保护性免疫血清及单克隆抗体筛选日本血吸虫成虫cDNA文库
沈际佳 蒋作君 余新炳 汪学龙 吴忠道
摘 要：目的 为寻找有效的抗日本血吸虫感染疫苗候选抗原分子。方法 用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，再用同法免疫鼠脾细胞制备的单克隆抗体对所获阳性克隆进行再筛选，并对免疫筛选的阳性克隆的cDNA插入片段进行PCR扩增。结果 兔免疫血清确定12个阳性克隆，其中6个克隆与2株以上的单抗呈阳性反应：PCR扩增cDNA插入片段大小约400bp～1.4kb左右。结论 已筛选到与致弱尾蚴免疫兔血清及同法免疫制备单抗产生特异反应的阳性克隆，获得一批编码可能具有保护性作用的日本血吸虫抗原的基因片段。
关键词：日本血吸虫 cDNA文库 免疫学筛选
, 百拇医药
日本血吸虫病是严重的人兽共患寄生虫病，发展血吸虫病疫苗已成为血吸虫病防治工作的重要措施之一，筛选保护性抗原是获得有效疫苗分子的主要途径。为寻找有效的日本血吸虫病疫苗候选抗原分子。我们用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清及紫外线照射致弱尾蚴免疫鼠提供脾细胞制备的单克隆抗体(单抗)为探针，筛选了日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA表达文库，获得12个阳性反应克隆，并对其中一些克隆进行PCR等鉴定，结果表明已获得一批可能编码具有保护性作用的日本血吸虫抗原基因片段，为研制日本血吸虫分子疫苗奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 抗体探针的制备 紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清及单克隆抗体腹水由本室制备，方法见文献[1]。免疫兔血清和单抗腹水均经Y1090大肠杆菌裂解液3次预吸收，以去除其大肠杆菌抗体。
1.2 cDNA文库的免疫学筛选 日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA表达文库由南京医科大学寄生虫学教研室提供使用。筛选方法参照文献[2，3]稍加修改。取cDNA库7μl加入700μl Y 1090大肠杆菌，再将其加入7ml琼脂中，迅速混匀后铺于LB平板，42℃倒置培养，再复盖经10mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浸泡并晾干的NC膜(浙江台州)，37℃继续培养，位置标记后取膜置PBS洗2次，封闭液封闭，在1∶50稀释的兔血清或1∶200稀释腹水单抗中4℃过夜，PBS洗3次后分别加入1∶100稀释辣根过氧化物酶标记抗兔IgG(华美生物工程公司)或1∶200稀释辣根过氧化物酶标记抗鼠IgS(Sigma)，4℃ 5～6h，PBS洗3次，TBS洗1次后，4-氯-1-萘酚底物显色10～15min后中止反应。根据NC膜上阳性反应环位置，挑取LB平板上相应噬菌斑，加入1ml噬菌体缓冲液，再加2滴氯仿，4℃保存。初筛阳性克隆稀释后再次复筛2～3次，直至NC膜全部斑点均为阳性反应为止。每次免疫学筛选均取日本血吸虫成虫粗抗原和Y 1090大肠杆菌裂解液作阳性和阴性对照。
, 百拇医药
1.3 阳性克隆插入基因片段的PCR扩增 扩增阳性克隆噬菌体，PEG-NaCl沉淀后，10 000g离心15min，沉淀用去离子双蒸水悬浮，100℃水浴5min作为PCR模板。以cDNA插入片段两侧的gt11部分序列为引物(上海生物工程有限公司合成)。引物序列如下，5端引物：5(GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG)3，3端引物：5(TTGACACCAGGCCAACTGGTAATG)3。Tag DNA聚合酶为Genda Co.Canada产品。PCR反应条件为96℃预变性6min，94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min 30sec，35个循环后72℃保温7min.1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增产物。
1.4 α互补重组噬菌体鉴定 方法见文献[4]，大致与筛选cDNA文库相似。在顶琼脂中还加入20mg/ml的5-溴-4 氯-3 吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal，Promega)40μl和IPTG 4μl 37℃培养4～6h，凡蓝色噬斑为非重组克隆，白色为重组克隆。
, 百拇医药
2 结果
2.1 兔免疫血清的筛选 以直径为15cm平板含约近6～8×104个噬斑的密度进行初筛，共筛选了约110μl cDNA文库液约11～13万个重组噬斑，获16个初筛阳性克隆，每一克隆经2～3次复筛，直至全板反应阳性，见图1。共获12个持续阳性反应克隆。
图1 日本血吸虫cDNA文库免疫学筛选阳性反应结果
Fig.1 Immunoscreening of S.Japonicum adult cDNA library
2.2 单克隆抗体筛选 以4株用紫外线照射致弱尾蚴免疫鼠提供的脾细胞制备的单抗，筛选上述免疫血清筛选的阳性克隆，有7个克隆与2株以上的单抗起阳性反应，2个克隆与单抗无反应。结果见表1。
表1 免疫血清和单抗筛选日本血吸虫cDNA文库
, 百拇医药
Table 1 Screening of S.japonicum cDNA library using protective sera and McAb
阳性克隆编号
筛选探针
A1
A4
A8
B5
B8
S1
S3
S5
08
, http://www.100md.com
18
21
23
免疫血清
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单抗IG3
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单抗IF11
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单抗ⅡF2
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单抗ⅢB3
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2.3 PCR初步鉴定结果 选择7个阳性克隆中有6个扩增出特异条带，插入的cDNA片段的大小约400bp～1.4kb左右。经加入X-gal筛选鉴定，6个PCR扩增阳性的克隆为白色反应，表明其为插入有血吸虫基因片段的重组子，而经PCR扩增未见有特异性扩增产物的一株为蓝色斑，为非重组克隆，见图2。
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图2 日本血吸虫cDNA文库阳性克隆PCR扩增
Fig.2 Identification of S.japonicum cDNA library positive clones by PCR
3 讨论
用具有保护能力的血清或有被动保护性作用的单抗筛选cDNA文库中阳性反应克隆，从理论上讲，任何一个这样的克隆都能被认为是编码一种宿主保护性抗原的克隆。在疟原虫研究方面，临床上或功能上确定的保护性血清，已被用来作为确定能在人体内介导保护性免疫反应的重要抗原的工具[5]。而照射致弱血吸虫尾蚴或童虫诱异的免疫保护，大量实验室和疫区现场的动物试验已肯定了其免疫接种的效果[6，7]。我们用具有保护力的经紫外线致弱日本血吸虫尾蚴免疫的兔血清以及针对童虫膜抗原的并证实具有被动保护性作用的单抗(待发表资料)，筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，共获得12个与免疫血清呈阳性反应的克隆，其中7个克隆与2株以上的单抗亦呈现阳性反应。结果表明获得一批编码可能具有保护性作用的日本血吸虫抗原的基因片段。其中未能扩增出插入片段的克隆，X-gal筛选反应为蓝斑，表明其为非重组克隆，可能是在噬菌体保存、扩增等过程中，其插入片段丢失所致。
, 百拇医药
我们用业已证实具有保护性作用的单抗复筛免疫血清阳性反应克隆，一是节省了大量的筛选工作量，二是用前述方法制备的单抗再次筛选，更确定所筛选的阳性克隆为编码具有保护性抗原的基因克隆。我们用单抗筛选的结果与疟原虫研究的结果相似，即1株单抗可与多个cDNA表达产物产生阳性反应，反之亦然。可能是插入基因片段的表达产物具有数个抗原决定簇所致[8]。用保护性免疫血清和单抗筛选日本血吸虫cDNA文库，获得一批可能编码日本血吸虫保护性抗原的基因，该批基因的测序、克隆表达及表达产物的鉴定正在进行之中。
(本实验在广州中山医科大学寄生虫学教研室完成，对该室所有为本研究提供指导和帮助的老师表示感谢。南京医科大学寄生虫学教研室提供日本血吸虫文库的使用，一并致谢!)
国家自然科学基金、安徽省自然科学基金资助项目(No 39570646、96-医-28)
沈际佳(安徽医科大学寄生虫学教研室 合肥，230032)
, 百拇医药
蒋作君(安徽医科大学寄生虫学教研室 合肥，230032)
余新炳(中山医科大学寄生虫学教研室)
汪学龙(安徽医科大学寄生虫学教研室 合肥，230032)
吴忠道(中山医科大学寄生虫学教研室)
参考文献
1，沈际佳，等.抗日本血吸虫童虫表膜单克隆抗体的制备[J].安徽医科大学学报，1998，33(1)：4.
2，陈淑贞，等.日本血吸虫成虫cDNA库的构建、免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定[J].实用寄生虫病杂志，1993，1(1)：1.
3，Knight M.et al.Adult Schistosome cDNA Libraries as a source of antigens for the study of experimental and human schistosomiasis[J].Molecular and Biochemical Parasitology.1986，18：235.
, 百拇医药
4，姜泊，等.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社.1996，20.
5，Lobo C，A.et al.Novel proteins of Plasmodium falciparum identified by differential immunuscreening using immune and patient sera[J].Infect Immun，1994，62：651.
6，Shi Y.E.et al.Schistosoma japonicum：an ultraviolet attenuated cercarial vaccine applicable in the field for water buffaloes[J].Exp.Parasitol，1990，71：100.
7，Richter D.et al.Candidate vaccine antigens identified by antibodies from mice vaccinated with 15-or 50 Kilorad-irradiated cercariae of Schistosoma mansoni[J].Infect Immun，1993，61：146.
8，王燕妮，等.免疫筛选恶性疟原虫cDNA克隆[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997，15：193., 百拇医药
摘 要：目的 为寻找有效的抗日本血吸虫感染疫苗候选抗原分子。方法 用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，再用同法免疫鼠脾细胞制备的单克隆抗体对所获阳性克隆进行再筛选，并对免疫筛选的阳性克隆的cDNA插入片段进行PCR扩增。结果 兔免疫血清确定12个阳性克隆，其中6个克隆与2株以上的单抗呈阳性反应：PCR扩增cDNA插入片段大小约400bp～1.4kb左右。结论 已筛选到与致弱尾蚴免疫兔血清及同法免疫制备单抗产生特异反应的阳性克隆，获得一批编码可能具有保护性作用的日本血吸虫抗原的基因片段。
关键词：日本血吸虫 cDNA文库 免疫学筛选
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日本血吸虫病是严重的人兽共患寄生虫病，发展血吸虫病疫苗已成为血吸虫病防治工作的重要措施之一，筛选保护性抗原是获得有效疫苗分子的主要途径。为寻找有效的日本血吸虫病疫苗候选抗原分子。我们用紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清及紫外线照射致弱尾蚴免疫鼠提供脾细胞制备的单克隆抗体(单抗)为探针，筛选了日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA表达文库，获得12个阳性反应克隆，并对其中一些克隆进行PCR等鉴定，结果表明已获得一批可能编码具有保护性作用的日本血吸虫抗原基因片段，为研制日本血吸虫分子疫苗奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 抗体探针的制备 紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清及单克隆抗体腹水由本室制备，方法见文献[1]。免疫兔血清和单抗腹水均经Y1090大肠杆菌裂解液3次预吸收，以去除其大肠杆菌抗体。
1.2 cDNA文库的免疫学筛选 日本血吸虫(中国大陆株)成虫cDNA表达文库由南京医科大学寄生虫学教研室提供使用。筛选方法参照文献[2，3]稍加修改。取cDNA库7μl加入700μl Y 1090大肠杆菌，再将其加入7ml琼脂中，迅速混匀后铺于LB平板，42℃倒置培养，再复盖经10mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)浸泡并晾干的NC膜(浙江台州)，37℃继续培养，位置标记后取膜置PBS洗2次，封闭液封闭，在1∶50稀释的兔血清或1∶200稀释腹水单抗中4℃过夜，PBS洗3次后分别加入1∶100稀释辣根过氧化物酶标记抗兔IgG(华美生物工程公司)或1∶200稀释辣根过氧化物酶标记抗鼠IgS(Sigma)，4℃ 5～6h，PBS洗3次，TBS洗1次后，4-氯-1-萘酚底物显色10～15min后中止反应。根据NC膜上阳性反应环位置，挑取LB平板上相应噬菌斑，加入1ml噬菌体缓冲液，再加2滴氯仿，4℃保存。初筛阳性克隆稀释后再次复筛2～3次，直至NC膜全部斑点均为阳性反应为止。每次免疫学筛选均取日本血吸虫成虫粗抗原和Y 1090大肠杆菌裂解液作阳性和阴性对照。
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1.3 阳性克隆插入基因片段的PCR扩增 扩增阳性克隆噬菌体，PEG-NaCl沉淀后，10 000g离心15min，沉淀用去离子双蒸水悬浮，100℃水浴5min作为PCR模板。以cDNA插入片段两侧的gt11部分序列为引物(上海生物工程有限公司合成)。引物序列如下，5端引物：5(GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG)3，3端引物：5(TTGACACCAGGCCAACTGGTAATG)3。Tag DNA聚合酶为Genda Co.Canada产品。PCR反应条件为96℃预变性6min，94℃变性45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min 30sec，35个循环后72℃保温7min.1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察扩增产物。
1.4 α互补重组噬菌体鉴定 方法见文献[4]，大致与筛选cDNA文库相似。在顶琼脂中还加入20mg/ml的5-溴-4 氯-3 吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal，Promega)40μl和IPTG 4μl 37℃培养4～6h，凡蓝色噬斑为非重组克隆，白色为重组克隆。
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2 结果
2.1 兔免疫血清的筛选 以直径为15cm平板含约近6～8×104个噬斑的密度进行初筛，共筛选了约110μl cDNA文库液约11～13万个重组噬斑，获16个初筛阳性克隆，每一克隆经2～3次复筛，直至全板反应阳性，见图1。共获12个持续阳性反应克隆。
图1 日本血吸虫cDNA文库免疫学筛选阳性反应结果
Fig.1 Immunoscreening of S.Japonicum adult cDNA library
2.2 单克隆抗体筛选 以4株用紫外线照射致弱尾蚴免疫鼠提供的脾细胞制备的单抗，筛选上述免疫血清筛选的阳性克隆，有7个克隆与2株以上的单抗起阳性反应，2个克隆与单抗无反应。结果见表1。
表1 免疫血清和单抗筛选日本血吸虫cDNA文库
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Table 1 Screening of S.japonicum cDNA library using protective sera and McAb
阳性克隆编号
筛选探针
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2.3 PCR初步鉴定结果 选择7个阳性克隆中有6个扩增出特异条带，插入的cDNA片段的大小约400bp～1.4kb左右。经加入X-gal筛选鉴定，6个PCR扩增阳性的克隆为白色反应，表明其为插入有血吸虫基因片段的重组子，而经PCR扩增未见有特异性扩增产物的一株为蓝色斑，为非重组克隆，见图2。
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图2 日本血吸虫cDNA文库阳性克隆PCR扩增
Fig.2 Identification of S.japonicum cDNA library positive clones by PCR
3 讨论
用具有保护能力的血清或有被动保护性作用的单抗筛选cDNA文库中阳性反应克隆，从理论上讲，任何一个这样的克隆都能被认为是编码一种宿主保护性抗原的克隆。在疟原虫研究方面，临床上或功能上确定的保护性血清，已被用来作为确定能在人体内介导保护性免疫反应的重要抗原的工具[5]。而照射致弱血吸虫尾蚴或童虫诱异的免疫保护，大量实验室和疫区现场的动物试验已肯定了其免疫接种的效果[6，7]。我们用具有保护力的经紫外线致弱日本血吸虫尾蚴免疫的兔血清以及针对童虫膜抗原的并证实具有被动保护性作用的单抗(待发表资料)，筛选日本血吸虫成虫cDNA文库，共获得12个与免疫血清呈阳性反应的克隆，其中7个克隆与2株以上的单抗亦呈现阳性反应。结果表明获得一批编码可能具有保护性作用的日本血吸虫抗原的基因片段。其中未能扩增出插入片段的克隆，X-gal筛选反应为蓝斑，表明其为非重组克隆，可能是在噬菌体保存、扩增等过程中，其插入片段丢失所致。
, 百拇医药
我们用业已证实具有保护性作用的单抗复筛免疫血清阳性反应克隆，一是节省了大量的筛选工作量，二是用前述方法制备的单抗再次筛选，更确定所筛选的阳性克隆为编码具有保护性抗原的基因克隆。我们用单抗筛选的结果与疟原虫研究的结果相似，即1株单抗可与多个cDNA表达产物产生阳性反应，反之亦然。可能是插入基因片段的表达产物具有数个抗原决定簇所致[8]。用保护性免疫血清和单抗筛选日本血吸虫cDNA文库，获得一批可能编码日本血吸虫保护性抗原的基因，该批基因的测序、克隆表达及表达产物的鉴定正在进行之中。
(本实验在广州中山医科大学寄生虫学教研室完成，对该室所有为本研究提供指导和帮助的老师表示感谢。南京医科大学寄生虫学教研室提供日本血吸虫文库的使用，一并致谢!)
国家自然科学基金、安徽省自然科学基金资助项目(No 39570646、96-医-28)
沈际佳(安徽医科大学寄生虫学教研室 合肥，230032)
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蒋作君(安徽医科大学寄生虫学教研室 合肥，230032)
余新炳(中山医科大学寄生虫学教研室)
汪学龙(安徽医科大学寄生虫学教研室 合肥，230032)
吴忠道(中山医科大学寄生虫学教研室)
参考文献
1，沈际佳，等.抗日本血吸虫童虫表膜单克隆抗体的制备[J].安徽医科大学学报，1998，33(1)：4.
2，陈淑贞，等.日本血吸虫成虫cDNA库的构建、免疫学筛选及阳性克隆的初步鉴定[J].实用寄生虫病杂志，1993，1(1)：1.
3，Knight M.et al.Adult Schistosome cDNA Libraries as a source of antigens for the study of experimental and human schistosomiasis[J].Molecular and Biochemical Parasitology.1986，18：235.
, 百拇医药
4，姜泊，等.分子生物学常用实验方法[M].北京：人民军医出版社.1996，20.
5，Lobo C，A.et al.Novel proteins of Plasmodium falciparum identified by differential immunuscreening using immune and patient sera[J].Infect Immun，1994，62：651.
6，Shi Y.E.et al.Schistosoma japonicum：an ultraviolet attenuated cercarial vaccine applicable in the field for water buffaloes[J].Exp.Parasitol，1990，71：100.
7，Richter D.et al.Candidate vaccine antigens identified by antibodies from mice vaccinated with 15-or 50 Kilorad-irradiated cercariae of Schistosoma mansoni[J].Infect Immun，1993，61：146.
8，王燕妮，等.免疫筛选恶性疟原虫cDNA克隆[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1997，15：193., 百拇医药