MMP-2与TIMP-2的比值与喉癌转移的关系
作者：肖宽林 王薇 王纾宜 高志宏
单位：肖宽林(上海第二医科大学附属瑞金医院耳鼻咽喉科 上海，200025)；王薇(上海医科大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科)；王纾宜(上海医科大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科)；高志宏(上海医科大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科)
关键词：
临床耳鼻咽喉科杂志000916 浸润与转移是恶性肿瘤的主要生物学特征之一，研究表明，在肿瘤的浸润转移过程中，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)能降解基底膜，促进肿瘤细胞的浸润转移。MMP-2的降解活性能被其组织抑制因子(TIMP-2)所抑制，因此，基底膜及细胞外基质的降解是MMP-2及TIMP-2间不平衡的结果，是由于MMP-2的过度表达，或者TIMP-2表达降低所致。本文应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法，分别检测喉鳞癌组织及正常组织的MMP-2及TIMP-2 mRNA的表达水平，探讨MMP-2及TIMP-2间的比值与喉癌浸润转移的关系。
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1 材料与方法
1.1 临床资料
本文收集眼耳鼻喉科医院1996年6月～1997年4月经病理证实的喉鳞癌手术标本35例，男34例，女1例；年龄47～77岁，平均61岁。术前未作任何治疗。喉癌的临床分期标准参考国际抗癌协会(UICC)1987年公布的TNM方案。35例中，T216例，T315例，T44例；N025例，N16例，N24例。病理分级：Ⅰ级12例，Ⅱ级23例。病变部位：声门上型13例，声门型16例，声门下型6例。用作对照的正常组织取自距肿瘤组织4 cm以上经病理证实为正常的喉咽粘膜。新鲜组织离体后立即置液氮(-196℃)保存至组织总RNA的抽提。
1.2 主要试剂
①Trizol Reagent(GIBCOBRL)。②逆转录酶(AMV)，随机引物，Taq酶，RNA酶抑制剂，4 种10 mmol dNTPs购自Promega公司。③MMP-2、TIMP-2及β-肌动蛋白(β-Actin)cDNA引物序列及起始位置扩增片段长度如下：MMP-2：Sense 5-
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GGTACAGCCTGTTCCTCGT-3(1134-1152)Anti-
sense5-GTCACAGTCCGCCAAATGAA-3(1427-
1446)312 bp，TIMP-2：Sense 5-GGTCTCGCTGGA-
CGTTGGAG-3(567-586)Anti-sense 5-GGAGC-
CGTCACTTCTCTTG-3(852-870)303 bp，β-Actin：
Sense 5-ATCATGAAGTGTGACGTGGAC-3(875-
895)Anti-sense 5-AACCGACTGCTGTCACCT-
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TCA-3(1315-1335)460 bp。④PCR标准 Mark，由华美公司提供，各条带的分子量依次为1543 bp，994 bp，695 bp，515 bp，377 bp，237 bp。
1.3 方法
①RNA的抽提：采用Trizol抽提法分别抽提组织总RNA。②逆转录(RT)：随机引物100 ng，Rnasin 20 u，总RNA 2 μg，焦碳酸二乙酯(DEPC)双蒸水至10 μl，65℃ 5 min，加AMV20 u，5×buffer 4 μl，DEPC水至20 μl，置42℃恒温箱水浴60 min。③PCR扩增：以cDNA为模板，在特异性引物及TaqDNA聚合酶催化下，对目的基因序列进行扩增。PCR反应体系内含10×buffer 5 μl，25 mmol MgCl22.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 u，10 mmol dNTPs 200 μmol/L，特异性引物各30 pmol，cDNA 5 μl，加DEPC水至总反应体积为50 μl，石蜡油覆盖，热变性3 min后，进行循环扩增：94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。④PCR产物分析：PCR产物在2%琼脂糖胶上电泳，各扩增产物相对分子量如图1。⑤以β-Actin作内对照进行 PCR产物的半定量。
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图1 各扩增产物相对分子量
1：PCR Marker，2、3：β-Actin，4、5：分别为正常
组织及肿瘤组织TIMP-2，6、7：分别为正常组织
及肿瘤组织MMP-2
1.4 统计学分析
采用SPSS7.5统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 喉癌组织与正常组织MMP-2、TIMP-2表达比较
35例喉癌标本中，正常组织及肿瘤组织均有MMP-2、TIMP-2的表达，正常组织MMP-2、TIMP-2的表达分别为0.547±0.234，0.600±0.259，肿瘤组织分别为0.765±0.314，0.613±0.227，其中27 例肿瘤组织MMP-2 的表达高于正常组织，8例低于正常组织。肿瘤组织MMP-2表达是正常组织的2.09倍(P<0.05)，TIMP-2表达是正常组织的1.18倍，但无统计学意义(P>0.05)。
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2.2 MMP-2、TIMP-2表达与颈淋巴结转移的关系
10例有颈淋巴结转移(颈淋巴结廓清术后经病理证实)的肿瘤组织中，9例MMP-2表达高于正常组织，1例低于正常组织，颈淋巴结转移的肿瘤组织MMP-2表达为1.029±0.321，明显高于无颈淋巴结转移组(P<0.01)，TIMP-2表达为0.442±0.136，低于无颈淋巴结转移组(P<0.05)。
2.3 MMP-2/TIMP-2间的平衡与颈淋巴结转移的关系
计算MMP-2 tumor/normal/TIMP-2 tumor/normal 间的比值，这一比值反应了二者间的平衡。10例有颈淋巴结转移的患者中，比值为2.566±1.129，25例无颈淋巴结转移的患者中，比值为0.970±0.207，MMP-2/TIMP-2间的平衡与有无颈淋巴结转移有统计学意义(P<0.01)。
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MMP-2 tumor/normal/TIMP-2 tumor/nor-
mal间的比值与细胞分化程度、分期、肿瘤生长部位无关(P>0.05)
3 讨论
肿瘤细胞与基底膜的相互作用是肿瘤发生浸润与转移的关键。Liotta等(1991)提出了肿瘤浸润的三步学说，即肿瘤细胞穿越基底膜可分为吸附、基质溶解与移行，首次明确地指出肿瘤浸润与肿瘤基质降解之间的关系。当肿瘤细胞穿越脉管基底膜随循环到达远处器官组织，即可形成转移灶。因此，在肿瘤细胞的浸润转移过程中，基底膜的降解是关键，Ⅵ型胶原酶不但可以降解细胞间基质成分，还能降解基底膜的主要成分——Ⅵ型胶原而破坏基底膜的完整性，促进肿瘤的浸润与转移。近年来，在人类多种肿瘤中均已发现肿瘤的浸润转移与MMP-2表达相关的证据。
TIMP-2是Stetler-Stevenson和Declerk(1989)分别从人类黑色素瘤细胞及牛主动脉上皮细胞中分离纯化、克隆出的第二个成员，能选择性地与MMP-2形成复合物而抑制其活性，而且可以终止MMPs家族所有成员的水解活性。TIMP-2的抑制作用已在动物体内试验中得到证实。提示在肿瘤组织中，MMPs及TIMPs间平衡被打破是基底膜降解的主要原因，肿瘤的浸润与转移是MMPs过度分泌的结果，或者由TIMPs过低表达所致。
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头颈部肿瘤的研究表明，正常组织及无颈淋巴结转移的肿瘤组织中MMP-2的表达无明显差别，但MMP-2的高表达和颈淋巴结转移有明显关系，并且和肿瘤的局部复发有关。本文35例喉鳞癌标本中，肿瘤组织和正常组织均有MMP-2 及TIMP-2的表达，而且肿瘤组织MMP-2及TIMP-2的表达均高于正常组织，仅肿瘤组织与正常组织MMP-2的表达有统计学意义，特别是在伴有颈淋巴结转移的肿瘤组织中MMP-2的表达明显升高。说明有颈淋巴结转移的肿瘤组织MMP-2呈过度表达，促进Ⅳ型胶原的降解，从而有助于肿瘤细胞浸润与转移；而喉癌组织MMP-2 及TIMP-2的表达与肿瘤的生长部位、细胞分化程度、分期无关，和文献报道相一致。
本文研究中虽然喉癌组织TIMP-2的表达高于正常组织，但二者间无明显统计学意义，而伴有颈淋巴结转移的喉癌组织中TIMP-2的表达明显下降，说明由于MMP-2高表达的同时伴有TIMP-2表达明显下降，MMP-2分泌过度而促进肿瘤的浸润转移。
大量研究表明，MMP-9、MMP-2及TIMP-1、TIMP-2间的失衡与患者的预后有关，我们认为肿瘤组织MMP-2与TIMP-2间的比值在1.0左右者不易发生肿瘤的浸润转移，而比值在1.0以上者易发生浸润转移，表明喉癌浸润转移是MMP-2及TIMP-2间不平衡的结果。MMPs/TIMPs与肿瘤浸润转移关系的研究，能为抗肿瘤浸润转移的治疗提供新的途径。
(收稿 1999-12-30), http://www.100md.com
单位：肖宽林(上海第二医科大学附属瑞金医院耳鼻咽喉科 上海，200025)；王薇(上海医科大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科)；王纾宜(上海医科大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科)；高志宏(上海医科大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻咽喉科)
关键词：
临床耳鼻咽喉科杂志000916 浸润与转移是恶性肿瘤的主要生物学特征之一，研究表明，在肿瘤的浸润转移过程中，基质金属蛋白酶-2(MMP-2)能降解基底膜，促进肿瘤细胞的浸润转移。MMP-2的降解活性能被其组织抑制因子(TIMP-2)所抑制，因此，基底膜及细胞外基质的降解是MMP-2及TIMP-2间不平衡的结果，是由于MMP-2的过度表达，或者TIMP-2表达降低所致。本文应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法，分别检测喉鳞癌组织及正常组织的MMP-2及TIMP-2 mRNA的表达水平，探讨MMP-2及TIMP-2间的比值与喉癌浸润转移的关系。
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1 材料与方法
1.1 临床资料
本文收集眼耳鼻喉科医院1996年6月～1997年4月经病理证实的喉鳞癌手术标本35例，男34例，女1例；年龄47～77岁，平均61岁。术前未作任何治疗。喉癌的临床分期标准参考国际抗癌协会(UICC)1987年公布的TNM方案。35例中，T216例，T315例，T44例；N025例，N16例，N24例。病理分级：Ⅰ级12例，Ⅱ级23例。病变部位：声门上型13例，声门型16例，声门下型6例。用作对照的正常组织取自距肿瘤组织4 cm以上经病理证实为正常的喉咽粘膜。新鲜组织离体后立即置液氮(-196℃)保存至组织总RNA的抽提。
1.2 主要试剂
①Trizol Reagent(GIBCOBRL)。②逆转录酶(AMV)，随机引物，Taq酶，RNA酶抑制剂，4 种10 mmol dNTPs购自Promega公司。③MMP-2、TIMP-2及β-肌动蛋白(β-Actin)cDNA引物序列及起始位置扩增片段长度如下：MMP-2：Sense 5-
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GGTACAGCCTGTTCCTCGT-3(1134-1152)Anti-
sense5-GTCACAGTCCGCCAAATGAA-3(1427-
1446)312 bp，TIMP-2：Sense 5-GGTCTCGCTGGA-
CGTTGGAG-3(567-586)Anti-sense 5-GGAGC-
CGTCACTTCTCTTG-3(852-870)303 bp，β-Actin：
Sense 5-ATCATGAAGTGTGACGTGGAC-3(875-
895)Anti-sense 5-AACCGACTGCTGTCACCT-
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TCA-3(1315-1335)460 bp。④PCR标准 Mark，由华美公司提供，各条带的分子量依次为1543 bp，994 bp，695 bp，515 bp，377 bp，237 bp。
1.3 方法
①RNA的抽提：采用Trizol抽提法分别抽提组织总RNA。②逆转录(RT)：随机引物100 ng，Rnasin 20 u，总RNA 2 μg，焦碳酸二乙酯(DEPC)双蒸水至10 μl，65℃ 5 min，加AMV20 u，5×buffer 4 μl，DEPC水至20 μl，置42℃恒温箱水浴60 min。③PCR扩增：以cDNA为模板，在特异性引物及TaqDNA聚合酶催化下，对目的基因序列进行扩增。PCR反应体系内含10×buffer 5 μl，25 mmol MgCl22.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶1.5 u，10 mmol dNTPs 200 μmol/L，特异性引物各30 pmol，cDNA 5 μl，加DEPC水至总反应体积为50 μl，石蜡油覆盖，热变性3 min后，进行循环扩增：94℃ 1 min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min。④PCR产物分析：PCR产物在2%琼脂糖胶上电泳，各扩增产物相对分子量如图1。⑤以β-Actin作内对照进行 PCR产物的半定量。
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图1 各扩增产物相对分子量
1：PCR Marker，2、3：β-Actin，4、5：分别为正常
组织及肿瘤组织TIMP-2，6、7：分别为正常组织
及肿瘤组织MMP-2
1.4 统计学分析
采用SPSS7.5统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 喉癌组织与正常组织MMP-2、TIMP-2表达比较
35例喉癌标本中，正常组织及肿瘤组织均有MMP-2、TIMP-2的表达，正常组织MMP-2、TIMP-2的表达分别为0.547±0.234，0.600±0.259，肿瘤组织分别为0.765±0.314，0.613±0.227，其中27 例肿瘤组织MMP-2 的表达高于正常组织，8例低于正常组织。肿瘤组织MMP-2表达是正常组织的2.09倍(P<0.05)，TIMP-2表达是正常组织的1.18倍，但无统计学意义(P>0.05)。
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2.2 MMP-2、TIMP-2表达与颈淋巴结转移的关系
10例有颈淋巴结转移(颈淋巴结廓清术后经病理证实)的肿瘤组织中，9例MMP-2表达高于正常组织，1例低于正常组织，颈淋巴结转移的肿瘤组织MMP-2表达为1.029±0.321，明显高于无颈淋巴结转移组(P<0.01)，TIMP-2表达为0.442±0.136，低于无颈淋巴结转移组(P<0.05)。
2.3 MMP-2/TIMP-2间的平衡与颈淋巴结转移的关系
计算MMP-2 tumor/normal/TIMP-2 tumor/normal 间的比值，这一比值反应了二者间的平衡。10例有颈淋巴结转移的患者中，比值为2.566±1.129，25例无颈淋巴结转移的患者中，比值为0.970±0.207，MMP-2/TIMP-2间的平衡与有无颈淋巴结转移有统计学意义(P<0.01)。
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MMP-2 tumor/normal/TIMP-2 tumor/nor-
mal间的比值与细胞分化程度、分期、肿瘤生长部位无关(P>0.05)
3 讨论
肿瘤细胞与基底膜的相互作用是肿瘤发生浸润与转移的关键。Liotta等(1991)提出了肿瘤浸润的三步学说，即肿瘤细胞穿越基底膜可分为吸附、基质溶解与移行，首次明确地指出肿瘤浸润与肿瘤基质降解之间的关系。当肿瘤细胞穿越脉管基底膜随循环到达远处器官组织，即可形成转移灶。因此，在肿瘤细胞的浸润转移过程中，基底膜的降解是关键，Ⅵ型胶原酶不但可以降解细胞间基质成分，还能降解基底膜的主要成分——Ⅵ型胶原而破坏基底膜的完整性，促进肿瘤的浸润与转移。近年来，在人类多种肿瘤中均已发现肿瘤的浸润转移与MMP-2表达相关的证据。
TIMP-2是Stetler-Stevenson和Declerk(1989)分别从人类黑色素瘤细胞及牛主动脉上皮细胞中分离纯化、克隆出的第二个成员，能选择性地与MMP-2形成复合物而抑制其活性，而且可以终止MMPs家族所有成员的水解活性。TIMP-2的抑制作用已在动物体内试验中得到证实。提示在肿瘤组织中，MMPs及TIMPs间平衡被打破是基底膜降解的主要原因，肿瘤的浸润与转移是MMPs过度分泌的结果，或者由TIMPs过低表达所致。
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头颈部肿瘤的研究表明，正常组织及无颈淋巴结转移的肿瘤组织中MMP-2的表达无明显差别，但MMP-2的高表达和颈淋巴结转移有明显关系，并且和肿瘤的局部复发有关。本文35例喉鳞癌标本中，肿瘤组织和正常组织均有MMP-2 及TIMP-2的表达，而且肿瘤组织MMP-2及TIMP-2的表达均高于正常组织，仅肿瘤组织与正常组织MMP-2的表达有统计学意义，特别是在伴有颈淋巴结转移的肿瘤组织中MMP-2的表达明显升高。说明有颈淋巴结转移的肿瘤组织MMP-2呈过度表达，促进Ⅳ型胶原的降解，从而有助于肿瘤细胞浸润与转移；而喉癌组织MMP-2 及TIMP-2的表达与肿瘤的生长部位、细胞分化程度、分期无关，和文献报道相一致。
本文研究中虽然喉癌组织TIMP-2的表达高于正常组织，但二者间无明显统计学意义，而伴有颈淋巴结转移的喉癌组织中TIMP-2的表达明显下降，说明由于MMP-2高表达的同时伴有TIMP-2表达明显下降，MMP-2分泌过度而促进肿瘤的浸润转移。
大量研究表明，MMP-9、MMP-2及TIMP-1、TIMP-2间的失衡与患者的预后有关，我们认为肿瘤组织MMP-2与TIMP-2间的比值在1.0左右者不易发生肿瘤的浸润转移，而比值在1.0以上者易发生浸润转移，表明喉癌浸润转移是MMP-2及TIMP-2间不平衡的结果。MMPs/TIMPs与肿瘤浸润转移关系的研究，能为抗肿瘤浸润转移的治疗提供新的途径。
(收稿 1999-12-30), http://www.100md.com