青藤碱对豚鼠单个心室肌细胞膜钠、钙离子通道的阻滞作用
丁仲如 李庚山 蒋锡嘉 许家俐 王腾
摘 要：应用膜片钳全细胞记录技术研究青藤碱(Sin)对酶解分离的豚鼠单个心室肌细胞膜钠离子电流(INa)、L型钙电流(ICa-L)的影响。发现1，5，10 μmol/L的Sin分别使INa峰值(INamax)较用药前下降23.2%、36.1%和60%(n=8，P均<0.05)；使ICa-L峰值(ICa-Lmax)较用药前下降了12.8%，35.9%和46.9%(n=8，P均<0.01)。Sin使INa及ICa-L电流-电压曲线上移，但不使其峰值电位偏移。Sin还浓度依赖性减慢钠通道灭活后恢复过程。当刺激频率分别为0.5,1,2 Hz时，5 μmol/L Sin使INamax较用药前分别下降了36.1%、41.5%和48.0%(n=8，P均<0.01)。结果表明，Sin对INa具浓度和频率依赖性阻滞作用，可能作用于其失活状态；Sin对ICa-L具浓度依赖性阻滞作用。这可能为其抗心律失常的重要机制。
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关键词：青藤碱 膜片钳 钠通道 L型钙通道 豚鼠 心肌细胞
动物实验证明青藤碱(sinomenine,Sin)能降低心肌兴奋性、自律性、延长动作电位时程及有效不应期，并可降低动作电位幅度及0相去极速率，因而具有良好的抗心律失常作用[1，2]。本实验采用膜片钳全细胞记录技术观察Sin对酶解分离的豚鼠单个心室肌细胞膜快钠电流(INa)以及L型钙电流(ICa-L)的影响，旨在从离子水平阐明其抗心律失常的机制。
1 材料与方法
1.1 单个心室肌细胞的制备 选取280～400 g健康豚鼠，击昏后迅速开胸取出心脏，连接于改良的Langendroff装量灌流，双酶酶解法(胶原酶I+蛋白酶)分离出具电生理活性的单个心室肌细胞，置于4℃ KB液中贮存备用。具体分离方法及溶液组成见文献[3]。
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1.2 膜片钳全细胞记录方法 微电极采用微电极拉制器(PP-83，日本光电公司)双步拉制而成。尖端1～2 μm，充填电极内液后电阻2～4 MΩ。电极内液成分(mmol/L)：KCl 140，MgCl2 0.5，EGTA 10，HEPES 10，以KOH调节pH值为7.2。滴数滴心肌细胞悬液于自制灌流槽中，置于倒置生物显微镜下，细胞附壁后给予100% O2饱和后的细胞外液灌流，冲去细胞残片。选取表面光洁，横纹清晰的心肌细胞，按Hamill等[4]的方法行膜片钳全细胞记录。记录INa的细胞外液成分(mmol/L)：氯化胆碱100，NaCl 150，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgCl2 2.0，HEPES 5，葡萄糖10，用NaOH调节pH值至7.4。记录ICa-L细胞外液为正常台氏液，成分(mmol/L)：NaCl 140,KCl 5.6,CaCl2 1.8,NaH2PO4 0.25，HEPES 5，葡萄糖10，以NaOH调节pH值至7.35。膜片钳记录系统由PCLAMP软件包(5.51版本，美国Axon公司)及486型计算机构成，数据经计算机自动分析后贮存于硬盘中。
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1.3 药品及试剂 胶原酶I、蛋白酶、EGTA、HEPES、氯化胆碱均为Sigma公司产品，余为国产分析纯，溶液由四蒸水配制。Sin为白粉末状结晶，由湖南正清新药开发中心提供，以细胞外液溶解配制成所需浓度备用。
1.4 刺激方案及实验步骤
1.4.1 Sin对INa及ICa-L的影响 ①维持电压(holding potential,HP)-80 mV，指令电压(command potentials,CP)-70～70 mV，步长10 mV、钳制时间(clamp time,CT) 40 ms、刺激频率0.5 Hz，引出INa。②HP-40 mV,CP-30～+60 mV，步长10 mV、CT 250 ms、刺激频率1 Hz引出ICa-L。此时HP-40 mV可使INa处于完全失活状态，ICa-L于短期内达峰值，而延迟整流钾电流(IK)及内向整流钾电流(IK1)激活时间均较长，且与ICa-L峰值比较数值均较小，故测定ICa-L峰值(ICa-Lmax)可基本排除IK1、Ik的影响。以CP与相对应的INamax和ICa-Lmax作用分别得到INa、ICa-L的电流-电压(I-V)曲线。以含Sin 1，5，10 μmol/L细胞外液依次灌流5 min，每次灌流后重复上述实验，观察用药前及不同浓度Sin灌流后CP-30 mV INamax及CP 10 mV时ICa-Lmax，并计算抑制率。
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抑制率=[I用药前-I用药后]/I用药前×100%。
1.4.2 双脉冲刺激法观察Sin对INa灭活后恢复过程的影响 第一脉冲P1：HP-80 mV、CP-30 mV，CT 50 ms、回至 HP后于不同时间间歇t(P1P2)后发出P2，其条件同P1。此时P1使INa激活后迅速灭活，P2测试不同时间间歇t(P1P2)后INa恢复程度，以INa(P2)/INa(P1)表示，它与相应的t(P1P2)作图即为INa灭活后恢复曲线，以含Sin 1，10 μmol/L细胞外液灌注5 min后，分别重复上述试验。
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1.4.3 不同刺激频率对INa的影响 HP-80 mV,CP-70～70 mV,CT 40 ms、步长10 mV、刺激频率0.5，1，2 Hz分别引出INa，5 μmol/L Sin的细胞外液灌流5 min后，重复上述实验，比较用药前后不同频率及CP-30 mV时INamax，并计算每种频率下INamax用药后较用药前的抑制率。
1.5 统计学分析 数据以X±s表示，用药前后比较用配伍设计多样本间方差分析(q检验)。不同刺激频率后Sin对INamax的影响采用两因素多水平设计的方差分析。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 sin对INa及ICa-L的影响 Sin对INa、ICa-L均具浓度依赖性阻滞作用，使二者I-V曲线上移，但不改变峰电位(INa-30 mV,ICa-L+10 mV)、激活电位(INa-50 mV，ICa-L-20 mV)，反转电位(INa+40 mV，ICa-L+50 mV)见图1，2。Sin灌注前后INamax、ICa-Lmax见表1。灌注前后及Sin不同浓度组之间INamax、ICa-Lmax差异均具显著性(P均<0.05)，即Sin对INamax及ICa-Lmax具浓度依赖性抑制作用。
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图1 不同浓度的Sin对INa I-V曲线的影响
图2 不同浓度的Sin对ICa-L I-V曲线的影响
2.2 Sin对INa灭活后恢复过程的影响 见图3。使INa灭活后恢复曲线浓度依赖性右移，用药后INa(P2)要恢复至某一水平(如INaP1的60%)所需时间间歇更长，即Sin对INa灭活后恢复过程具延迟作用。
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图3 不同浓度的Sin对INa灭活后恢复曲线的影响
表1 不同浓度Sin对INamax和ICa-Lmax
的影响(X±s，n=8)
类别
INamax(nA)
ICa-Lmax(pA)
用药前
7.277±0.902
1014.3±152.4
1 μmol/l
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5.580±0.864(23.3%)*
884.9±135.2(12.8%)**
5 μmol/l
4.468±0.427(36.1%)**
646.8±99.2(35.9)**
10 μmol/l
2.910±0.662(60.0%)*
538.0±81.3(46.9%)**
注：n为实验次数。与用药前自身比较，* P<0.05，** P<0.01。括号中数据为抑制率
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2.3 刺激频率对INa的影响 见表2。两因素方差分析表明频率、药物因素对INamax影响均具显著性差异(P<0.05)。5 μmol/L Sin灌注时，刺激频率0.5，1，2 Hz时INa抑制率分别为36.1%±3.2%、41.5%±3.5%、48.0%±3.4%，即Sin对INa具频率依赖性阻滞作用。
表2 5 μmol/L Sin灌注时不同刺激频率对INamax
的影响(X±s，n=8，nA)
刺激
频率
INamax
用药前 用药后 抑制率(%)
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0.5 Hz
7.277±0.902
4.468±0.427
36.1±3.2
1 Hz
6.932±0.845
4.056±0.740*
41.5±3.5*
2 Hz
6.820±0.804
3.490±0.673**
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48.0±3.4**△
注：n为实验次数。与刺激频率0.5 Hz比较，* P<0.05，** P<0.01。与刺激频率1 Hz比较，△P<0.05
3 讨论
Sin对INa明显的浓度依赖性阻滞作用能较好地解释其在多细胞心肌标本中明显降低动作电位幅度、0相去极速率、兴奋性和传导性等现象。其临床镇痛局麻效应[5]可由神经根及神经纤维INa阻滞作用解释。Sin使INa和ICa-L I-V曲线上移而不改变其激活、峰值、反转电位，揭示Sin于不同膜电位时均对二者具抑制作用且抑制程度相似。受体调节学说认为钠通道具静息(R)、激动(A)和失活(I)三种状态。刺激频率越快，处于激活态和失活态钠通道增多而静息态相对减少。因此作用于激活态或失活态的药物随刺激频率加快与通道结合率上升，阻滞作用加强。此即药物作用的频率依赖性或使用依赖性[6]。本实验Sin对INa具频率依赖性阻滞效应提示Sin作用于INa激活态或失活态。Sin使INa灭活后恢复过程延迟则提示Sin作用于INa的失活态。
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Sin对ICa-L的抑制作用提示Sin可能具负性变时变力效应，与先前多细胞实验结果相符[1，2]。Sin抑制ICa-L使动作电位时程具缩短倾向，与多细胞标本实验结论相反，这可能是由于Sin能同时抑制IK及IK1[7]，而后者延长动作电位时程较ICa-L缩短动作电位时程更明显的原因。综上所述，Sin对INa及ICa-L均具浓度依赖性抑制作用，并可能作用于INa的失活态。这可能为其抗心律失常作用的主要离子机制。
作者简介：丁仲如(1968— )，男(汉族)，湖北麻城人，主治医师，硕士，现在解放军第九四医院心内科(江西南昌 330002)。
作者单位：丁仲如(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
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李庚山(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
蒋锡嘉(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
许家俐(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
王腾(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
参考文献：
[1] 李朝兴，赵更生.青藤碱对异丙肾上腺素、组胺、氯化钙正性频率的影响[J].中国药理学通报，1987，3：17
[2] 李朝兴，赵更生.青藤碱对豚鼠心肌动作电位和收缩力的影响[J].药学学报，1987，22(8)：56
, 百拇医药
[3] Kazuto Y,Muneshige K,Masahiro A,et al.An improved method for isolating cardiac myocytes useful for patch clamp studies [J].Japan J Physiol,1990,40:157
[4] Hamill OP,Marty A,Neher E,et al.Improved patch clamp techinque for high resolution current recording from cells and cell free membrance patch [J].Pflugers Arch,1981,391:85
[5] 张土善.青风藤碱的药理作用.I：镇痛、消炎及急性毒理实验[J].药学学报，1961，8：7
[6] Hondegen LM,Katzung BG.Time and voltage dependant interaction of antiarrhythinic drugs with cardiac sodium channels [J].Biochem Biophys Acta,1974,427:373
[7] 黄从新，丁仲如，李庚山，等.青藤碱对豚鼠心室肌细胞钾通道的阻滞作用[J]。中国心脏起搏与心电生理杂志，1997，11(1)：36, 百拇医药
摘 要：应用膜片钳全细胞记录技术研究青藤碱(Sin)对酶解分离的豚鼠单个心室肌细胞膜钠离子电流(INa)、L型钙电流(ICa-L)的影响。发现1，5，10 μmol/L的Sin分别使INa峰值(INamax)较用药前下降23.2%、36.1%和60%(n=8，P均<0.05)；使ICa-L峰值(ICa-Lmax)较用药前下降了12.8%，35.9%和46.9%(n=8，P均<0.01)。Sin使INa及ICa-L电流-电压曲线上移，但不使其峰值电位偏移。Sin还浓度依赖性减慢钠通道灭活后恢复过程。当刺激频率分别为0.5,1,2 Hz时，5 μmol/L Sin使INamax较用药前分别下降了36.1%、41.5%和48.0%(n=8，P均<0.01)。结果表明，Sin对INa具浓度和频率依赖性阻滞作用，可能作用于其失活状态；Sin对ICa-L具浓度依赖性阻滞作用。这可能为其抗心律失常的重要机制。
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关键词：青藤碱 膜片钳 钠通道 L型钙通道 豚鼠 心肌细胞
动物实验证明青藤碱(sinomenine,Sin)能降低心肌兴奋性、自律性、延长动作电位时程及有效不应期，并可降低动作电位幅度及0相去极速率，因而具有良好的抗心律失常作用[1，2]。本实验采用膜片钳全细胞记录技术观察Sin对酶解分离的豚鼠单个心室肌细胞膜快钠电流(INa)以及L型钙电流(ICa-L)的影响，旨在从离子水平阐明其抗心律失常的机制。
1 材料与方法
1.1 单个心室肌细胞的制备 选取280～400 g健康豚鼠，击昏后迅速开胸取出心脏，连接于改良的Langendroff装量灌流，双酶酶解法(胶原酶I+蛋白酶)分离出具电生理活性的单个心室肌细胞，置于4℃ KB液中贮存备用。具体分离方法及溶液组成见文献[3]。
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1.2 膜片钳全细胞记录方法 微电极采用微电极拉制器(PP-83，日本光电公司)双步拉制而成。尖端1～2 μm，充填电极内液后电阻2～4 MΩ。电极内液成分(mmol/L)：KCl 140，MgCl2 0.5，EGTA 10，HEPES 10，以KOH调节pH值为7.2。滴数滴心肌细胞悬液于自制灌流槽中，置于倒置生物显微镜下，细胞附壁后给予100% O2饱和后的细胞外液灌流，冲去细胞残片。选取表面光洁，横纹清晰的心肌细胞，按Hamill等[4]的方法行膜片钳全细胞记录。记录INa的细胞外液成分(mmol/L)：氯化胆碱100，NaCl 150，KCl 5.4，CaCl2 1.8，MgCl2 2.0，HEPES 5，葡萄糖10，用NaOH调节pH值至7.4。记录ICa-L细胞外液为正常台氏液，成分(mmol/L)：NaCl 140,KCl 5.6,CaCl2 1.8,NaH2PO4 0.25，HEPES 5，葡萄糖10，以NaOH调节pH值至7.35。膜片钳记录系统由PCLAMP软件包(5.51版本，美国Axon公司)及486型计算机构成，数据经计算机自动分析后贮存于硬盘中。
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1.3 药品及试剂 胶原酶I、蛋白酶、EGTA、HEPES、氯化胆碱均为Sigma公司产品，余为国产分析纯，溶液由四蒸水配制。Sin为白粉末状结晶，由湖南正清新药开发中心提供，以细胞外液溶解配制成所需浓度备用。
1.4 刺激方案及实验步骤
1.4.1 Sin对INa及ICa-L的影响 ①维持电压(holding potential,HP)-80 mV，指令电压(command potentials,CP)-70～70 mV，步长10 mV、钳制时间(clamp time,CT) 40 ms、刺激频率0.5 Hz，引出INa。②HP-40 mV,CP-30～+60 mV，步长10 mV、CT 250 ms、刺激频率1 Hz引出ICa-L。此时HP-40 mV可使INa处于完全失活状态，ICa-L于短期内达峰值，而延迟整流钾电流(IK)及内向整流钾电流(IK1)激活时间均较长，且与ICa-L峰值比较数值均较小，故测定ICa-L峰值(ICa-Lmax)可基本排除IK1、Ik的影响。以CP与相对应的INamax和ICa-Lmax作用分别得到INa、ICa-L的电流-电压(I-V)曲线。以含Sin 1，5，10 μmol/L细胞外液依次灌流5 min，每次灌流后重复上述实验，观察用药前及不同浓度Sin灌流后CP-30 mV INamax及CP 10 mV时ICa-Lmax，并计算抑制率。
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抑制率=[I用药前-I用药后]/I用药前×100%。
1.4.2 双脉冲刺激法观察Sin对INa灭活后恢复过程的影响 第一脉冲P1：HP-80 mV、CP-30 mV，CT 50 ms、回至 HP后于不同时间间歇t(P1P2)后发出P2，其条件同P1。此时P1使INa激活后迅速灭活，P2测试不同时间间歇t(P1P2)后INa恢复程度，以INa(P2)/INa(P1)表示，它与相应的t(P1P2)作图即为INa灭活后恢复曲线，以含Sin 1，10 μmol/L细胞外液灌注5 min后，分别重复上述试验。
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1.4.3 不同刺激频率对INa的影响 HP-80 mV,CP-70～70 mV,CT 40 ms、步长10 mV、刺激频率0.5，1，2 Hz分别引出INa，5 μmol/L Sin的细胞外液灌流5 min后，重复上述实验，比较用药前后不同频率及CP-30 mV时INamax，并计算每种频率下INamax用药后较用药前的抑制率。
1.5 统计学分析 数据以X±s表示，用药前后比较用配伍设计多样本间方差分析(q检验)。不同刺激频率后Sin对INamax的影响采用两因素多水平设计的方差分析。以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 sin对INa及ICa-L的影响 Sin对INa、ICa-L均具浓度依赖性阻滞作用，使二者I-V曲线上移，但不改变峰电位(INa-30 mV,ICa-L+10 mV)、激活电位(INa-50 mV，ICa-L-20 mV)，反转电位(INa+40 mV，ICa-L+50 mV)见图1，2。Sin灌注前后INamax、ICa-Lmax见表1。灌注前后及Sin不同浓度组之间INamax、ICa-Lmax差异均具显著性(P均<0.05)，即Sin对INamax及ICa-Lmax具浓度依赖性抑制作用。
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图1 不同浓度的Sin对INa I-V曲线的影响
图2 不同浓度的Sin对ICa-L I-V曲线的影响
2.2 Sin对INa灭活后恢复过程的影响 见图3。使INa灭活后恢复曲线浓度依赖性右移，用药后INa(P2)要恢复至某一水平(如INaP1的60%)所需时间间歇更长，即Sin对INa灭活后恢复过程具延迟作用。
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图3 不同浓度的Sin对INa灭活后恢复曲线的影响
表1 不同浓度Sin对INamax和ICa-Lmax
的影响(X±s，n=8)
类别
INamax(nA)
ICa-Lmax(pA)
用药前
7.277±0.902
1014.3±152.4
1 μmol/l
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5.580±0.864(23.3%)*
884.9±135.2(12.8%)**
5 μmol/l
4.468±0.427(36.1%)**
646.8±99.2(35.9)**
10 μmol/l
2.910±0.662(60.0%)*
538.0±81.3(46.9%)**
注：n为实验次数。与用药前自身比较，* P<0.05，** P<0.01。括号中数据为抑制率
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2.3 刺激频率对INa的影响 见表2。两因素方差分析表明频率、药物因素对INamax影响均具显著性差异(P<0.05)。5 μmol/L Sin灌注时，刺激频率0.5，1，2 Hz时INa抑制率分别为36.1%±3.2%、41.5%±3.5%、48.0%±3.4%，即Sin对INa具频率依赖性阻滞作用。
表2 5 μmol/L Sin灌注时不同刺激频率对INamax
的影响(X±s，n=8，nA)
刺激
频率
INamax
用药前 用药后 抑制率(%)
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0.5 Hz
7.277±0.902
4.468±0.427
36.1±3.2
1 Hz
6.932±0.845
4.056±0.740*
41.5±3.5*
2 Hz
6.820±0.804
3.490±0.673**
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48.0±3.4**△
注：n为实验次数。与刺激频率0.5 Hz比较，* P<0.05，** P<0.01。与刺激频率1 Hz比较，△P<0.05
3 讨论
Sin对INa明显的浓度依赖性阻滞作用能较好地解释其在多细胞心肌标本中明显降低动作电位幅度、0相去极速率、兴奋性和传导性等现象。其临床镇痛局麻效应[5]可由神经根及神经纤维INa阻滞作用解释。Sin使INa和ICa-L I-V曲线上移而不改变其激活、峰值、反转电位，揭示Sin于不同膜电位时均对二者具抑制作用且抑制程度相似。受体调节学说认为钠通道具静息(R)、激动(A)和失活(I)三种状态。刺激频率越快，处于激活态和失活态钠通道增多而静息态相对减少。因此作用于激活态或失活态的药物随刺激频率加快与通道结合率上升，阻滞作用加强。此即药物作用的频率依赖性或使用依赖性[6]。本实验Sin对INa具频率依赖性阻滞效应提示Sin作用于INa激活态或失活态。Sin使INa灭活后恢复过程延迟则提示Sin作用于INa的失活态。
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Sin对ICa-L的抑制作用提示Sin可能具负性变时变力效应，与先前多细胞实验结果相符[1，2]。Sin抑制ICa-L使动作电位时程具缩短倾向，与多细胞标本实验结论相反，这可能是由于Sin能同时抑制IK及IK1[7]，而后者延长动作电位时程较ICa-L缩短动作电位时程更明显的原因。综上所述，Sin对INa及ICa-L均具浓度依赖性抑制作用，并可能作用于INa的失活态。这可能为其抗心律失常作用的主要离子机制。
作者简介：丁仲如(1968— )，男(汉族)，湖北麻城人，主治医师，硕士，现在解放军第九四医院心内科(江西南昌 330002)。
作者单位：丁仲如(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
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李庚山(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
蒋锡嘉(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
许家俐(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
王腾(湖北医科大学附属第一医院心内科 湖北武汉 430060)
参考文献：
[1] 李朝兴，赵更生.青藤碱对异丙肾上腺素、组胺、氯化钙正性频率的影响[J].中国药理学通报，1987，3：17
[2] 李朝兴，赵更生.青藤碱对豚鼠心肌动作电位和收缩力的影响[J].药学学报，1987，22(8)：56
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[3] Kazuto Y,Muneshige K,Masahiro A,et al.An improved method for isolating cardiac myocytes useful for patch clamp studies [J].Japan J Physiol,1990,40:157
[4] Hamill OP,Marty A,Neher E,et al.Improved patch clamp techinque for high resolution current recording from cells and cell free membrance patch [J].Pflugers Arch,1981,391:85
[5] 张土善.青风藤碱的药理作用.I：镇痛、消炎及急性毒理实验[J].药学学报，1961，8：7
[6] Hondegen LM,Katzung BG.Time and voltage dependant interaction of antiarrhythinic drugs with cardiac sodium channels [J].Biochem Biophys Acta,1974,427:373
[7] 黄从新，丁仲如，李庚山，等.青藤碱对豚鼠心室肌细胞钾通道的阻滞作用[J]。中国心脏起搏与心电生理杂志，1997，11(1)：36, 百拇医药