兴奋性氨基酸转运体研究进展
吕辉 徐天乐
摘 要 兴奋性氨基酸转运体(EAAT)位于突触前膜、突触囊泡和神经胶质细胞膜上。它们对于兴奋性氨基酸的再循环，兴奋性信号的终止以及保护神经细胞免受兴奋 性毒性损害具有特别重要的意义。本文介绍EAAT研究进展。
关键词：兴奋性氨基酸转运体 谷氨酸摄取 抑制剂 药理学 生理学
谷氨酸(Glu)是哺乳动物中枢神经系统内一种主要的兴奋性神经递质。通过激活多种离子型和代谢型Glu受体，Glu参与从神经元通信到神经可塑性及神经病理异常等一系列生命过 程[1，2]。Glu所发挥的广泛作用要求其浓度在中枢神经系统(CNS)尤其在兴奋性氨 基酸(EAA)受体的微环境中受到严格调控。通常认为，细胞外液中没有使Glu失活的水解酶系 统。从神经末梢释放出来的Glu清除和失活的唯一途径是通过位于突触前膜和神经胶质细胞 膜上的EAA转运体(EAA transporters,EAAT)的摄取而实现的。因此，EAAT对于EAA的再循环 ，兴奋性信号的终止以及保护神经细胞免受兴奋性毒性损害具有特别重要的意义。
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1 EAAT药理学
对CNS中的EAAT的研究始于30多年前，至今已使用了多种实验标本，其中包括突触体、突触囊泡、组织切片、原代培养的神经元或神经胶质细胞等。对比研究EAAT的药理学特性(Glu/同型半胱氨酸)，离子依赖性(Na+/Cl-)，细胞类型(神经元/胶质细胞)和亚细胞定位(突触前膜/突触囊泡)等，可以看出存在几种不同类型的专一性EAAT。其中Na+依赖性的EAAT在药理学、转运机制、分布及分子生物学方面研究得最多，它在调控CNS的Glu水平中起重要作用。早期的研究主要通过定量测定EAAT转运同位素标记底物的能力，确定了Na+依赖性的EAAT的动力学特性。随后的研究则集中在高选择性EAAT抑制剂的开发上。已知天然的或 合成的EAAT抑制剂均属于α-氨基酸，其α-羧基与第2个酸性基团间通常隔有2～4个碳原子(见图1)。EAAT蛋白的结合位点还可以容纳一些结构类似于天门冬氨酸的底物，例如非代谢性底物D-天门冬氨酸、竞争性抑制剂D-和L-3-羟基天门冬氨酸。
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Fig 1 The structure of EAAT inhibitor(L-CCG-Ⅲ)
可是，这些早期抑制剂的应用受其与EAA突触的其他部位特别是EAA受体的交叉反应的限制。这类抑制剂的线性结构和旋转自由度使它们具有高度的构象易变性。所以，这些分子能够自由地形成与EAA受体或EAAT相结合所必需的专一构象，其结合的方式正与Glu本身一样。克服这一缺陷的重要途径就是开发构象变化小的衍生物。过去，这种方法的优点已在开发高选择性EAA受体激动剂和拮抗剂(例如AMPA, acromelate, CPP)的过程中充分得以体现[3]。目前，通过对几种含有3～5个环结构的EAA类似物的合成和药理学筛选，已经发现了一个有价值的新型强效的EAAT抑制剂库(表1)。其中包括L-CCG-Ⅲ(图1)[4]，反式-ACBD[5]，L-反式-2,4-PDC[6]和 L-抗式-吲哚-MPDC[7]。这些新型抑制剂，由于构象变化减小，对EAAT的选择性明显提高，与EAA受体几乎无交叉反应，从而大大减少了其直接诱导兴奋性毒性神经元损伤的危险性。
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Tab 1 Excitatory amino acid uptake inhibitors
D-aspartate
General substrate(non-metabolized)
L-CCG-Ⅲ
Potent and competitive inhibitor of glial and neuronal uptake of L-glutamate, and L-cysteate.More potent than L(-)-threo-3-Hydroxyaspartate
Chicago sky blue 6B
Competitive inhibitor of L-glutamate uptake
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(±)-Chlorpheg
Selective inhibitor of L-homocysteate uptake
(2S,3R)-Chlorpheg
Selective inhibitor of L-homocysteate uptake
(2S,3S)-Chlorpheg
Selective inhibitor of L-homocysteate uptake. More potent than (2S,3R)-Chlorpheg
Dihydrokaidate
Non-transportable inhibitor of L-glutamate and L-aspartate uptake
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Evans blue
Competitive inhibitor of L-glutamate uptake
D(+)-threo-3- hydroxyaspartate
Potent, competitive, transpo rtable inhibitor of L-glutamate and L-aspartate uptake
L(-)-threo-3-hydroxy-
aspartate
Potent, competitive, transportable inhibitor of L-glutamate and L-aspartate uptake
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T rans-2,4-
Methanoglumatate
(trans-ACBD)
Potent and selective inhibitor of L-glutamate uptake
L-anti-endo-3,4-Methanopyrrolidine dicarboxylic acid
Potent inhibitor of L-glutamate uptake
L-trans-2,4-PDC
Potent, selective, transportable L-glutamate uptake inhibitor
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2 EAAT生理学
在对EAAT生理功能的阐述中，争论最多的是Glu摄取对于中枢兴奋性信号的修正(shaping)和终止的贡献的大小。为此，EAAT抑制剂除了用于鉴定底物在EAAT上的结合区外，还可以作为有效的探针用于评价Glu摄取在CNS中的重要性。然而，尽管大量研究已经证明EAAT抑制剂能够提高细胞外兴奋性神经递质的浓度，增强Glu的作用，但它们影响突触信号的能力却随实验系统和所研究的脑区不同而表现有差异。例如，在海马脑片标本和培养细胞中，抑制的Glu摄取未能改变N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体和非NMDA受体介导的突触电流[8～10]。另一方面，在小脑脑片和培养的海马神经元上，Glu摄取的抑制可以使NMDA和非NMDA受体介导的兴奋性突触后电流(EPSCs)明显延长。这与EAAT功能的减弱导致了突触释放的Glu半清除期增加的观点是一致的[11，12]。
尽管有关Glu摄取在兴奋性信号终止中的确切作用仍有待深入研究，但对于EAAT保护神经元免受兴奋性毒性损伤的证明已向前迈进了一步。例如，业已证明EAAT抑制剂可以使Glu的在体神经毒性症状进一步恶化[13]。类似地，Robinson等证明，EAAT抑制剂可加重Glu对培养的皮层神经细胞的损伤[14]。当长期给脊髓片慢性使用EAAT抑制剂时，可诱导运动神经元病变[15]。考虑到在某些神经退行性疾病如老年性痴呆症(AD病)[16]和肌萎缩侧索硬化症[17]中，EAAT的功能可能遭受破坏，研究EAAT功能的异常与这些疾病发病机制的关系具有十分重要的意义。
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3 EAAT摄取Glu的机制
在谷氨酸能神经末梢，Glu通过一种ATP依赖性的H+离子梯度偶联机制被运送到突触囊泡中。随着神经末梢的去极化和囊泡与突触后膜的融合，Glu被释放到突触间隙，进而激活位于突触前膜与突触后膜上的EAA受体。突触前膜和周围神经胶质细胞上的Na+依赖性EAAT将胞外的Glu摄回。大量的Glu被转运进胶质细胞中，在胶质细胞中的专一性酶谷氨酰氨(Gln)合成酶的作用下转化成Gln后重新进入突触前神经元进行再循环(图2)。
Fig 2 The pattern of glutamate uptake
EAAT对Glu的摄取是Na+依赖性的，同时也有K+的参与，因此被称为Na+和K+依赖性高亲和Glu摄取。胞外的Glu及Na+与EAAT结合后，Glu顺着Na+的浓度梯度与Na+一起被转运入胞内。当Glu同Na+进入膜内侧后，Glu被释放入胞内，K+置换Na+与EAAT结合，被转运出胞。随后，Na+/K+泵将胞内Na+泵出胞外，将K+泵回胞内，以维持细胞内外正常的Na+、K+浓度。
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由于Na+/K+泵参与了Glu的摄取，Na+/K+-ATP酶耗能被动转运Na+和K+，因此EAAT摄取Glu是耗能且温度依赖性的。Glu的摄取是顺着Na+浓度梯度进行的，所以，在一些病理情况(如缺血、缺氧、低血糖等)下能量供应受阻，Na+/K+-ATP酶不能正常工作，加上强烈去极化反应使胞内Na+浓度急剧增高，最终可造成Glu顺着胞内Na+逆向转运(reversal transport),从胞内排向胞外。此外，由于代谢障碍所造成的细胞内酸化可能也是造成Glu逆向转运的重要因素。
4 展望
近几年EAAT领域最杰出的进展之一是获得了3种Na+依赖性的高亲和性EAAT克隆。即来源于大鼠的GLAST和GLT-1[18，19]；来源于大白兔的EAAC-1[20]。毫无疑问，这些克隆的分离与表达将对研究单个EAAT的结构、分布、药理学和转运机制产生重要影响。这3种亚型连同最近证实的存在于人体中的类似物(EAAT1-EAAT4和HEAAC1)，属于整个膜蛋白系统中独特的一类。这类蛋白相互之间有50%的同源性，含有一段保守的七肽序列(AA(I/Q)FIAQ)。目前，这个七肽序列已用于筛选基因家族。通过序列分析已经确定了EAAT潜在的糖基化和磷酸化位点以及可能的跨膜区。虽然原位杂交和免疫细胞化学研究提示每一种EAAT亚型有其特定的分布区域，如GLT-1与EAAT2主要表达于脑内，而EAAT1、EAAT3及GLAST在神经外也有分布。然而，人们对EAAT亚型的组织和细胞定位的认识仍有待深入。
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传统的阻断实验利用放射性标记方法可以确定EAAT抑制剂是否与转运体结合，但很少说明它们是否也可作为底物被转运。最近，EAAT亚型药理学方面的研究利用了Na+依赖性的Glu摄取的生电(electrogenic)特性，应用电生理学方法证明了这些亚型在卵母细胞中表达的专一性[21～23]。有趣的是，这种技术还提供了1个鉴定可转运(trasportable)和非转运性(non-transportable)抑制剂的方法。因此，传统的EAAT抑制剂可进一步分为可转运的(如D(+)和L(-)-3-羟基天门冬氨酸以及L-反式-2,4-PDC)和非转运的(如双氢海人藻酸)阻断剂[24，25]。初步研究表明，最新开发的抑制剂L-抗式-吲哚-MPDC的底物活性明显低于其前体化合物L-反式-2,4-PDC。其他非转运性抑制剂的开发将对EAAT的作用机制及生理学研究起关键性作用。
鉴定单一EAAT的努力也为寻找亚型特异性抑制剂和底物奠定了基础。尽管已知的几种化合物(如双氢海人藻酸，L-α-氨基乙酸(L-AAD))提供了有关提高特异性的线索，但亚型选择性强效抑制剂的开发仍然是未来的一个重要目标。尤其是要弄清已获得的EAAT克隆与在CNS中观察到的EAAT转运特性之间的关系，必须找到高选择性的强效抑制剂。同样，亚型选择性抑制剂的出现将提供一个急需的“探针库”，用于观察CNS中每个特定的EAAT亚型在信号终止、神经递质再循环以及保护神经元免受神经性毒性损伤过程中各自的优先作用。
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*中国科学院“百人计划”资助项目
作者简介:吕 辉,女,23岁,神经药理学硕士研究生;
徐天乐,男,34岁,神经生物学教授,博士生导师
吕辉(中国科学技术大学生命科学学院，神经生物学与生物物理学系，合肥 230027)
徐天乐(中国科学技术大学生命科学学院，神经生物学与生物物理学系，合肥 230027)
参考文献
1，王 文，徐天乐.NMDA受体通道的结构和功能.生物化学 与生物物理进展，1997;24:321～6
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摘 要 兴奋性氨基酸转运体(EAAT)位于突触前膜、突触囊泡和神经胶质细胞膜上。它们对于兴奋性氨基酸的再循环，兴奋性信号的终止以及保护神经细胞免受兴奋 性毒性损害具有特别重要的意义。本文介绍EAAT研究进展。
关键词：兴奋性氨基酸转运体 谷氨酸摄取 抑制剂 药理学 生理学
谷氨酸(Glu)是哺乳动物中枢神经系统内一种主要的兴奋性神经递质。通过激活多种离子型和代谢型Glu受体，Glu参与从神经元通信到神经可塑性及神经病理异常等一系列生命过 程[1，2]。Glu所发挥的广泛作用要求其浓度在中枢神经系统(CNS)尤其在兴奋性氨 基酸(EAA)受体的微环境中受到严格调控。通常认为，细胞外液中没有使Glu失活的水解酶系 统。从神经末梢释放出来的Glu清除和失活的唯一途径是通过位于突触前膜和神经胶质细胞 膜上的EAA转运体(EAA transporters,EAAT)的摄取而实现的。因此，EAAT对于EAA的再循环 ，兴奋性信号的终止以及保护神经细胞免受兴奋性毒性损害具有特别重要的意义。
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1 EAAT药理学
对CNS中的EAAT的研究始于30多年前，至今已使用了多种实验标本，其中包括突触体、突触囊泡、组织切片、原代培养的神经元或神经胶质细胞等。对比研究EAAT的药理学特性(Glu/同型半胱氨酸)，离子依赖性(Na+/Cl-)，细胞类型(神经元/胶质细胞)和亚细胞定位(突触前膜/突触囊泡)等，可以看出存在几种不同类型的专一性EAAT。其中Na+依赖性的EAAT在药理学、转运机制、分布及分子生物学方面研究得最多，它在调控CNS的Glu水平中起重要作用。早期的研究主要通过定量测定EAAT转运同位素标记底物的能力，确定了Na+依赖性的EAAT的动力学特性。随后的研究则集中在高选择性EAAT抑制剂的开发上。已知天然的或 合成的EAAT抑制剂均属于α-氨基酸，其α-羧基与第2个酸性基团间通常隔有2～4个碳原子(见图1)。EAAT蛋白的结合位点还可以容纳一些结构类似于天门冬氨酸的底物，例如非代谢性底物D-天门冬氨酸、竞争性抑制剂D-和L-3-羟基天门冬氨酸。
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Fig 1 The structure of EAAT inhibitor(L-CCG-Ⅲ)
可是，这些早期抑制剂的应用受其与EAA突触的其他部位特别是EAA受体的交叉反应的限制。这类抑制剂的线性结构和旋转自由度使它们具有高度的构象易变性。所以，这些分子能够自由地形成与EAA受体或EAAT相结合所必需的专一构象，其结合的方式正与Glu本身一样。克服这一缺陷的重要途径就是开发构象变化小的衍生物。过去，这种方法的优点已在开发高选择性EAA受体激动剂和拮抗剂(例如AMPA, acromelate, CPP)的过程中充分得以体现[3]。目前，通过对几种含有3～5个环结构的EAA类似物的合成和药理学筛选，已经发现了一个有价值的新型强效的EAAT抑制剂库(表1)。其中包括L-CCG-Ⅲ(图1)[4]，反式-ACBD[5]，L-反式-2,4-PDC[6]和 L-抗式-吲哚-MPDC[7]。这些新型抑制剂，由于构象变化减小，对EAAT的选择性明显提高，与EAA受体几乎无交叉反应，从而大大减少了其直接诱导兴奋性毒性神经元损伤的危险性。
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Tab 1 Excitatory amino acid uptake inhibitors
D-aspartate
General substrate(non-metabolized)
L-CCG-Ⅲ
Potent and competitive inhibitor of glial and neuronal uptake of L-glutamate, and L-cysteate.More potent than L(-)-threo-3-Hydroxyaspartate
Chicago sky blue 6B
Competitive inhibitor of L-glutamate uptake
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(±)-Chlorpheg
Selective inhibitor of L-homocysteate uptake
(2S,3R)-Chlorpheg
Selective inhibitor of L-homocysteate uptake
(2S,3S)-Chlorpheg
Selective inhibitor of L-homocysteate uptake. More potent than (2S,3R)-Chlorpheg
Dihydrokaidate
Non-transportable inhibitor of L-glutamate and L-aspartate uptake
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Evans blue
Competitive inhibitor of L-glutamate uptake
D(+)-threo-3- hydroxyaspartate
Potent, competitive, transpo rtable inhibitor of L-glutamate and L-aspartate uptake
L(-)-threo-3-hydroxy-
aspartate
Potent, competitive, transportable inhibitor of L-glutamate and L-aspartate uptake
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Methanoglumatate
(trans-ACBD)
Potent and selective inhibitor of L-glutamate uptake
L-anti-endo-3,4-Methanopyrrolidine dicarboxylic acid
Potent inhibitor of L-glutamate uptake
L-trans-2,4-PDC
Potent, selective, transportable L-glutamate uptake inhibitor
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2 EAAT生理学
在对EAAT生理功能的阐述中，争论最多的是Glu摄取对于中枢兴奋性信号的修正(shaping)和终止的贡献的大小。为此，EAAT抑制剂除了用于鉴定底物在EAAT上的结合区外，还可以作为有效的探针用于评价Glu摄取在CNS中的重要性。然而，尽管大量研究已经证明EAAT抑制剂能够提高细胞外兴奋性神经递质的浓度，增强Glu的作用，但它们影响突触信号的能力却随实验系统和所研究的脑区不同而表现有差异。例如，在海马脑片标本和培养细胞中，抑制的Glu摄取未能改变N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体和非NMDA受体介导的突触电流[8～10]。另一方面，在小脑脑片和培养的海马神经元上，Glu摄取的抑制可以使NMDA和非NMDA受体介导的兴奋性突触后电流(EPSCs)明显延长。这与EAAT功能的减弱导致了突触释放的Glu半清除期增加的观点是一致的[11，12]。
尽管有关Glu摄取在兴奋性信号终止中的确切作用仍有待深入研究，但对于EAAT保护神经元免受兴奋性毒性损伤的证明已向前迈进了一步。例如，业已证明EAAT抑制剂可以使Glu的在体神经毒性症状进一步恶化[13]。类似地，Robinson等证明，EAAT抑制剂可加重Glu对培养的皮层神经细胞的损伤[14]。当长期给脊髓片慢性使用EAAT抑制剂时，可诱导运动神经元病变[15]。考虑到在某些神经退行性疾病如老年性痴呆症(AD病)[16]和肌萎缩侧索硬化症[17]中，EAAT的功能可能遭受破坏，研究EAAT功能的异常与这些疾病发病机制的关系具有十分重要的意义。
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3 EAAT摄取Glu的机制
在谷氨酸能神经末梢，Glu通过一种ATP依赖性的H+离子梯度偶联机制被运送到突触囊泡中。随着神经末梢的去极化和囊泡与突触后膜的融合，Glu被释放到突触间隙，进而激活位于突触前膜与突触后膜上的EAA受体。突触前膜和周围神经胶质细胞上的Na+依赖性EAAT将胞外的Glu摄回。大量的Glu被转运进胶质细胞中，在胶质细胞中的专一性酶谷氨酰氨(Gln)合成酶的作用下转化成Gln后重新进入突触前神经元进行再循环(图2)。
Fig 2 The pattern of glutamate uptake
EAAT对Glu的摄取是Na+依赖性的，同时也有K+的参与，因此被称为Na+和K+依赖性高亲和Glu摄取。胞外的Glu及Na+与EAAT结合后，Glu顺着Na+的浓度梯度与Na+一起被转运入胞内。当Glu同Na+进入膜内侧后，Glu被释放入胞内，K+置换Na+与EAAT结合，被转运出胞。随后，Na+/K+泵将胞内Na+泵出胞外，将K+泵回胞内，以维持细胞内外正常的Na+、K+浓度。
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4 展望
近几年EAAT领域最杰出的进展之一是获得了3种Na+依赖性的高亲和性EAAT克隆。即来源于大鼠的GLAST和GLT-1[18，19]；来源于大白兔的EAAC-1[20]。毫无疑问，这些克隆的分离与表达将对研究单个EAAT的结构、分布、药理学和转运机制产生重要影响。这3种亚型连同最近证实的存在于人体中的类似物(EAAT1-EAAT4和HEAAC1)，属于整个膜蛋白系统中独特的一类。这类蛋白相互之间有50%的同源性，含有一段保守的七肽序列(AA(I/Q)FIAQ)。目前，这个七肽序列已用于筛选基因家族。通过序列分析已经确定了EAAT潜在的糖基化和磷酸化位点以及可能的跨膜区。虽然原位杂交和免疫细胞化学研究提示每一种EAAT亚型有其特定的分布区域，如GLT-1与EAAT2主要表达于脑内，而EAAT1、EAAT3及GLAST在神经外也有分布。然而，人们对EAAT亚型的组织和细胞定位的认识仍有待深入。
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传统的阻断实验利用放射性标记方法可以确定EAAT抑制剂是否与转运体结合，但很少说明它们是否也可作为底物被转运。最近，EAAT亚型药理学方面的研究利用了Na+依赖性的Glu摄取的生电(electrogenic)特性，应用电生理学方法证明了这些亚型在卵母细胞中表达的专一性[21～23]。有趣的是，这种技术还提供了1个鉴定可转运(trasportable)和非转运性(non-transportable)抑制剂的方法。因此，传统的EAAT抑制剂可进一步分为可转运的(如D(+)和L(-)-3-羟基天门冬氨酸以及L-反式-2,4-PDC)和非转运的(如双氢海人藻酸)阻断剂[24，25]。初步研究表明，最新开发的抑制剂L-抗式-吲哚-MPDC的底物活性明显低于其前体化合物L-反式-2,4-PDC。其他非转运性抑制剂的开发将对EAAT的作用机制及生理学研究起关键性作用。
鉴定单一EAAT的努力也为寻找亚型特异性抑制剂和底物奠定了基础。尽管已知的几种化合物(如双氢海人藻酸，L-α-氨基乙酸(L-AAD))提供了有关提高特异性的线索，但亚型选择性强效抑制剂的开发仍然是未来的一个重要目标。尤其是要弄清已获得的EAAT克隆与在CNS中观察到的EAAT转运特性之间的关系，必须找到高选择性的强效抑制剂。同样，亚型选择性抑制剂的出现将提供一个急需的“探针库”，用于观察CNS中每个特定的EAAT亚型在信号终止、神经递质再循环以及保护神经元免受神经性毒性损伤过程中各自的优先作用。
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*中国科学院“百人计划”资助项目
作者简介:吕 辉,女,23岁,神经药理学硕士研究生;
徐天乐,男,34岁,神经生物学教授,博士生导师
吕辉(中国科学技术大学生命科学学院，神经生物学与生物物理学系，合肥 230027)
徐天乐(中国科学技术大学生命科学学院，神经生物学与生物物理学系，合肥 230027)
参考文献
1，王 文，徐天乐.NMDA受体通道的结构和功能.生物化学 与生物物理进展，1997;24:321～6
2，梁秦川，徐天乐.AMPA和KA受体通道的分子结构和功能特性. 生理 科学进展，1997;28:352～5
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