椎间盘纤维环中糖胺多糖的实验研究
王方 沈姗安 黄淦堂 徐岚 吴士 姜为民
摘 要 目的 研究正常和退变腰椎间盘纤维环中糖胺多糖(GAG)含量及其主要成份百分组成，探讨椎间盘退变的发生机理。方法 对34个正常纤维环和35个椎间盘突出症纤维环标本中GAG含量进行测定，并用醋酸纤维素膜电泳和光密度扫描的方法对GAG主要成份百分组成进行测定。结果 正常纤维环GAG含量为4.17±0.94 g/100 g，退变纤维环GAG含量为3.57±0.98 g/100 g，低于正常组(P<0.05)；退变组GAG中硫酸软骨素(CS)百分值低于正常组(P<0.05)；而其透明质酸(HA)和硫酸角质(KS)高于正常组(P<0.05)。结论 椎间盘纤维环中GAG含量下降，是引起纤维环胶原纤维稳定性降低，影响纤维环板层滑动，导致椎间盘退变、突出症发生的重要原因之一。退变纤维环GAG含量下降由其主要成分CS含量下降所致。
, 百拇医药
关键词：糖胺多糖 椎间盘突出，腰 病理学 透明质酸 硫酸角质
本文采用蛋白多糖分解后的提取物——糖胺多糖(Glycosaminoglycan，GAG)生化测定分析方法[1]对正常纤维环和椎间盘突出症纤维环标本进行了研究。
1 材料和方法
1.1 取材 正常纤维环标本取自7例急性脑外伤患者，范围L1～S1，共34个标本，均为男性，平均年龄26.9岁(21～34岁)；退变纤维环标本取自29例腰椎间盘突出症手术患者，范围L3～S1共35个，男性20例，女性9例，平均年龄27.4岁(20～34岁)。标本取出后用0 ℃生理盐水洗去表层血液，小玻璃瓶中密封-30℃短期保存。
1.2 匀浆制备 切取少许纤维环标本，称取每份标本用量；切碎后加入0.1 MNaOH1.5 ml，在冰水槽中用匀浆器制成乳白色匀浆；加入0.1 MHCl调至中性，加入2%NaN3两滴。
, 百拇医药
1.3 GAG提取 在各试管中加入胰蛋白酶1 mg/ml，混匀后37℃保存24h；加入60%三氯醋酸至终浓度为10%，混匀后放置24 h；以14000 r/min离心20 min，留上清液，加入4倍体积无水乙醇，放置48 h出现白色絮状沉淀；以14000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀溶于1 ml蒸馏水中即得GAG溶液。
1.4 GAG含量测定 取GAG溶液0.1 ml(标准管中取1 mg/ml氨基半乳糖0.1 ml)，以6 MHCl水解GAG游离出氨基己糖；加入乙酰丙酮10.5 ml，90℃水浴30 min，使氨基己糖生成吡咯衍生物；冷却后加入95%乙醇2.5 ml，混匀后放置20 min，加入对二甲氨基苯甲醛混匀后显红色，10分钟内用530 nm分光光度计测定吸光值OD。纤维环GAG含量＝(样本管OD值/标准管OD值)×1×0.1×(沉淀物稀释倍数/样本用量)(单位：g/100 g湿重纤维环)。
1.5 GAG成份分析 GAG为多聚阴离子，主要成份有透明质酸(hyaluronic acid，HA)、硫酸角质(karatin sulfate，KS)和硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)等。本实验标准品和样本GAG点样经醋酸纤维素膜吡啶甲酸缓冲液电泳，8 V/cm，通电60 min，取出后用阿利新蓝染色，经过脱色液10 min、20 min、40 min脱色后烘干，用岛津-930荧光密度仪扫描，自动积分记录各区带相对百分值，得到GAG主要成份相对百分值。
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1.6 统计学处理 电泳扫描图上由GAG点样端向阳极端多呈HA、KS、CS三条区带；但有的只有两条区带，为KS不明显；有的有四条区带，为CS分为4-CS和6-CS之故。为便于统计分析，考虑KS区带不明显或KS和HA区带未完全分开，本文将HA+KS百分值之和作为一组数据进行处理。计算正常组和退变组的GAG、CS和HA+KS共六组数据的均数加减标准误，并对正常组和退变组数据之间存在的差异是否有显著性，作t检验。
2 结果
2.1 纤维环GAG含量(单位：g/100 g湿重纤维环) 正常组含量为4.17±0.94；退变组含量为3.57±0.98，低于正常组，差异有显著性(P<0.05)。
2.2 纤维环GAG主要成份分析(单位：%) 正常组CS百分值为72.6±15.3；退变组CS百分值为57.9±13.0，低于正常组，差异有显著性(P<0.05)。正常组HA+KS百分值为27.2±13.3；退变组HA+KS百分值为42.0±12.9，高于正常组，差异有显著性(P<0.05)。
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3 讨论
正常椎间盘纤维环中，水含量占60%～70%，胶原蛋白占其干重的60%，蛋白多糖占干重的20%，其余为少量的弹性蛋白、年龄色素[2]。GAG糖链与纤维环中胶原纤维直接连接，使胶原纤维更加稳定[3]；同时蛋白多糖在纤维环板层间沉积，其GAG糖链与水结合，使纤维板层之间具有粘性，当脊柱在伸屈等运动过程中有利于纤维环板层间的滑动[4]。椎间盘纤维环GAG含量的下降，会影响纤维环中胶原纤维的稳定性和纤维板层间的滑动，加剧纤维环退变进程，进一步诱发椎间盘突出。
根据GAG不同成分所带电荷的不同，电泳时迁移率也就不同，在实验中可将GAG分离。椎间盘纤维环中蛋白多糖水解出的GAG糖链，主要有CS、KS、HA和少量的硫酸肤质(DS)。椎间盘中大多数细胞(约60%)能产生CS、KS等GAG成份[5]。本实验结果发现：退变组GAG含量较正常组下降的同时，其GAG中的CS百分值也较正常组下降，而退变组HA+KS百分值较正常组上升。纤维环中GAG主要成份以CS占绝大多数，因此退变纤维环中GAG含量下降由CS含量下降所致。椎间盘纤维环主要基质成份中，以GAG含量与其中水含量直接相关，而GAG不同主要成份中CS与水的亲和力最强[6]。随年龄增长而逐渐加剧的椎间盘退变过程中，虽然HA+KS随年龄增长而增加，但是不足以补偿其中CS含量的下降，从而引起椎间盘纤维环中GAG含量和水含量下降[4]。国外有关椎间盘GAG主要成份HA+KS的实验研究结果有较大的差异，可能与实验取材部位、方法的差异、实验误差有关。有实验研究发现，椎间盘退变时首先是GAG和水丢失，早期可刺激组织修复，当退变程度加重时这种修复不易进行，纤维环和髓核变性[7]。
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当压力、扭转外力作用于脊柱时，先作用于椎间盘软骨终板，再经过凝胶状髓核均匀地传递到纤维环，纤维环的作用为抗张力、保持椎间盘髓核容积、限制椎体间运动、维持椎体骨与韧带间解剖关系的稳定[8]。GAG含量和水含量减少会影响椎间盘纤维环生物力学性能，在退变的基础上易于破裂，引起椎间盘髓核突出。
总之，椎间盘纤维环中GAG含量(主要是CS含量)下降，是引起胶原纤维稳定性降低、影响纤维环板层滑动、导致椎间盘组织退变、椎间盘突出的重要原因之一。
王方(上海市第二人民医院，上海 200011)
沈姗安(上海市第二人民医院，上海 200011)
黄淦堂(上海市第二人民医院，上海 200011)
徐岚(苏州医学院，江苏 苏州)
, 百拇医药
吴士(苏州医学院，江苏 苏州)
姜为民(苏州医学院，江苏 苏州)
参考文献
[1] 方德福，周吕，丁濂，等.现代医学实验技巧全书.北京：北京医科大学、协和医科大学联合出版社.1995.679-684.
[2] Sedowofia KA，Tomlinson IW，Weiss JB，et al.Collagenolytic enzyme systems in human intervertebral disc.Spine，1982，7(3)：213-221.
[3] Bernick S，Walker JM，Paule WJ.Age changes to the annulus fibrosus in human intervertebral disc.Spine，1991，16(5)：520-524.
, 百拇医药
[4] Scott JE，Bosworth TR，Cribb AM，et al.The chemical morphology of age-related changes in human intervertebral disc glycosaminoglycans from cervical，thoracic and lumbar nucleus pulposus and annulus fibrosus.J Anat，1994，184(2)：73-82.
[5] Chelberg MK，Banks GM，Geiger DF，et al.Identification of heterogeneous cell populations in normal human intervertebral disc.J Anat，1995，186(1)：43-53.
[6] Antoniou J，Steffen T，Nelson F，et al.The human lumbar intervertebral disc.J Clin Invest，1996，98(4)：996-1003.
[7] Lipson SJ，Muir H.Biochemical analysis of the prolapse′s intervertebral disc for rabbit.Spine，1981，6(2)：194-210.
[8] Skaggs DL，Weidenbaum M，Latridis JC，et al.Regional variation in tensile propertie and biochemical composition of the human lumbar annulus fibrosus.Spine，1994，19(12)：1310-1319., 百拇医药
摘 要 目的 研究正常和退变腰椎间盘纤维环中糖胺多糖(GAG)含量及其主要成份百分组成，探讨椎间盘退变的发生机理。方法 对34个正常纤维环和35个椎间盘突出症纤维环标本中GAG含量进行测定，并用醋酸纤维素膜电泳和光密度扫描的方法对GAG主要成份百分组成进行测定。结果 正常纤维环GAG含量为4.17±0.94 g/100 g，退变纤维环GAG含量为3.57±0.98 g/100 g，低于正常组(P<0.05)；退变组GAG中硫酸软骨素(CS)百分值低于正常组(P<0.05)；而其透明质酸(HA)和硫酸角质(KS)高于正常组(P<0.05)。结论 椎间盘纤维环中GAG含量下降，是引起纤维环胶原纤维稳定性降低，影响纤维环板层滑动，导致椎间盘退变、突出症发生的重要原因之一。退变纤维环GAG含量下降由其主要成分CS含量下降所致。
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关键词：糖胺多糖 椎间盘突出，腰 病理学 透明质酸 硫酸角质
本文采用蛋白多糖分解后的提取物——糖胺多糖(Glycosaminoglycan，GAG)生化测定分析方法[1]对正常纤维环和椎间盘突出症纤维环标本进行了研究。
1 材料和方法
1.1 取材 正常纤维环标本取自7例急性脑外伤患者，范围L1～S1，共34个标本，均为男性，平均年龄26.9岁(21～34岁)；退变纤维环标本取自29例腰椎间盘突出症手术患者，范围L3～S1共35个，男性20例，女性9例，平均年龄27.4岁(20～34岁)。标本取出后用0 ℃生理盐水洗去表层血液，小玻璃瓶中密封-30℃短期保存。
1.2 匀浆制备 切取少许纤维环标本，称取每份标本用量；切碎后加入0.1 MNaOH1.5 ml，在冰水槽中用匀浆器制成乳白色匀浆；加入0.1 MHCl调至中性，加入2%NaN3两滴。
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1.3 GAG提取 在各试管中加入胰蛋白酶1 mg/ml，混匀后37℃保存24h；加入60%三氯醋酸至终浓度为10%，混匀后放置24 h；以14000 r/min离心20 min，留上清液，加入4倍体积无水乙醇，放置48 h出现白色絮状沉淀；以14000 r/min离心20 min，弃上清液，沉淀溶于1 ml蒸馏水中即得GAG溶液。
1.4 GAG含量测定 取GAG溶液0.1 ml(标准管中取1 mg/ml氨基半乳糖0.1 ml)，以6 MHCl水解GAG游离出氨基己糖；加入乙酰丙酮10.5 ml，90℃水浴30 min，使氨基己糖生成吡咯衍生物；冷却后加入95%乙醇2.5 ml，混匀后放置20 min，加入对二甲氨基苯甲醛混匀后显红色，10分钟内用530 nm分光光度计测定吸光值OD。纤维环GAG含量＝(样本管OD值/标准管OD值)×1×0.1×(沉淀物稀释倍数/样本用量)(单位：g/100 g湿重纤维环)。
1.5 GAG成份分析 GAG为多聚阴离子，主要成份有透明质酸(hyaluronic acid，HA)、硫酸角质(karatin sulfate，KS)和硫酸软骨素(chondroitin sulfate，CS)等。本实验标准品和样本GAG点样经醋酸纤维素膜吡啶甲酸缓冲液电泳，8 V/cm，通电60 min，取出后用阿利新蓝染色，经过脱色液10 min、20 min、40 min脱色后烘干，用岛津-930荧光密度仪扫描，自动积分记录各区带相对百分值，得到GAG主要成份相对百分值。
, http://www.100md.com
1.6 统计学处理 电泳扫描图上由GAG点样端向阳极端多呈HA、KS、CS三条区带；但有的只有两条区带，为KS不明显；有的有四条区带，为CS分为4-CS和6-CS之故。为便于统计分析，考虑KS区带不明显或KS和HA区带未完全分开，本文将HA+KS百分值之和作为一组数据进行处理。计算正常组和退变组的GAG、CS和HA+KS共六组数据的均数加减标准误，并对正常组和退变组数据之间存在的差异是否有显著性，作t检验。
2 结果
2.1 纤维环GAG含量(单位：g/100 g湿重纤维环) 正常组含量为4.17±0.94；退变组含量为3.57±0.98，低于正常组，差异有显著性(P<0.05)。
2.2 纤维环GAG主要成份分析(单位：%) 正常组CS百分值为72.6±15.3；退变组CS百分值为57.9±13.0，低于正常组，差异有显著性(P<0.05)。正常组HA+KS百分值为27.2±13.3；退变组HA+KS百分值为42.0±12.9，高于正常组，差异有显著性(P<0.05)。
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3 讨论
正常椎间盘纤维环中，水含量占60%～70%，胶原蛋白占其干重的60%，蛋白多糖占干重的20%，其余为少量的弹性蛋白、年龄色素[2]。GAG糖链与纤维环中胶原纤维直接连接，使胶原纤维更加稳定[3]；同时蛋白多糖在纤维环板层间沉积，其GAG糖链与水结合，使纤维板层之间具有粘性，当脊柱在伸屈等运动过程中有利于纤维环板层间的滑动[4]。椎间盘纤维环GAG含量的下降，会影响纤维环中胶原纤维的稳定性和纤维板层间的滑动，加剧纤维环退变进程，进一步诱发椎间盘突出。
根据GAG不同成分所带电荷的不同，电泳时迁移率也就不同，在实验中可将GAG分离。椎间盘纤维环中蛋白多糖水解出的GAG糖链，主要有CS、KS、HA和少量的硫酸肤质(DS)。椎间盘中大多数细胞(约60%)能产生CS、KS等GAG成份[5]。本实验结果发现：退变组GAG含量较正常组下降的同时，其GAG中的CS百分值也较正常组下降，而退变组HA+KS百分值较正常组上升。纤维环中GAG主要成份以CS占绝大多数，因此退变纤维环中GAG含量下降由CS含量下降所致。椎间盘纤维环主要基质成份中，以GAG含量与其中水含量直接相关，而GAG不同主要成份中CS与水的亲和力最强[6]。随年龄增长而逐渐加剧的椎间盘退变过程中，虽然HA+KS随年龄增长而增加，但是不足以补偿其中CS含量的下降，从而引起椎间盘纤维环中GAG含量和水含量下降[4]。国外有关椎间盘GAG主要成份HA+KS的实验研究结果有较大的差异，可能与实验取材部位、方法的差异、实验误差有关。有实验研究发现，椎间盘退变时首先是GAG和水丢失，早期可刺激组织修复，当退变程度加重时这种修复不易进行，纤维环和髓核变性[7]。
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当压力、扭转外力作用于脊柱时，先作用于椎间盘软骨终板，再经过凝胶状髓核均匀地传递到纤维环，纤维环的作用为抗张力、保持椎间盘髓核容积、限制椎体间运动、维持椎体骨与韧带间解剖关系的稳定[8]。GAG含量和水含量减少会影响椎间盘纤维环生物力学性能，在退变的基础上易于破裂，引起椎间盘髓核突出。
总之，椎间盘纤维环中GAG含量(主要是CS含量)下降，是引起胶原纤维稳定性降低、影响纤维环板层滑动、导致椎间盘组织退变、椎间盘突出的重要原因之一。
王方(上海市第二人民医院，上海 200011)
沈姗安(上海市第二人民医院，上海 200011)
黄淦堂(上海市第二人民医院，上海 200011)
徐岚(苏州医学院，江苏 苏州)
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吴士(苏州医学院，江苏 苏州)
姜为民(苏州医学院，江苏 苏州)
参考文献
[1] 方德福，周吕，丁濂，等.现代医学实验技巧全书.北京：北京医科大学、协和医科大学联合出版社.1995.679-684.
[2] Sedowofia KA，Tomlinson IW，Weiss JB，et al.Collagenolytic enzyme systems in human intervertebral disc.Spine，1982，7(3)：213-221.
[3] Bernick S，Walker JM，Paule WJ.Age changes to the annulus fibrosus in human intervertebral disc.Spine，1991，16(5)：520-524.
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[4] Scott JE，Bosworth TR，Cribb AM，et al.The chemical morphology of age-related changes in human intervertebral disc glycosaminoglycans from cervical，thoracic and lumbar nucleus pulposus and annulus fibrosus.J Anat，1994，184(2)：73-82.
[5] Chelberg MK，Banks GM，Geiger DF，et al.Identification of heterogeneous cell populations in normal human intervertebral disc.J Anat，1995，186(1)：43-53.
[6] Antoniou J，Steffen T，Nelson F，et al.The human lumbar intervertebral disc.J Clin Invest，1996，98(4)：996-1003.
[7] Lipson SJ，Muir H.Biochemical analysis of the prolapse′s intervertebral disc for rabbit.Spine，1981，6(2)：194-210.
[8] Skaggs DL，Weidenbaum M，Latridis JC，et al.Regional variation in tensile propertie and biochemical composition of the human lumbar annulus fibrosus.Spine，1994，19(12)：1310-1319., 百拇医药