β射线放射损伤后胶原代谢的变化
作者：周迎会 徐岚 吴士良 张学光 陈列松
单位：周迎会 徐岚 吴士良 张学光(苏州大学基础医学部，苏州，215007)；陈列松(苏州大学附属第二医院)
关键词：β射线；放射损伤；胶原代谢
苏州医学院学报000903 摘要 目的 探讨β射线放射损伤后胶原代谢的改变情况。方法 采用直线加速器照射制作动物的β射线损伤模型，同时对NIH 3T3细胞进行β射线外照射，观察胶原总量及Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的改变；观察胶原降解酶MMPs-1活性变化；同时测定损伤后细胞因子TGF-β1、IL-6的变化情况。结果 β射线损伤后胶原总量变化不大，而Ⅰ型胶原含量下降，Ⅲ型胶原含量上升；MMPs-1活性上升；TGF-β1、IL-6表达量增加。结论 胶原代谢的变化在放射性皮肤损伤中起关键作用，TGF-β1、IL-6在损伤后胶原代谢的调控机制中起重要作用。
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中图法分类号 R977.9332
Study of Collagen Metabolism after β Radiation Injury
Zhou Yinghui, XuLan, Wu Shiliang, et al
(Department of Basic Medicine,Suzhou University,Suzhou，215007)
Abstract Objective To investigate the change of collagen metabolism and it's regulation after β radiation.Method The animal model of β radiation injury was established by the β radiation produced by the linear accelerator;and irradiated NIH 3T3 cells were studied.In the experiment the contents of total collagen,collagen type I and type Ⅲ were measured.The activity of MMPs-1 was tested.The contents of TGF-β1,IL-6 were also detected.Results After exposure to β radiation,little change was found in the content of total collagen,but the content of collagen I decreased and the content of collagen Ⅲ,MMPs-1 activity increased;the espression of TGF-β1,IL-6 increased.Conclusion The changes in the metabolism of collagen play an important role in the irradiated injury of the skin;TGF-β1 and IL-6 may be essential in the regulation of the collagen metabolism.
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Key words β-ray;radiation injury;collagen metabolism
目前，国内外对β射线皮肤烧伤的研究发现，β射线对皮肤烧伤具有三大临床特点:一为反复发作的坏死性溃疡，由此导致植皮失败，是临床上棘手的问题；二为重度烧伤晚期恶性病变，极易引发皮肤癌的问题；三为放射性烧伤会造成剧烈疼痛的问题[1]。关于创面反复溃疡难以愈合的机制，有人[2]认为可能系局部血管损伤导致微循环障碍所致；亦有人[3，4]认为，创面组织胶原纤维受损，影响了胶原代谢，阻碍了组织修复。但胶原代谢受诸多因素调控，其具体的机理仍不明了。
我们曾经进行γ射线皮肤烧伤的研究[5]，发现放射性皮肤烧伤与胶原代谢变化有关。本研究采用直线加速器照射制作动物模型，同时照射NIH 3T3成纤维细胞，从胶原代谢的改变及调控因子情况的研究着手，探讨β射线放射损伤的机制，进一步为临床β放射性烧伤的救治提供理论依据。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂 羟脯氨酸测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；TGF-β1测定试剂盒为深圳晶美生物工程有限公司产品；IL-6测定试剂盒为法国Immunotech公司产品；3H-I型胶原蛋白委托嘉定核原子研究院合成；胶原底物由苏州大学基础医学部生化教研室纯化鉴定。
1.2 实验动物及细胞 SD近交系大鼠由苏州大学基础医学部实验动物中心提供；NIH 3T3成纤维细胞由苏州大学基础医学部细胞免疫中心提供。
1.3 方法
1.3.1 实验动物分组与β射线放射损伤模型的建立 对照组(control):正常3月龄SD近交系大鼠，体重150±15g,10只；β损伤模型组(model):正常3月龄SD近交系大鼠，体重150±15g,40只，分4组，每组10只。用直线加速器进行β射线照射，剂量分别为5Gy、15Gy、30Gy、45Gy，照射后各饲养2.5个月，股动脉放血处死，分别取血、肝脏、心脏及照射处局部皮肤。
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1.3.2 血清及组织匀浆的制备 取出的血液置4℃，1h后以3000r/min冷冻离心5min，分离血清，置-20℃，进行各项指标测定。
剪下的皮肤去毛，去脂肪，用冰冻生理盐水略洗，滤纸吸干，剪一半称重，剪碎，加入1ml预冷的磷酸盐缓冲液(pH7.2),4℃过夜，次日再加1ml冷PBS，用高速分散器制成匀浆。
心脏、肝脏用冰冻生理盐水洗净血液，滤纸吸干，称重，剪碎，加入1ml预冷的PBS(pH7.2)，静置30min，再加1ml冷PBS，用高速分散器制成匀浆。
各组织匀浆分别用冷冻离心机3500r/min离心10min，上清液贮于-20℃，进行各项指标测定。
1.3.3 实验细胞的处理 本校细胞免疫中心提供的NIH 3T3细胞，至对数生长期，β射线照射，分对照组(0Gy)、5Gy组、10Gy组及15Gy组。照射后继续培养，次日胰酶消化处理，收取细胞及其上清液，置-20℃。进行各项指标测定前，将细胞用含Triton X-100的细胞裂解液处理，再进行测定。共作8批。
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1.3.4 测定方法
1.3.4.1 Ⅰ、Ⅲ型胶原的测定 取辐射部位皮肤，以Nagai[6]方法，用0.15mol/L pH3.5的柠檬酸盐缓冲液抽提酸溶性胶原，其中主要含有I型和Ⅲ型胶原，然后用溶于0.01mol/L乙酸的胃蛋白酶(4500U/mg)处理24h，去除非胶原蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[7]。
样品溶解液含50%甘油配制的0.05%溴酚蓝1滴、4mol/L尿素、1%SDS缓冲液，100℃处理样品3min。点样量30～100μl,蛋白含量每孔约10～30μg。电泳缓冲液为pH8.8、0.05mol/L Tris-Gly，染色，脱色后以岛津CS-930双波长扫描仪扫描并记录曲线，计算迁移率并计算、比较含量及比例。
1.3.4.2 皮肤胶原总量的测定 按测定试剂盒说明书测定皮肤中羟脯氨酸的含量。根据羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色的原理，根据其呈色的深浅推算羟脯氨酸的含量，按公式求出被测样品的羟脯氨酸的含量，单位为羟脯氨酸μg/mg。计算公式如下。
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再由羟脯氨酸含量折算出皮肤中总胶原含量，公式为：
1.3.4.3 受照组织及细胞基质金属蛋白酶-1活性的测定 取细胞、皮肤作为测试样本，加入3H-I型胶原蛋白共同温浴后，以3H-I型胶原蛋白降解的量(以液闪仪计数cpm值代表)表示酶活性。1h降解1μg3H-I型胶原蛋白为1个酶活性单位。
计算公式为：
1.3.4.4 TGF-β1含量测定[8] 采用双抗体夹心ELISA法按试剂盒说明书测定样本中TGF-β1含量。操作步骤如下：(1)制作标准曲线的标准品浓度依此为0、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000pg/ml。(2)每个标准品和标本的OD值减去零孔的OD值。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，作标准曲线。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
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1.3.4.5 IL-6的测定[8] 采用双抗体夹心ELISA法按试剂盒说明书测定血清、皮肤及细胞上清中IL-6含量。制作标准曲线的标准品浓度依次为0、3.9、15.6、62.5、250、1000pg/ml。
1.3.4.6 统计学处理 各数据均以
±s表示，Excel进行ANOVA检验。
2 结果
2.1 β射线损伤模型的建立 采用电子直线加速器成功地建立了SD近交系大鼠的β损伤模型，其中45Gy产生Ⅱ°以上溃疡创面，为进一步利用此动物模型打下了基础。
2.2 β射线损伤对Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及胶原总量的影响 从表1、图la、图lb可见，β损伤引起了Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量的显著变化，而胶原总量的变化则不大。图2显示Ⅰ型胶原的含量随辐射剂量的增加呈下降的趋势，而Ⅲ型胶原则呈上升的趋势。
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2.3 β射线损伤对基质金属蛋白酶-1活性的影响 在低剂量范围内(0～30Gy),MMPs-1的活性随照射剂量而上升，而高于一定剂量时，45Gy组显示MMPs-1活性反而下降，但仍高于正常组。β射线损伤对细胞的影响为：基本呈上升的趋势，但5Gy和10Gy组差别不大(表2，图3)。表1 不同剂量β辐射对胶原含量的影响(μg/mg,±s)
0Gy
5Gy
10Gy
15Gy
30Gy
45Gy
P值
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Ⅰ型胶原
1.43±0.10
1.01±0.08
-
0.86±0.07
0.67±0.07
0.43±0.04
<0.01
Ⅲ型胶原
0.17±0.01
0.31±0.08
-
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0.38±0.02
0.32±0.01
0.44±0.00
<0.01
胶原总量
4.93±1.31
4.79±0.74
-
4.26±0.79
4.89±0.42
4.10±0.20
>0.05
, 百拇医药
表2 不同剂量β辐射对MMPs-1活性的影响(±s)
0Gy
5Gy
10Gy
15Gy
30Gy
45Gy
P值
细胞(U/ml)
11.34±1.54
15.43±1.67
, 百拇医药
14.92±2.07
22.44±3.23
-
-
<0.01
皮肤(U/mg)
16.03±2.06
22.46±2.54
-
25.37±1.94
31.54±4.61
26.21±2.33
, 百拇医药
<0.01
2.4 β射线损伤对TGF-β1含量的影响 β射线损伤对受照动物的皮肤、血清及受照细胞上清液中TGF-β1含量的影响显著，心脏、肝脏中TGF-β1含量的变化不显著，细胞中TGF-β1的表达低于检测水平(表3)。皮肤中TGF-β1在0～30Gy时，基本呈上升趋势，30Gy和45Gy间基本持平(图4a)，血清中TGF-β1的变化情况与皮肤基本相似，但45Gy时下降；受照细胞上清液中TGF-β1的变化情况为：0～10Gy时上升，10Gy、15Gy间上升趋势减弱(图4b)。
2.5 β射线损伤对IL-6含量的影响 受照细胞的IL-6含量低于检测水平，β射线损伤对细胞上清液及受照动物皮肤、血清的IL-6均有显著影响(表4)。0～30Gy时，皮肤和血清的IL-6基本呈上升趋势，30～45Gy时基本持平。细胞上清液中IL-6亦呈上升趋势，只是在30～45Gy时上升趋势有所减弱(图5)。表3 不同剂量β辐射对TGF-β1含量的影响(±s)
, 百拇医药
0Gy
5Gy
10Gy
15Gy
30Gy
45Gy
P值
细胞上清(pg/ml)
668.97±6.94
689.51±32.38
853.19±35.76
885.26±40.53
, 百拇医药
-
-
<0.01
血清(pg/ml)
2029.44±310.91
2161.33±294.39
-
2475.00±411.30
2775.00±287.23
2425.00±275.38
<0.01
皮肤(pg/mg)
, 百拇医药
28.27±2.40
35.70±4.77
-
52.31±3.12
59.39±2.17
60.09±2.37
<0.01
肝脏(pg/mg)
0.50±0.08
1.27±0.62
-
1.01±0.32
, 百拇医药
0.83±0.57
1.20±0.40
>0.05
心脏(pg/mg)
2.02±0.23
1.80±0.01
-
1.96±0.07
1.47±0.47
1.95±0.93
>0.05
表4 不同剂量β辐射对IL-6含量的影响(±s)
, 百拇医药
0Gy
5Gy
10Gy
15Gy
30Gy
45Gy
P值
细胞上清(pg/ml)
77.03±5.28
98.53±6.87
112.42±4.97
117.92±3.94
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-
-
<0.01
皮肤(pg/mg)
23.75±2.21
34.67±1.87
-
43.76±3.64
53.48±3.14
51.79±5.28
<0.01
血清(pg/ml)
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204.40±6.08
210.66±11.57
-
227.64±8.45
238.24±6.67
234.85±6.06
<0.01
图1a 皮肤胶原变化的SDS-PAGE分析
图1b 皮肤胶原含量变化的扫描分析
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图2 β辐射对胶原含量的影响
图3 β辐射对MMPs-1活性的影响
图4a β辐射对皮肤,心脏,肝脏TGF-β1含量的影响
图4b β辐射对血清,细胞上清TGF-β1含量的影响
图5 β辐射对IL-6含量的影响
3 讨论
, 百拇医药
本研究进一步证实，放射性皮肤损伤引起胶原含量的变化，且与受照剂量相关。在人体内胶原具有不同类型，皮肤含有Ⅰ、Ⅲ型和少见的Ⅴ型等几种型别，在成年动物或人类皮肤中，占70%左右的为Ⅰ型胶原，仅在胎儿期及创面受损或愈合时才会有较多的Ⅲ型胶原的合成[9]。放射性皮肤损伤对胶原总量的影响不大，主要影响了Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量，其基本趋势为：Ⅰ型含量下降，而Ⅲ型含量上升。同时，基质金属蛋白酶-1活性有所变化，提示两者之间有相关性。MMPs-1是胶原降解的主要酶，由成纤维细胞及血管内皮细胞分泌，其最适底物是Ⅰ型胶原，对Ⅲ型胶原也有作用。β射线损伤后，Ⅰ型胶原被降解，Ⅲ型胶原也有所降解，但一方面MMPs降解Ⅰ型胶原的速率大于Ⅲ型；另一方面，已有人证实创伤修复过程中，Ⅲ型胶原即胎儿型胶原会大量合成[10]。本实验提示，Ⅲ型胶原在创面修复期的合成超过了MMPs-1对其的降解。受照动物心脏、肝脏的TGF-β1含量的变化不显著，而皮肤、血清中的TGF-β1含量则有显著变化，这一结果提示，直线加速器造成的β射线损伤主要效应只是在受照的局部组织及全身血液。从皮肤的TGF-β1含量变化可见，5Gy、15Gy、30Gy剂量组之间基本呈上升的趋势，而30Gy、45Gy的剂量组之间变化不大，可能在低剂量组时，TGF-β1的表达是与剂量率呈正相关的，剂量率高于一定水平时，TGF-β1的表达则稳定在某一水平。再从辐射对NIH 3T3细胞的影响看，细胞中TGF-β1的表达量低于检测水平，细胞上清液的TGF-β1的表达量很多，验证了TGF-β1为一膜外分泌型蛋白。细胞上清的TGF-β1的变化与受照动物的情况相符，低剂量(0～10Gy)时，TGF-β1表达呈上升趋势，而高于一定水平时(10～15Gy),基本持平。IL-6水平的变化不如TGF-β1的改变显著，但其趋势基本一致。损伤引起较多的Ⅲ型胶原蛋白的合成，即主要影响了可溶性胶原特别是Ⅲ型胶原的含量，而对已成熟并老化交联的不溶性胶原影响不大。由此表明，胶原代谢的变化在放射性皮肤损伤中起到了关键作用。那么这种改变的机制如何?值得进一步探讨。有报道[11～16]认为，与TGF-β、IL-6等细胞因子有关。亦有人[17，18]认为与TGF-β的类型转换有关。还有人[19]认为与TGF的关系不大。我们的实验结果表明，TGF-β、IL-6等细胞因子与胶原代谢的调控有一定关系，但其调控在辐射后的应激反应、炎症反应及后期的慢性纤维化过程中到底有何作用，将是我们今后研究的一个方向。
, 百拇医药
国防科工委国防预研基金课题(编号Y6920026-04)
参考文献
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2000年7月14日收稿, 百拇医药
单位：周迎会 徐岚 吴士良 张学光(苏州大学基础医学部，苏州，215007)；陈列松(苏州大学附属第二医院)
关键词：β射线；放射损伤；胶原代谢
苏州医学院学报000903 摘要 目的 探讨β射线放射损伤后胶原代谢的改变情况。方法 采用直线加速器照射制作动物的β射线损伤模型，同时对NIH 3T3细胞进行β射线外照射，观察胶原总量及Ⅰ、Ⅲ型胶原含量的改变；观察胶原降解酶MMPs-1活性变化；同时测定损伤后细胞因子TGF-β1、IL-6的变化情况。结果 β射线损伤后胶原总量变化不大，而Ⅰ型胶原含量下降，Ⅲ型胶原含量上升；MMPs-1活性上升；TGF-β1、IL-6表达量增加。结论 胶原代谢的变化在放射性皮肤损伤中起关键作用，TGF-β1、IL-6在损伤后胶原代谢的调控机制中起重要作用。
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中图法分类号 R977.9332
Study of Collagen Metabolism after β Radiation Injury
Zhou Yinghui, XuLan, Wu Shiliang, et al
(Department of Basic Medicine,Suzhou University,Suzhou，215007)
Abstract Objective To investigate the change of collagen metabolism and it's regulation after β radiation.Method The animal model of β radiation injury was established by the β radiation produced by the linear accelerator;and irradiated NIH 3T3 cells were studied.In the experiment the contents of total collagen,collagen type I and type Ⅲ were measured.The activity of MMPs-1 was tested.The contents of TGF-β1,IL-6 were also detected.Results After exposure to β radiation,little change was found in the content of total collagen,but the content of collagen I decreased and the content of collagen Ⅲ,MMPs-1 activity increased;the espression of TGF-β1,IL-6 increased.Conclusion The changes in the metabolism of collagen play an important role in the irradiated injury of the skin;TGF-β1 and IL-6 may be essential in the regulation of the collagen metabolism.
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目前，国内外对β射线皮肤烧伤的研究发现，β射线对皮肤烧伤具有三大临床特点:一为反复发作的坏死性溃疡，由此导致植皮失败，是临床上棘手的问题；二为重度烧伤晚期恶性病变，极易引发皮肤癌的问题；三为放射性烧伤会造成剧烈疼痛的问题[1]。关于创面反复溃疡难以愈合的机制，有人[2]认为可能系局部血管损伤导致微循环障碍所致；亦有人[3，4]认为，创面组织胶原纤维受损，影响了胶原代谢，阻碍了组织修复。但胶原代谢受诸多因素调控，其具体的机理仍不明了。
我们曾经进行γ射线皮肤烧伤的研究[5]，发现放射性皮肤烧伤与胶原代谢变化有关。本研究采用直线加速器照射制作动物模型，同时照射NIH 3T3成纤维细胞，从胶原代谢的改变及调控因子情况的研究着手，探讨β射线放射损伤的机制，进一步为临床β放射性烧伤的救治提供理论依据。
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1 材料和方法
1.1 主要试剂 羟脯氨酸测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；TGF-β1测定试剂盒为深圳晶美生物工程有限公司产品；IL-6测定试剂盒为法国Immunotech公司产品；3H-I型胶原蛋白委托嘉定核原子研究院合成；胶原底物由苏州大学基础医学部生化教研室纯化鉴定。
1.2 实验动物及细胞 SD近交系大鼠由苏州大学基础医学部实验动物中心提供；NIH 3T3成纤维细胞由苏州大学基础医学部细胞免疫中心提供。
1.3 方法
1.3.1 实验动物分组与β射线放射损伤模型的建立 对照组(control):正常3月龄SD近交系大鼠，体重150±15g,10只；β损伤模型组(model):正常3月龄SD近交系大鼠，体重150±15g,40只，分4组，每组10只。用直线加速器进行β射线照射，剂量分别为5Gy、15Gy、30Gy、45Gy，照射后各饲养2.5个月，股动脉放血处死，分别取血、肝脏、心脏及照射处局部皮肤。
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1.3.2 血清及组织匀浆的制备 取出的血液置4℃，1h后以3000r/min冷冻离心5min，分离血清，置-20℃，进行各项指标测定。
剪下的皮肤去毛，去脂肪，用冰冻生理盐水略洗，滤纸吸干，剪一半称重，剪碎，加入1ml预冷的磷酸盐缓冲液(pH7.2),4℃过夜，次日再加1ml冷PBS，用高速分散器制成匀浆。
心脏、肝脏用冰冻生理盐水洗净血液，滤纸吸干，称重，剪碎，加入1ml预冷的PBS(pH7.2)，静置30min，再加1ml冷PBS，用高速分散器制成匀浆。
各组织匀浆分别用冷冻离心机3500r/min离心10min，上清液贮于-20℃，进行各项指标测定。
1.3.3 实验细胞的处理 本校细胞免疫中心提供的NIH 3T3细胞，至对数生长期，β射线照射，分对照组(0Gy)、5Gy组、10Gy组及15Gy组。照射后继续培养，次日胰酶消化处理，收取细胞及其上清液，置-20℃。进行各项指标测定前，将细胞用含Triton X-100的细胞裂解液处理，再进行测定。共作8批。
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1.3.4 测定方法
1.3.4.1 Ⅰ、Ⅲ型胶原的测定 取辐射部位皮肤，以Nagai[6]方法，用0.15mol/L pH3.5的柠檬酸盐缓冲液抽提酸溶性胶原，其中主要含有I型和Ⅲ型胶原，然后用溶于0.01mol/L乙酸的胃蛋白酶(4500U/mg)处理24h，去除非胶原蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳[7]。
样品溶解液含50%甘油配制的0.05%溴酚蓝1滴、4mol/L尿素、1%SDS缓冲液，100℃处理样品3min。点样量30～100μl,蛋白含量每孔约10～30μg。电泳缓冲液为pH8.8、0.05mol/L Tris-Gly，染色，脱色后以岛津CS-930双波长扫描仪扫描并记录曲线，计算迁移率并计算、比较含量及比例。
1.3.4.2 皮肤胶原总量的测定 按测定试剂盒说明书测定皮肤中羟脯氨酸的含量。根据羟脯氨酸在氧化剂的作用下所产生的氧化产物与二甲氨基苯甲醛作用呈现紫红色的原理，根据其呈色的深浅推算羟脯氨酸的含量，按公式求出被测样品的羟脯氨酸的含量，单位为羟脯氨酸μg/mg。计算公式如下。
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再由羟脯氨酸含量折算出皮肤中总胶原含量，公式为：
1.3.4.3 受照组织及细胞基质金属蛋白酶-1活性的测定 取细胞、皮肤作为测试样本，加入3H-I型胶原蛋白共同温浴后，以3H-I型胶原蛋白降解的量(以液闪仪计数cpm值代表)表示酶活性。1h降解1μg3H-I型胶原蛋白为1个酶活性单位。
计算公式为：
1.3.4.4 TGF-β1含量测定[8] 采用双抗体夹心ELISA法按试剂盒说明书测定样本中TGF-β1含量。操作步骤如下：(1)制作标准曲线的标准品浓度依此为0、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000pg/ml。(2)每个标准品和标本的OD值减去零孔的OD值。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，作标准曲线。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
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1.3.4.5 IL-6的测定[8] 采用双抗体夹心ELISA法按试剂盒说明书测定血清、皮肤及细胞上清中IL-6含量。制作标准曲线的标准品浓度依次为0、3.9、15.6、62.5、250、1000pg/ml。
1.3.4.6 统计学处理 各数据均以
±s表示，Excel进行ANOVA检验。2 结果
2.1 β射线损伤模型的建立 采用电子直线加速器成功地建立了SD近交系大鼠的β损伤模型，其中45Gy产生Ⅱ°以上溃疡创面，为进一步利用此动物模型打下了基础。
2.2 β射线损伤对Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及胶原总量的影响 从表1、图la、图lb可见，β损伤引起了Ⅰ型和Ⅲ型胶原含量的显著变化，而胶原总量的变化则不大。图2显示Ⅰ型胶原的含量随辐射剂量的增加呈下降的趋势，而Ⅲ型胶原则呈上升的趋势。
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2.3 β射线损伤对基质金属蛋白酶-1活性的影响 在低剂量范围内(0～30Gy),MMPs-1的活性随照射剂量而上升，而高于一定剂量时，45Gy组显示MMPs-1活性反而下降，但仍高于正常组。β射线损伤对细胞的影响为：基本呈上升的趋势，但5Gy和10Gy组差别不大(表2，图3)。表1 不同剂量β辐射对胶原含量的影响(μg/mg,
±s)0Gy
5Gy
10Gy
15Gy
30Gy
45Gy
P值
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Ⅰ型胶原
1.43±0.10
1.01±0.08
-
0.86±0.07
0.67±0.07
0.43±0.04
<0.01
Ⅲ型胶原
0.17±0.01
0.31±0.08
-
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0.38±0.02
0.32±0.01
0.44±0.00
<0.01
胶原总量
4.93±1.31
4.79±0.74
-
4.26±0.79
4.89±0.42
4.10±0.20
>0.05
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表2 不同剂量β辐射对MMPs-1活性的影响(
±s)0Gy
5Gy
10Gy
15Gy
30Gy
45Gy
P值
细胞(U/ml)
11.34±1.54
15.43±1.67
, 百拇医药
14.92±2.07
22.44±3.23
-
-
<0.01
皮肤(U/mg)
16.03±2.06
22.46±2.54
-
25.37±1.94
31.54±4.61
26.21±2.33
, 百拇医药
<0.01
2.4 β射线损伤对TGF-β1含量的影响 β射线损伤对受照动物的皮肤、血清及受照细胞上清液中TGF-β1含量的影响显著，心脏、肝脏中TGF-β1含量的变化不显著，细胞中TGF-β1的表达低于检测水平(表3)。皮肤中TGF-β1在0～30Gy时，基本呈上升趋势，30Gy和45Gy间基本持平(图4a)，血清中TGF-β1的变化情况与皮肤基本相似，但45Gy时下降；受照细胞上清液中TGF-β1的变化情况为：0～10Gy时上升，10Gy、15Gy间上升趋势减弱(图4b)。
2.5 β射线损伤对IL-6含量的影响 受照细胞的IL-6含量低于检测水平，β射线损伤对细胞上清液及受照动物皮肤、血清的IL-6均有显著影响(表4)。0～30Gy时，皮肤和血清的IL-6基本呈上升趋势，30～45Gy时基本持平。细胞上清液中IL-6亦呈上升趋势，只是在30～45Gy时上升趋势有所减弱(图5)。表3 不同剂量β辐射对TGF-β1含量的影响(
±s), 百拇医药
0Gy
5Gy
10Gy
15Gy
30Gy
45Gy
P值
细胞上清(pg/ml)
668.97±6.94
689.51±32.38
853.19±35.76
885.26±40.53
, 百拇医药
-
-
<0.01
血清(pg/ml)
2029.44±310.91
2161.33±294.39
-
2475.00±411.30
2775.00±287.23
2425.00±275.38
<0.01
皮肤(pg/mg)
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28.27±2.40
35.70±4.77
-
52.31±3.12
59.39±2.17
60.09±2.37
<0.01
肝脏(pg/mg)
0.50±0.08
1.27±0.62
-
1.01±0.32
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0.83±0.57
1.20±0.40
>0.05
心脏(pg/mg)
2.02±0.23
1.80±0.01
-
1.96±0.07
1.47±0.47
1.95±0.93
>0.05
表4 不同剂量β辐射对IL-6含量的影响(
±s), 百拇医药
0Gy
5Gy
10Gy
15Gy
30Gy
45Gy
P值
细胞上清(pg/ml)
77.03±5.28
98.53±6.87
112.42±4.97
117.92±3.94
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-
-
<0.01
皮肤(pg/mg)
23.75±2.21
34.67±1.87
-
43.76±3.64
53.48±3.14
51.79±5.28
<0.01
血清(pg/ml)
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204.40±6.08
210.66±11.57
-
227.64±8.45
238.24±6.67
234.85±6.06
<0.01
图1a 皮肤胶原变化的SDS-PAGE分析
图1b 皮肤胶原含量变化的扫描分析
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图2 β辐射对胶原含量的影响
图3 β辐射对MMPs-1活性的影响
图4a β辐射对皮肤,心脏,肝脏TGF-β1含量的影响
图4b β辐射对血清,细胞上清TGF-β1含量的影响
图5 β辐射对IL-6含量的影响
3 讨论
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本研究进一步证实，放射性皮肤损伤引起胶原含量的变化，且与受照剂量相关。在人体内胶原具有不同类型，皮肤含有Ⅰ、Ⅲ型和少见的Ⅴ型等几种型别，在成年动物或人类皮肤中，占70%左右的为Ⅰ型胶原，仅在胎儿期及创面受损或愈合时才会有较多的Ⅲ型胶原的合成[9]。放射性皮肤损伤对胶原总量的影响不大，主要影响了Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量，其基本趋势为：Ⅰ型含量下降，而Ⅲ型含量上升。同时，基质金属蛋白酶-1活性有所变化，提示两者之间有相关性。MMPs-1是胶原降解的主要酶，由成纤维细胞及血管内皮细胞分泌，其最适底物是Ⅰ型胶原，对Ⅲ型胶原也有作用。β射线损伤后，Ⅰ型胶原被降解，Ⅲ型胶原也有所降解，但一方面MMPs降解Ⅰ型胶原的速率大于Ⅲ型；另一方面，已有人证实创伤修复过程中，Ⅲ型胶原即胎儿型胶原会大量合成[10]。本实验提示，Ⅲ型胶原在创面修复期的合成超过了MMPs-1对其的降解。受照动物心脏、肝脏的TGF-β1含量的变化不显著，而皮肤、血清中的TGF-β1含量则有显著变化，这一结果提示，直线加速器造成的β射线损伤主要效应只是在受照的局部组织及全身血液。从皮肤的TGF-β1含量变化可见，5Gy、15Gy、30Gy剂量组之间基本呈上升的趋势，而30Gy、45Gy的剂量组之间变化不大，可能在低剂量组时，TGF-β1的表达是与剂量率呈正相关的，剂量率高于一定水平时，TGF-β1的表达则稳定在某一水平。再从辐射对NIH 3T3细胞的影响看，细胞中TGF-β1的表达量低于检测水平，细胞上清液的TGF-β1的表达量很多，验证了TGF-β1为一膜外分泌型蛋白。细胞上清的TGF-β1的变化与受照动物的情况相符，低剂量(0～10Gy)时，TGF-β1表达呈上升趋势，而高于一定水平时(10～15Gy),基本持平。IL-6水平的变化不如TGF-β1的改变显著，但其趋势基本一致。损伤引起较多的Ⅲ型胶原蛋白的合成，即主要影响了可溶性胶原特别是Ⅲ型胶原的含量，而对已成熟并老化交联的不溶性胶原影响不大。由此表明，胶原代谢的变化在放射性皮肤损伤中起到了关键作用。那么这种改变的机制如何?值得进一步探讨。有报道[11～16]认为，与TGF-β、IL-6等细胞因子有关。亦有人[17，18]认为与TGF-β的类型转换有关。还有人[19]认为与TGF的关系不大。我们的实验结果表明，TGF-β、IL-6等细胞因子与胶原代谢的调控有一定关系，但其调控在辐射后的应激反应、炎症反应及后期的慢性纤维化过程中到底有何作用，将是我们今后研究的一个方向。
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国防科工委国防预研基金课题(编号Y6920026-04)
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2000年7月14日收稿, 百拇医药