期
, 百拇医药
静注LPS 4小时期
1.低血容量性休克组
6
80.1±25.0
380.5±289.0☆
183.7±108.0
108.5±92.0
93.7± 66.0
2.LPS组
6
106.9±56.0
106.9± 56.0
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106.9± 56.0
161.0±57.0
130.6± 56.0
3.休克加LPS组
6
100.2±48.0
213.6± 82.0☆
52.3± 21.0
198.9±55.0*
251.1±119.5*
4.对照组
, http://www.100md.com
4
75.2±13.0
64.3± 13.0
71.2± 12.0
71.2±12.0
71.2± 12.0
注：与同组基础期比较：☆P<0.05；与其它组同期比较：*P<0.05表3 4组动物右肺干重/湿重比和肺泡灌洗液中IL1β测定结果(x±s)
组别
动物
数(只)
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肺泡灌洗液IL1β
(ng/L)
右肺干重/
湿重比
1.低血容量性休克组
6
9.2± 8.0
0.25±0.01
2.LPS组
6
8.2± 4.0
0.22±0.01
, 百拇医药
3.休克加LPS组
6
18.9±10.0*
0.17±0.02*
4.对照组
4
4.2± 3.0
0.30±0.03
注：与对照组比较：*P<0.05 3 讨 论
ARDS的发病机制错综复杂， 目前认为重症感染、创伤、休克时，在内毒素(包括肠屏障功能受损后继发的肠道内生菌 和毒素)移位作用下，肺泡单核巨噬细胞和分叶核粒细胞最早产生肿瘤坏死 因子(TNFα)和IL1β，启动了炎症的级联反应(Cascade )， 直接损害肺部引起ARDS的只占少数。近年来提出急性肺损伤(ALI)是ARDS的早期阶段,ALI 包括在全身炎症反应综合征(SIRS)中〔1〕。1994年欧美ARDS专家协调会议提出这 样 一个观点：ARDS是ALI发展最严重的阶段，ARDS一定有ALI，但并非所有ALI均发展为ARDS， 大概只有4%的机率〔2〕。因此，对ARDS的防治策略主要是研究其早期发病机制，即A LI是如何转变为ARDS的。
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根据多发性外伤、低血容量性休克可因肠道屏障损伤导致肠内细菌或毒素易位产生败血症， 而它们与败血症同为产生ARDS的重要病因，William等〔3〕首先应用休克加LPS获得A RDS的动物模型，其实验过程是先让动物短暂失血休克，恢复24小时后再静注小剂量LPS，5 小时后静注5 U同位素碘125标记的白蛋白(125Ialbumin)，再过1小时 处死动物，通过计算肺泡灌洗液与血浆中125Ialbumin的比率得出肺的 渗透指数，结果发现 此比率上升超过了25倍，比较有力地证明此时动物已处于ARDS的状态；亦提出低血容量性休 克 可增加对内毒素损伤的敏感性。1995年Xiao等〔4〕采用短暂失血休克恢复后立即静 注低剂量内毒素并观察4小时，证实此条件下肺泡灌洗液与血浆中125Ia lbumin 的比率上升无显著差异，但其渗出指数(平均值和标准差)呈增加趋势；且出现血压偏低、CO下降明显、需较 多的静脉补液维持血压。本实验采用在短时间低血容量性休克恢复后即予静 注低剂 量内毒素，动物渐出现进行性呼吸困难，在静注LPS 4小时后，血流动力学指标与基础期相比虽未有显著差异，但成恶化的趋势；同时该组动物肺的干重/湿重比与对照组比较有显著 差异，提示开始有肺微血管渗漏，水分增多的情况；IL1β也显著升高，与 对照组比较有显著差异，而光镜下未有ARDS典型的渗出性改变。目前研究提示：当大量细菌 或毒素侵入机体，可激活吞噬细胞等炎症细胞释放大量炎性介质，其中TNF α、IL1β是最早释放的细胞因子；体外试验在LPS的刺激下，TNF α是前炎因子网络的主要启动物质，而体内试验ARDS的条件下，主要的前炎因子网络启动物 质是IL1β而非TNF，血浆中细胞因子IL1β持续升高提示ARDS患 者预后不良，有研究报道ARDS起病第7日血中的IL1β可作为预后的指标,因此 我们采用IL1β作为全身炎症反应严重程度的指标〔5,6〕。
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图1 4组动物HE染色切片光镜下的结构基本相似，大部分肺泡结构清晰，肺泡 隔无明显增宽，肺泡腔无明显渗出(HE×100)
图2、3 第3组动物的部分肺泡在光镜下可见肺泡隔有显著增宽，并有粒细胞 和红细胞渗出，但肺泡腔尚无显著渗出(HE×100，HE×400)
图4 被排除实验范围的动物，其镜下大部分肺泡主要可见毛细血管充血、肺泡有较 多红细胞渗出(HE×100)
综合William、Xiao和我们的实验资料分析，提示该实验受试动物是ARDS的早期阶段，我们 考虑是休克恢复当时，各种前炎细胞因子的合成尚未达到高峰，此时对LPS的刺激反应并非 最大。机体低血容量性休克再灌注后增强了对静注LPS的敏感性。近期的研究认为：短暂休 克机 体经历一过性反应后，继而可引起自身免疫系统的抑制，表现为血浆前炎细胞因子水平下降 〔7〕，但却伴随有以下现象：单核细胞、巨噬细胞数量的增加，且这些细胞内前炎 因子(IL1、TNF、IL6等)mRNA和核因子κB(NF κ B)的增加；中性粒细胞表面LPS结合蛋白的增加；缺血再灌注后可溶性细胞 间 粘附分子的增加；骨髓中细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子(CINC)mRNA表达增加〔 810〕；机体肠粘膜屏障和胃肠功能的损害。这些改变可能与缺血时内皮 细胞产生的 氧自由基有关〔11〕，并为下一步小剂量内毒素刺激引发的链式级联反应打下基础。
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本实验在设计上对失血致休克的控制，我们以CO 较基础降低40%、且回输后CO可恢复 为标准，排除了心源性肺水肿，因为以血压下降至某一界限为准，常会诱发左心力衰竭(心 衰)，特别是对小动物，大剂量内毒素的刺激，心衰的发生很常见。此外，尽量模拟临 床上ARDS的发病 经过，目前国内外常用ARDS模型如油酸型、静注大剂量LPS型、反复吸入LPS型、吸入烟雾型 等，很难控制诱发因素与ARDS发病经过间清晰的定量关系，如油酸型的发病机制是肺小血管 广泛化学性损伤；静注大剂量LPS型对小动物而言较难鉴别败血症休克、心衰等。
此实验动物有渗出倾向和炎症的表现，提示动物的病理生理改变可被稳定于急性肺损伤发展 为炎症肺水肿前的阶段，提示此动物模型可供研究早期急性呼吸窘迫综合征的发病机制。仍 存在的问题是：休克恢复后静注内毒素的时机，低剂量内毒素的准确剂量范围和实验观察的 时间长度等，亟需作进一步研究。
基金项目：广东省卫生厅科研基金资助项目(96Z58)
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作者简介：徐远达(1969)，男(汉族)，安徽岳西人，硕士，主治医师。曾获1998年广东省科技进步二等奖1项。
作者单位：徐远达(广州呼吸疾病研究所，广东 广州 510120)
萧正伦(广州呼吸疾病研究所，广东 广州 510120)
罗 炜(广州呼吸疾病研究所，广东 广州 510120)
黄海鹭(广州呼吸疾病研究所，广东 广州 510120)
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