灵芝多糖对小鼠腹腔巨噬细胞蛋白激酶C活性的影响*
李明春 雷林生 梁东升 许自明 杨淑琴 孙莉莎
摘 要 目的 观察灵芝多糖在体外对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)蛋白激酶C (PKC)活性是否有影响。方法 采用反相离子对高效液相色谱法测定PKC活力。结果 灵芝多糖GLB7 (40 mg.L-1)能引起小鼠腹腔MΦ中PKC活性明显升高,30 min达峰值，2 h恢复到基础水平；GLB7还可引起MΦ中PKC发生质膜转位，并拮抗Staurosporine对MΦ中PKC的抑制作用。结论 灵芝多糖的免疫增强作用与其增强PKC活性有关。
关键词：灵芝 多糖 巨噬细胞 蛋白激酶C
灵芝多糖是灵芝[Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst]的主要活性成分，具有免疫增强和抗肿瘤作用。它能增强小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)的吞噬功能，促进混合淋巴细胞 培养反应，促进未经纯化的脾细胞在体外的增殖，增强DNA多聚酶α的活性，以及促进白细 胞介素-2的分泌等[1～4]。本文利用反相离子对高效液相色谱测定技术, 观察灵 芝多糖对小鼠腹腔MΦ中蛋白激酶C(PKC)活性的影响,以探讨灵芝多糖的免疫调节作用机制 。
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1 材料和方法
1.1 药品与试剂 灵芝多糖(GLB7)，按文献方法提取[5，6]，相对分子量9 000 u。RPMI-1640培养基，为Gibco产品。胎牛血清(FCS): 杭州四季青生物工程材料研究所产品。sucrose、triton-X 100、DTT、PS、DG、leupetin、histone(Ⅲ-s)、staurosporine、PMSF、ATP、ADP、AMP、cAMP、EDTA 均为Sigma 产品。甲醇、PiCA，皆为国产色谱纯。
1.2 动物 BALB/c纯系小鼠，♀♂不限，8 wk龄，体重(19.8±1.4) g，由第一军医大学实验动物中心提供。
1.3 巨噬细胞的培养 按文献方法[7]无菌取小鼠腹腔MΦ，经苔盼蓝染色细胞活率95%以上，调整细胞浓度为109～1010.L-1,接种于多孔培养板中,置含5% CO2，95%空气孵箱中,37℃孵育24h。对照组皆以RPMI-1640 完全培养基替代，实验组中加测试药物 等处理因素，皆以RPMI-1640完全培养基溶解和稀释。
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1.4 PKC活性测定
1.4.1 胞浆及膜性PKC的制备 参考文献方法[8]。培养的细胞体系中加入200 μl PKC提取液，内含：Tris-HCl(pH 7.4) 20 mmol.L-1, DTT 2 mmol.L-1, EDTA 2 mmol.L-1, Leupetin 200 μg，PMSF 1 mmol.L-1, Sucrose 200 mmol.L-1，冰浴下超声粉碎。900×g离心5 min，去除碎片和胞核，得上清即为胞浆组分和膜性组分，以此用于测定PKC总活力。上清液经100 000×g离心60 min，上清即为胞浆组分；残渣重悬于含0.5% Triton X-100的PKC提取液中，100 000×g离心60 min，上清即为膜性组分。以上操作皆于4℃以下进行。
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1.4.2 PKC活性测定 按文献方法采用反相离子对高效液相色谱法测定[8]。PKC反应体系中包括PKC反应液，内含:Tris-HCl(pH 7.4)20 mmol.L-1,PS 100 mg.L-1，DG 10 mg.L-1，MgCl2 10 mmol.L-1,CaCl2 1 mmol.L-1,Histone(Ⅲ-s) 1 mg.L-1，DTT 1 mmol.L-1，ATP 0.5 mmol.L-1和适量酶液(按蛋白含量计)，反应总体积为1 ml。先将除酶液以外的其它溶液混匀，30℃预热5 min，再加入酶液起始反应。反应开始后于30℃水浴摇床中准确保温10 min,立即置于沸水浴中1 min 终止反应；冷却后离心除去蛋白沉淀，上清液中加入1 ml氯仿∶甲醇(2∶1,V/V)混合物,振荡1 min,抽提脂溶性物质,2 000×g离心5 min；小心吸出水层，其中含ATP、ADP和AMP。重复前步骤处理一次，合并提取液，低温冻存待测。
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1.4.3 蛋白含量测定 按Lowry法测定。
1.4.4 PKC活力定义 一个酶活力单位相当于每分钟使组蛋白Histone(Ⅲ-s)磷酸化而消耗1 nmol ATP所需的酶量。
2 结果
2.1 GLB7对MΦ中PKC总活力的影响 以40 mg.L-1 GLB7与MΦ一起孵育不同时间后，测定PKC总活力。结果显示：GLB7可明显促进小鼠腹腔MΦ中PKC总活力的升高，30 min达到峰值,至2 h恢复到基础水平(表1)。实验测得PKC的基础总活力为(197.46±10.23)μmol.min-1.g-1 (n=6)。
Tab 1 Effect of ganoderma polysacchrides(GLB7)on PKC activity
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in murine peritoneal macrophages(X±s，n=6)
Time
/min
PKC total act ivity/μmol.min-1.g-1
GLB7(40 mg.L-1)
Control
10
488.73±12.34**
199.12±9.78
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20
694.72±14.56**
201.08±10.03
30
801.44±21.64**
197.97±8.74
40
530.71±19.61**
198.13±7.41
60
298.47±14.21*
, 百拇医药
198.74±11.21
120
199.58±10.24
197.01±12.11
240
196.78±9.78
197.32±8.44
*P<0.05，**P<0.01 vs control
2.2 GLB7对小鼠MΦ中胞浆和胞膜PKC活性的影响 GLB7(40 mg.L-1)与MΦ一起孵育不同时间后，分别测定MΦ中胞浆和膜性组分PKC活力,发现30 min时，膜性PKC活性达峰值，而胞浆PKC活性达谷值，至2 h皆恢复至基础水平。说明GLB7在活化MΦ内PKC过程中发生膜浆转位(图1)。胞浆和胞膜基础水平分别为(113.44±5.71)μmol.min-1.g-1 和(62.65±2.85) μmol.min-1.g-1(n=6)。
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Fig 1 Effect of ganoderma polysacchrides(GLB7)
on PKC activity in the cytosol and membrance fractions
in murine peritoneal macrophages(n=6,X±s)
○-○：cytosol fraction；●-●：membrance fractions
2.3 GLB7拮抗staurosporine对MΦ中PKC的抑制作用 分别以40 mg.L-1 GLB7和其与staurosporine(10 μmol.L-1)的混合物一起孵育不同时间后，测定MΦ中PKC活力，发现GLB7可明显拮抗staurosporine对MΦ中PKC的抑制作用(图2)。
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Fig 2 Effect of Ganoderma polysacchrides(GLB7)on
the effect of staurosporine on PKC activity in murine
peritoneal macrophages(
±s, n=6)
○-○：staurosporine；●-●：staurosporine + GLB7；▲-▲：control
3 讨论
PKC是一种Ca2+和磷脂依赖性激酶,通过催化多种靶蛋白发生磷酸化反应,完成细胞对外源性信号的应答。PKC主要以非活性形式存在于胞浆部分，以活性形式结合于细胞膜。当胞内PKC激活时,会发生质膜转位。PKC的活化有多条途径，最主要的途径是接受外来信息后产生DG，DG再活化PKC。PKC活性形式即是PKC、DG、磷脂和Ca2+组成的复合物。Staur osporine是PKC抑制剂，作用于PKC催化结构域[9,10]。
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本实验中，灵芝多糖能明显增强小鼠腹腔MΦ中PKC的活力,使之发生质膜转位,并拮抗staurosporine对MΦ中PKC活性的抑制。从GLB7拮抗staurosporine的情况看,GLB7活化小鼠MΦ中PKC的靶点应该在其催化区域，这和佛波醇脂(PMA)的作用位点不同。提示GLB7活化MΦ中PKC的机制不同于PMA，亦即GLB7不是直接作用于PKC受体。说明其影响MΦ信号传递过程中，增强PKC活性是其发挥作用的下游事件，这与其增强PKC活性的表达时间相吻合。 PKC的活化是激活MΦ的必备条件。因此，增强MΦ PKC活性是灵芝多糖发挥免疫增强作用的重要途径。
*国家自然科学基金资助项目，No 39400165
Project supported by the National Natural Science Foundation of China, No 39400165
, 百拇医药
作者简介：李明春，男，34岁，药理学硕士，主管药师；
雷林生，男，39岁，药理学博士，教授，教研室主任
李明春(中国人民解放军401医院药剂科，青岛 266071)
雷林生(第一军医大学药理学教研室，广州 510515)
梁东升(中国人民解放军401医院药剂科，青岛 266071)
许自明(中国人民解放军401医院药剂科，青岛 266071)
杨淑琴(第一军医大学药理学教研室，广州 510515)
孙莉莎(第一军医大学药理学教研室，广州 510515)
, 百拇医药
参考文献
1，林志彬.灵芝多糖的免疫药理学研究及其意义.北京医科大学学报，1992；24(4)：271～3
2，雷林生，林志彬.灵芝多糖对混合淋巴细胞培养的影响.基础与临床，1992；12(2)：59
3，Lei LS, Lin ZHB.Effect of Ganoderma polysaccharides on T cell subpopulations and production of interleukin 2 in mixed lymphocyte response.Acta Pharmaceutica Sinica,1992;27(5):331～4
4，Lei Ls,Lin ZHB. Effect of Ganoderma polysaccharides on the activity of DNA polymerase a in spleen cells stimulated by alloantigens in mice in vitro.J Beijing Med Univ,1991;23(4):329～32
, http://www.100md.com
5，李荣芷，何云庆. 灵芝抗衰老机理与活性成分灵芝多糖的化学与构效研究.北京医科大学学报，1991；23(6)：473～5
6，何庆云，李荣芷，陈 琪 et al.灵芝扶正固本有效成分灵芝多糖的化学研究.北京医科大学学报，1989；21(3)：225～7
7，鄂 征主编.组织培养技术,北京：人民卫生出版社，1993：185
8，李明春，梁东升，许自明 et al.反相离子对HPLC法测定细胞中蛋白激酶活性. 中国生化药物杂志， 1999；20(5)：233～5
9，Azzi A,Boscoboinik D,Hensey C.The protiin C family.Eur J Biochem,1992,208:547～51
10，Kolb JP,Tran PL,Abadie A et al.Intracellular signaling events associated with the induction of DNA synthesis in human B lymphocytes. Cellular Immunology,1993;146:117～29, http://www.100md.com
摘 要 目的 观察灵芝多糖在体外对小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)蛋白激酶C (PKC)活性是否有影响。方法 采用反相离子对高效液相色谱法测定PKC活力。结果 灵芝多糖GLB7 (40 mg.L-1)能引起小鼠腹腔MΦ中PKC活性明显升高,30 min达峰值，2 h恢复到基础水平；GLB7还可引起MΦ中PKC发生质膜转位，并拮抗Staurosporine对MΦ中PKC的抑制作用。结论 灵芝多糖的免疫增强作用与其增强PKC活性有关。
关键词：灵芝 多糖 巨噬细胞 蛋白激酶C
灵芝多糖是灵芝[Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst]的主要活性成分，具有免疫增强和抗肿瘤作用。它能增强小鼠腹腔巨噬细胞(MΦ)的吞噬功能，促进混合淋巴细胞 培养反应，促进未经纯化的脾细胞在体外的增殖，增强DNA多聚酶α的活性，以及促进白细 胞介素-2的分泌等[1～4]。本文利用反相离子对高效液相色谱测定技术, 观察灵 芝多糖对小鼠腹腔MΦ中蛋白激酶C(PKC)活性的影响,以探讨灵芝多糖的免疫调节作用机制 。
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1 材料和方法
1.1 药品与试剂 灵芝多糖(GLB7)，按文献方法提取[5，6]，相对分子量9 000 u。RPMI-1640培养基，为Gibco产品。胎牛血清(FCS): 杭州四季青生物工程材料研究所产品。sucrose、triton-X 100、DTT、PS、DG、leupetin、histone(Ⅲ-s)、staurosporine、PMSF、ATP、ADP、AMP、cAMP、EDTA 均为Sigma 产品。甲醇、PiCA，皆为国产色谱纯。
1.2 动物 BALB/c纯系小鼠，♀♂不限，8 wk龄，体重(19.8±1.4) g，由第一军医大学实验动物中心提供。
1.3 巨噬细胞的培养 按文献方法[7]无菌取小鼠腹腔MΦ，经苔盼蓝染色细胞活率95%以上，调整细胞浓度为109～1010.L-1,接种于多孔培养板中,置含5% CO2，95%空气孵箱中,37℃孵育24h。对照组皆以RPMI-1640 完全培养基替代，实验组中加测试药物 等处理因素，皆以RPMI-1640完全培养基溶解和稀释。
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1.4 PKC活性测定
1.4.1 胞浆及膜性PKC的制备 参考文献方法[8]。培养的细胞体系中加入200 μl PKC提取液，内含：Tris-HCl(pH 7.4) 20 mmol.L-1, DTT 2 mmol.L-1, EDTA 2 mmol.L-1, Leupetin 200 μg，PMSF 1 mmol.L-1, Sucrose 200 mmol.L-1，冰浴下超声粉碎。900×g离心5 min，去除碎片和胞核，得上清即为胞浆组分和膜性组分，以此用于测定PKC总活力。上清液经100 000×g离心60 min，上清即为胞浆组分；残渣重悬于含0.5% Triton X-100的PKC提取液中，100 000×g离心60 min，上清即为膜性组分。以上操作皆于4℃以下进行。
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1.4.2 PKC活性测定 按文献方法采用反相离子对高效液相色谱法测定[8]。PKC反应体系中包括PKC反应液，内含:Tris-HCl(pH 7.4)20 mmol.L-1,PS 100 mg.L-1，DG 10 mg.L-1，MgCl2 10 mmol.L-1,CaCl2 1 mmol.L-1,Histone(Ⅲ-s) 1 mg.L-1，DTT 1 mmol.L-1，ATP 0.5 mmol.L-1和适量酶液(按蛋白含量计)，反应总体积为1 ml。先将除酶液以外的其它溶液混匀，30℃预热5 min，再加入酶液起始反应。反应开始后于30℃水浴摇床中准确保温10 min,立即置于沸水浴中1 min 终止反应；冷却后离心除去蛋白沉淀，上清液中加入1 ml氯仿∶甲醇(2∶1,V/V)混合物,振荡1 min,抽提脂溶性物质,2 000×g离心5 min；小心吸出水层，其中含ATP、ADP和AMP。重复前步骤处理一次，合并提取液，低温冻存待测。
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1.4.3 蛋白含量测定 按Lowry法测定。
1.4.4 PKC活力定义 一个酶活力单位相当于每分钟使组蛋白Histone(Ⅲ-s)磷酸化而消耗1 nmol ATP所需的酶量。
2 结果
2.1 GLB7对MΦ中PKC总活力的影响 以40 mg.L-1 GLB7与MΦ一起孵育不同时间后，测定PKC总活力。结果显示：GLB7可明显促进小鼠腹腔MΦ中PKC总活力的升高，30 min达到峰值,至2 h恢复到基础水平(表1)。实验测得PKC的基础总活力为(197.46±10.23)μmol.min-1.g-1 (n=6)。
Tab 1 Effect of ganoderma polysacchrides(GLB7)on PKC activity
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in murine peritoneal macrophages(X±s，n=6)
Time
/min
PKC total act ivity/μmol.min-1.g-1
GLB7(40 mg.L-1)
Control
10
488.73±12.34**
199.12±9.78
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20
694.72±14.56**
201.08±10.03
30
801.44±21.64**
197.97±8.74
40
530.71±19.61**
198.13±7.41
60
298.47±14.21*
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198.74±11.21
120
199.58±10.24
197.01±12.11
240
196.78±9.78
197.32±8.44
*P<0.05，**P<0.01 vs control
2.2 GLB7对小鼠MΦ中胞浆和胞膜PKC活性的影响 GLB7(40 mg.L-1)与MΦ一起孵育不同时间后，分别测定MΦ中胞浆和膜性组分PKC活力,发现30 min时，膜性PKC活性达峰值，而胞浆PKC活性达谷值，至2 h皆恢复至基础水平。说明GLB7在活化MΦ内PKC过程中发生膜浆转位(图1)。胞浆和胞膜基础水平分别为(113.44±5.71)μmol.min-1.g-1 和(62.65±2.85) μmol.min-1.g-1(n=6)。
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Fig 1 Effect of ganoderma polysacchrides(GLB7)
on PKC activity in the cytosol and membrance fractions
in murine peritoneal macrophages(n=6,X±s)
○-○：cytosol fraction；●-●：membrance fractions
2.3 GLB7拮抗staurosporine对MΦ中PKC的抑制作用 分别以40 mg.L-1 GLB7和其与staurosporine(10 μmol.L-1)的混合物一起孵育不同时间后，测定MΦ中PKC活力，发现GLB7可明显拮抗staurosporine对MΦ中PKC的抑制作用(图2)。
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Fig 2 Effect of Ganoderma polysacchrides(GLB7)on
the effect of staurosporine on PKC activity in murine
peritoneal macrophages(
±s, n=6)○-○：staurosporine；●-●：staurosporine + GLB7；▲-▲：control
3 讨论
PKC是一种Ca2+和磷脂依赖性激酶,通过催化多种靶蛋白发生磷酸化反应,完成细胞对外源性信号的应答。PKC主要以非活性形式存在于胞浆部分，以活性形式结合于细胞膜。当胞内PKC激活时,会发生质膜转位。PKC的活化有多条途径，最主要的途径是接受外来信息后产生DG，DG再活化PKC。PKC活性形式即是PKC、DG、磷脂和Ca2+组成的复合物。Staur osporine是PKC抑制剂，作用于PKC催化结构域[9,10]。
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本实验中，灵芝多糖能明显增强小鼠腹腔MΦ中PKC的活力,使之发生质膜转位,并拮抗staurosporine对MΦ中PKC活性的抑制。从GLB7拮抗staurosporine的情况看,GLB7活化小鼠MΦ中PKC的靶点应该在其催化区域，这和佛波醇脂(PMA)的作用位点不同。提示GLB7活化MΦ中PKC的机制不同于PMA，亦即GLB7不是直接作用于PKC受体。说明其影响MΦ信号传递过程中，增强PKC活性是其发挥作用的下游事件，这与其增强PKC活性的表达时间相吻合。 PKC的活化是激活MΦ的必备条件。因此，增强MΦ PKC活性是灵芝多糖发挥免疫增强作用的重要途径。
*国家自然科学基金资助项目，No 39400165
Project supported by the National Natural Science Foundation of China, No 39400165
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作者简介：李明春，男，34岁，药理学硕士，主管药师；
雷林生，男，39岁，药理学博士，教授，教研室主任
李明春(中国人民解放军401医院药剂科，青岛 266071)
雷林生(第一军医大学药理学教研室，广州 510515)
梁东升(中国人民解放军401医院药剂科，青岛 266071)
许自明(中国人民解放军401医院药剂科，青岛 266071)
杨淑琴(第一军医大学药理学教研室，广州 510515)
孙莉莎(第一军医大学药理学教研室，广州 510515)
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参考文献
1，林志彬.灵芝多糖的免疫药理学研究及其意义.北京医科大学学报，1992；24(4)：271～3
2，雷林生，林志彬.灵芝多糖对混合淋巴细胞培养的影响.基础与临床，1992；12(2)：59
3，Lei LS, Lin ZHB.Effect of Ganoderma polysaccharides on T cell subpopulations and production of interleukin 2 in mixed lymphocyte response.Acta Pharmaceutica Sinica,1992;27(5):331～4
4，Lei Ls,Lin ZHB. Effect of Ganoderma polysaccharides on the activity of DNA polymerase a in spleen cells stimulated by alloantigens in mice in vitro.J Beijing Med Univ,1991;23(4):329～32
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5，李荣芷，何云庆. 灵芝抗衰老机理与活性成分灵芝多糖的化学与构效研究.北京医科大学学报，1991；23(6)：473～5
6，何庆云，李荣芷，陈 琪 et al.灵芝扶正固本有效成分灵芝多糖的化学研究.北京医科大学学报，1989；21(3)：225～7
7，鄂 征主编.组织培养技术,北京：人民卫生出版社，1993：185
8，李明春，梁东升，许自明 et al.反相离子对HPLC法测定细胞中蛋白激酶活性. 中国生化药物杂志， 1999；20(5)：233～5
9，Azzi A,Boscoboinik D,Hensey C.The protiin C family.Eur J Biochem,1992,208:547～51
10，Kolb JP,Tran PL,Abadie A et al.Intracellular signaling events associated with the induction of DNA synthesis in human B lymphocytes. Cellular Immunology,1993;146:117～29, http://www.100md.com