OCIF/OPG的研究进展
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国外医学内分泌学分册 2000年1月第20卷第1期
OCIF/OPG的研究进展
李晓佳 安振梅(综述) 魏松全(审校)
华西医科大学第一附属医院内分泌科，四川成都 610041
摘 要 破骨细胞生成抑制因子(OCIF)/骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是一种新发现的以可溶性蛋白质形式存在的破骨细胞负性调节因子，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，其配基ODF/OPGL被证明是破骨细胞分化因子，OCIF/OPG可与其配基结合阻断其配基的信号下传而抑制破骨细胞生成、活化，其它骨吸收调节因子可能部分或全部通过调节OCIF/OPG生成而发挥作用。该因子的发现，为探讨骨质疏松的发病机制及其预防和治疗提出了新方向。
关键词：OCIF/OPG 破骨细胞 ODF/OPGL 骨质疏松
, 百拇医药
正常的骨再建过程依赖于骨吸收和骨形成过程的动态平衡，而这一过程又分别与破骨细胞(OC)和成骨细胞(0B)的功能密切相关。任何因素引起的OC生成增多或过度活化都可以使OC的功能亢进，骨吸收超过骨形成，从而引起骨丢失导致骨质疏松。OC来源于造血前体细胞，如集落形成单位——粒细胞巨噬细胞系(CFU-GM)或单核细胞系。体外研究证明，骨吸收刺激因子通过3条信号传导通路刺激OB或骨髓基质细胞产生破骨细胞分化因子(ODF)：VitD受体[1，25(OH)2D3]通路；蛋白激酶A途径[甲状旁腺素(PTH)、前列腺素(PG)E2]；gp130通路[白细胞介素(IL)-6、IL-11]。而破骨前体细胞的形成、发育和成熟是OB调节的结果，OB分泌细胞因子如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和与OC前体细胞接触必不可少。
1997年，Tsuda等[1]在人胚胎成纤维细胞IMR-90的培养基里发现了一种细胞因子，它能特异地抑制上述刺激OB的3种传导通路，抑制破骨细胞生成，命名为破骨细胞生成抑制因子(OCIF)。同年，Simonet等[2]报道新发现一种参与骨密度调节的分泌性蛋白质——骨保护素(osteoprotegerin ,OPG)，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，能抑制OC生成。动物实验研究证实OPG能抑制OC生成并阻断OC的病理性增生、活化。推断并分析OCIF和OPG的氨基酸序列，证实两者是同一种蛋白[3]。OCIF/OPG是OC调控中一种新的负性调节因子。以下就其研究进展综述如下。
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1 OCIF/OPG及其基因的结构和功能
部分氨基酸测序分析证实OCIF是一种糖蛋白，有单聚体和由二硫键接连的同源二聚体两种形式，分子量分别为60ku和120ku[1]。其它的研究证实OCIF/OPG共有401个氨基酸(aa)残基，含7个结构域(D1-7)和一个由21个aa残基构成的信号肽。N端D1-4(22-179aa)富含半胱氨酸(cys)，与TNF-R家族其它成员的胞外域一样参与配基的结合。D5-6为两个紧密串联的“死亡域”[death domain homologous regions(DDH)]，类似于TNFR超家族中调节细胞凋亡的几种成员：TNFR1、Fas等，不同的是TNFR1、Fas等仅含一个DDH，D7参与结合肝素和形成二聚体。OCIF/OPG不含跨膜域，以可溶性蛋白质形成分泌入培养基中[2～5]。可见，OCIF/OPG属TNF-R超家族，但又具备其自身独有的特征。
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人OCIF/OPG基因是单拷贝序列，全长29kb，编码5个外显子。外显子、内含子交界符合GT/AG的规律。第一外显子与信号肽的编码有关。第二外显子编码D1、2和D3的73%的氨基酸。第三外显子编码D3的剩余部分和完整的D4。第四外显子和第五外显子5'端的225bp有同源性，提示外显子4是外显子的5的重复，分别编码两个“死亡域”。除此之外，还对非编码区作了大量研究，但尚未完全明确[5]。
用OCIF/OPG cDNA作探针进行Northern杂交分析，证实在成纤维细胞IMR-90存在3种mRNA，分别为2.4kb、4.2kb、6.5kb。2.4kb的mRNA不含内含子，为直接编码OCIF/OPG的模板，而4.2kb、6.5kb的mRNA是DNA的选择性剪接形式，分别含部分和全部内含子2，其存在意义尚不清楚。
Mizuno等[6]报道，OCIF/OPG基因敲掉小鼠OCIF/OPG(-/-)成年后由于破骨细胞生成增加表现为严重的骨质疏松，表明OCIF/OPG是一种重要的破骨细胞生成负性调节因子。动物实验研究显示，正常小鼠注射重组人OCIF/OPG两周后，出现了明显的骨矿物质密度(BMD)上升和骨量增加，伴随OC数量减少 ，而高表达OPG/OCIF mRNA的其它组织均未见病变，白细胞、红细胞、网织红细胞数量和血小板计数无改变，血浆和尿生化指标无异常。尽管OCIF/OPG基因在人体除外周血淋巴细胞外的所有组织中都有表达，但因外源性OCIF/OPG能特异性地作用于骨组织，所以内源性OCIF/OPG可能也仅在骨组织微环境中发挥其特异的抑制OC生成的作用[3]。
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2 OCIF/OPG的配基破骨细胞分化因子(ODF)/OPGL
TNFR家族的成员大多是Ⅰ型跨膜蛋白，其胞外域富含cys ,参与配基结合，通过蛋白酶水解或选择性剪接可获得缺失跨膜域的可溶性蛋白[8]，如可溶性Fas等能与其配基结合，但作用却是抑制Fas的调节功能[9]。以可溶性蛋白质形式存在的OCIF/OPG也是通过结合其配基来抑制阻断该配基的信号传递。这种配基分别被命名为ODF和OPGL[7, 10]。
Yasuda等[7]研究发现，体外培养的OC体系中，用1，25(OH)2D3和地塞米松刺激后的骨髓基质ST2细胞上OCIF/OPG可使OPG结合分子表达增多，并且OPG的单克隆抗体能阻断OPG与其结合。体外实验证明，在生物工程技术合成的可溶性OPG结合蛋白和M-CSF的共同作用下脾细胞可直接形成OC，而不需要OB、骨髓基质细胞的辅助作用，并且这种作用能被OPG抑制。用已知的破骨细胞形成的刺激因子：1，25(OH)2D3、PTH、PGE2、IL-11处理的颅盖OB可上调OB上这种分子mRNA的表达，可见OPG结合分子即ODF，介导了破骨细胞前体向OC分化最基本的信号传递。用1，25(OH)2D3和地塞米松刺激后的ST2细胞构建cDNA文库，并从中分离出小鼠此结合蛋白质cDNA，证实其编码316个aa。ODF为Ⅱ型跨膜蛋白，无信号肽，由24个疏水aa残基构成其跨膜域(48-71aa)，长的C端在胞外，短的N端在胞内。并证明C端165个残基在TNF配体家族成员的胞外域高度同源。Lacey等用鼠或人重组OPG与Ig GFc的融合蛋白OPG-Fc作免疫探针，同时设立空白对照、阴性对照，探查鼠类细胞系，特别是造血细胞表面的OPG配基(OPGL)，找到骨髓单核细胞系32D能表达这种分子，并证实OPGL与ODF为同一种蛋白。小鼠皮下注射重组OPGL可导致OC活化，引起高钙血症、胫骨远端骨量减少，而这些作用在体内、外均能被OPG所抑制，从而揭示在OC形成活化过程，OPGL和OPG分别是一对重要的正性、负性细胞外调节因子[7,11]。
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3 OCIF/OPG、ODF/OPGL与OC相互作用机制
已知OPG能抑制OC生成、活化，OPGL能促进OC功能，但它们在骨质微环境中与OC相互作用并未完全明确，目前可能存在以下两种途径：
3.1 竞争拮抗途径 Yasuda等[7]设想在OC前体细胞膜上存在一种ODF受体，可能也是TNFR超家族成员，1，25(OH)2D3、PTH/PGE2、IL-11/IL-6通过3条途径刺激OB或基质细胞在胞膜上表达ODF/OPGL，ODF/OPGL便能与OC前体细胞上假想的受体结合，将分化信号传到OC前体细胞使其分化成熟。而OCIF/OPG是可溶性蛋白，能竞争性结合ODF/OPGL，阻断ODF/OPGL信号下传从而抑制OC分化。
3.2 OCIF/OPG与OC凋亡 Akatsu等[11]在体外培养的OC上，用OCIF处理24h后可观察到典型的细胞凋亡现象。如再加入Caspas-3的抑制剂，则凋亡便被抑制。OCIF/OPG致凋亡的作用机制尚不清楚。虽然OPG具有与Fas相同的DDH，但该研究证明，去掉DDH的变异型OPG已足以抑制OC分化，只是其作用强度较未缺失DDH的OPG低[4, 11]。
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4 OCIF/OPG的调控
有学者认为，OCIF/OPG在OC的发生、分化发育过程中起着核心作用，其它的骨吸收调节因子可能部分或全部通过调节OPG生成这一途径而发挥作用[12]。
4.1 PGE2是促骨吸收的因子，近来被证明通过蛋白激酶A的途径使人骨髓基质细胞(hBMSC)OPG mRNA下调，从而减少OPG生成，使OPGL阻断效应减弱从而促进了OC的活化[12]。
4.2 转化生长因子(TGF)-b是骨吸收抑制剂，可抑制新破骨细胞的形成，Takai等[13]研究了骨髓基质细胞与OB的OPG mRAN调节，发现TGF-b能明显提高OPG mRNA水平，并减少OPGL mRNA转录，证明TGF-b抑制OC生成部分是通过这一途径而实现的。
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4.3 Hofbauer[14]对人类3种OB系[人胚胎成骨细胞系(hFOB)、人成骨细胞系(hOB)、人骨髓基质细胞系(hMS)]OPG mRNA的水平研究显示，1，25(OH)2D3增加hFOB、hOB的OPG mRNA转录和蛋白质产生，但未发现1，25(OH)2D3对hMS细胞系OPG mRNA表达有任何影响，从而说明成熟的OB而非OB前体细胞能对1，25(OH)2D3发生反应，OPG的表达可能与OB的分化状态有关。
4.4 骨形态发生蛋白-2(BMP-2)是一种高效的骨诱导物质，可促进骨基质的形成和钙化。BMP-2仅增加hFOB的OPG mRNA水平[14]，可能与hFOB的来源有关，因在胚胎发生中BMP-2的量最多且与器官形成关系最密切。另外，BMP-2能促进OB前体细胞向成熟OB转化，故BMP-2间接调节OC生成。
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4.5 在体外TNF-α、IL-1β有抑制骨形成和促进骨吸收的作用，经TNF-α、IL-β处理hFOB细胞后，OPG mRNA 表达持续增强并OPG蛋白质生成增多。TNF-α的生成能使可溶性TNFR蛋白生成增加，但这并不完全抵消其全身作用，IL-1β上调OPG mRNA转录。由此可见，抗骨吸收因子OPG的产生与对抗骨吸收因子INF-α，IL-1β的作用有关，并限制这些细胞因子对骨吸收的作用[14]。
综上所述，OCIF/OPG是一种新发现的重要的抑制OC发生的细胞因子，对它及其配基的研究，可进一步明确OCIF/OPG在骨质疏松中的核心作用和它与其他激素、细胞因子的关系，对深入研究OC精细调控机制具有重要意义，并为探讨骨质疏松发病机制及预防、治疗(如通过控制OPG水平)骨质疏松开辟了更广阔的领域。
作者简介：李晓佳(1974-)，女，成都人，在读硕士。
参考文献(略), http://www.100md.com
李晓佳 安振梅(综述) 魏松全(审校)
华西医科大学第一附属医院内分泌科，四川成都 610041
摘 要 破骨细胞生成抑制因子(OCIF)/骨保护素(osteoprotegerin，OPG)是一种新发现的以可溶性蛋白质形式存在的破骨细胞负性调节因子，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，其配基ODF/OPGL被证明是破骨细胞分化因子，OCIF/OPG可与其配基结合阻断其配基的信号下传而抑制破骨细胞生成、活化，其它骨吸收调节因子可能部分或全部通过调节OCIF/OPG生成而发挥作用。该因子的发现，为探讨骨质疏松的发病机制及其预防和治疗提出了新方向。
关键词：OCIF/OPG 破骨细胞 ODF/OPGL 骨质疏松
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正常的骨再建过程依赖于骨吸收和骨形成过程的动态平衡，而这一过程又分别与破骨细胞(OC)和成骨细胞(0B)的功能密切相关。任何因素引起的OC生成增多或过度活化都可以使OC的功能亢进，骨吸收超过骨形成，从而引起骨丢失导致骨质疏松。OC来源于造血前体细胞，如集落形成单位——粒细胞巨噬细胞系(CFU-GM)或单核细胞系。体外研究证明，骨吸收刺激因子通过3条信号传导通路刺激OB或骨髓基质细胞产生破骨细胞分化因子(ODF)：VitD受体[1，25(OH)2D3]通路；蛋白激酶A途径[甲状旁腺素(PTH)、前列腺素(PG)E2]；gp130通路[白细胞介素(IL)-6、IL-11]。而破骨前体细胞的形成、发育和成熟是OB调节的结果，OB分泌细胞因子如巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和与OC前体细胞接触必不可少。
1997年，Tsuda等[1]在人胚胎成纤维细胞IMR-90的培养基里发现了一种细胞因子，它能特异地抑制上述刺激OB的3种传导通路，抑制破骨细胞生成，命名为破骨细胞生成抑制因子(OCIF)。同年，Simonet等[2]报道新发现一种参与骨密度调节的分泌性蛋白质——骨保护素(osteoprotegerin ,OPG)，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员，能抑制OC生成。动物实验研究证实OPG能抑制OC生成并阻断OC的病理性增生、活化。推断并分析OCIF和OPG的氨基酸序列，证实两者是同一种蛋白[3]。OCIF/OPG是OC调控中一种新的负性调节因子。以下就其研究进展综述如下。
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1 OCIF/OPG及其基因的结构和功能
部分氨基酸测序分析证实OCIF是一种糖蛋白，有单聚体和由二硫键接连的同源二聚体两种形式，分子量分别为60ku和120ku[1]。其它的研究证实OCIF/OPG共有401个氨基酸(aa)残基，含7个结构域(D1-7)和一个由21个aa残基构成的信号肽。N端D1-4(22-179aa)富含半胱氨酸(cys)，与TNF-R家族其它成员的胞外域一样参与配基的结合。D5-6为两个紧密串联的“死亡域”[death domain homologous regions(DDH)]，类似于TNFR超家族中调节细胞凋亡的几种成员：TNFR1、Fas等，不同的是TNFR1、Fas等仅含一个DDH，D7参与结合肝素和形成二聚体。OCIF/OPG不含跨膜域，以可溶性蛋白质形成分泌入培养基中[2～5]。可见，OCIF/OPG属TNF-R超家族，但又具备其自身独有的特征。
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人OCIF/OPG基因是单拷贝序列，全长29kb，编码5个外显子。外显子、内含子交界符合GT/AG的规律。第一外显子与信号肽的编码有关。第二外显子编码D1、2和D3的73%的氨基酸。第三外显子编码D3的剩余部分和完整的D4。第四外显子和第五外显子5'端的225bp有同源性，提示外显子4是外显子的5的重复，分别编码两个“死亡域”。除此之外，还对非编码区作了大量研究，但尚未完全明确[5]。
用OCIF/OPG cDNA作探针进行Northern杂交分析，证实在成纤维细胞IMR-90存在3种mRNA，分别为2.4kb、4.2kb、6.5kb。2.4kb的mRNA不含内含子，为直接编码OCIF/OPG的模板，而4.2kb、6.5kb的mRNA是DNA的选择性剪接形式，分别含部分和全部内含子2，其存在意义尚不清楚。
Mizuno等[6]报道，OCIF/OPG基因敲掉小鼠OCIF/OPG(-/-)成年后由于破骨细胞生成增加表现为严重的骨质疏松，表明OCIF/OPG是一种重要的破骨细胞生成负性调节因子。动物实验研究显示，正常小鼠注射重组人OCIF/OPG两周后，出现了明显的骨矿物质密度(BMD)上升和骨量增加，伴随OC数量减少 ，而高表达OPG/OCIF mRNA的其它组织均未见病变，白细胞、红细胞、网织红细胞数量和血小板计数无改变，血浆和尿生化指标无异常。尽管OCIF/OPG基因在人体除外周血淋巴细胞外的所有组织中都有表达，但因外源性OCIF/OPG能特异性地作用于骨组织，所以内源性OCIF/OPG可能也仅在骨组织微环境中发挥其特异的抑制OC生成的作用[3]。
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2 OCIF/OPG的配基破骨细胞分化因子(ODF)/OPGL
TNFR家族的成员大多是Ⅰ型跨膜蛋白，其胞外域富含cys ,参与配基结合，通过蛋白酶水解或选择性剪接可获得缺失跨膜域的可溶性蛋白[8]，如可溶性Fas等能与其配基结合，但作用却是抑制Fas的调节功能[9]。以可溶性蛋白质形式存在的OCIF/OPG也是通过结合其配基来抑制阻断该配基的信号传递。这种配基分别被命名为ODF和OPGL[7, 10]。
Yasuda等[7]研究发现，体外培养的OC体系中，用1，25(OH)2D3和地塞米松刺激后的骨髓基质ST2细胞上OCIF/OPG可使OPG结合分子表达增多，并且OPG的单克隆抗体能阻断OPG与其结合。体外实验证明，在生物工程技术合成的可溶性OPG结合蛋白和M-CSF的共同作用下脾细胞可直接形成OC，而不需要OB、骨髓基质细胞的辅助作用，并且这种作用能被OPG抑制。用已知的破骨细胞形成的刺激因子：1，25(OH)2D3、PTH、PGE2、IL-11处理的颅盖OB可上调OB上这种分子mRNA的表达，可见OPG结合分子即ODF，介导了破骨细胞前体向OC分化最基本的信号传递。用1，25(OH)2D3和地塞米松刺激后的ST2细胞构建cDNA文库，并从中分离出小鼠此结合蛋白质cDNA，证实其编码316个aa。ODF为Ⅱ型跨膜蛋白，无信号肽，由24个疏水aa残基构成其跨膜域(48-71aa)，长的C端在胞外，短的N端在胞内。并证明C端165个残基在TNF配体家族成员的胞外域高度同源。Lacey等用鼠或人重组OPG与Ig GFc的融合蛋白OPG-Fc作免疫探针，同时设立空白对照、阴性对照，探查鼠类细胞系，特别是造血细胞表面的OPG配基(OPGL)，找到骨髓单核细胞系32D能表达这种分子，并证实OPGL与ODF为同一种蛋白。小鼠皮下注射重组OPGL可导致OC活化，引起高钙血症、胫骨远端骨量减少，而这些作用在体内、外均能被OPG所抑制，从而揭示在OC形成活化过程，OPGL和OPG分别是一对重要的正性、负性细胞外调节因子[7,11]。
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3 OCIF/OPG、ODF/OPGL与OC相互作用机制
已知OPG能抑制OC生成、活化，OPGL能促进OC功能，但它们在骨质微环境中与OC相互作用并未完全明确，目前可能存在以下两种途径：
3.1 竞争拮抗途径 Yasuda等[7]设想在OC前体细胞膜上存在一种ODF受体，可能也是TNFR超家族成员，1，25(OH)2D3、PTH/PGE2、IL-11/IL-6通过3条途径刺激OB或基质细胞在胞膜上表达ODF/OPGL，ODF/OPGL便能与OC前体细胞上假想的受体结合，将分化信号传到OC前体细胞使其分化成熟。而OCIF/OPG是可溶性蛋白，能竞争性结合ODF/OPGL，阻断ODF/OPGL信号下传从而抑制OC分化。
3.2 OCIF/OPG与OC凋亡 Akatsu等[11]在体外培养的OC上，用OCIF处理24h后可观察到典型的细胞凋亡现象。如再加入Caspas-3的抑制剂，则凋亡便被抑制。OCIF/OPG致凋亡的作用机制尚不清楚。虽然OPG具有与Fas相同的DDH，但该研究证明，去掉DDH的变异型OPG已足以抑制OC分化，只是其作用强度较未缺失DDH的OPG低[4, 11]。
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4 OCIF/OPG的调控
有学者认为，OCIF/OPG在OC的发生、分化发育过程中起着核心作用，其它的骨吸收调节因子可能部分或全部通过调节OPG生成这一途径而发挥作用[12]。
4.1 PGE2是促骨吸收的因子，近来被证明通过蛋白激酶A的途径使人骨髓基质细胞(hBMSC)OPG mRNA下调，从而减少OPG生成，使OPGL阻断效应减弱从而促进了OC的活化[12]。
4.2 转化生长因子(TGF)-b是骨吸收抑制剂，可抑制新破骨细胞的形成，Takai等[13]研究了骨髓基质细胞与OB的OPG mRAN调节，发现TGF-b能明显提高OPG mRNA水平，并减少OPGL mRNA转录，证明TGF-b抑制OC生成部分是通过这一途径而实现的。
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4.3 Hofbauer[14]对人类3种OB系[人胚胎成骨细胞系(hFOB)、人成骨细胞系(hOB)、人骨髓基质细胞系(hMS)]OPG mRNA的水平研究显示，1，25(OH)2D3增加hFOB、hOB的OPG mRNA转录和蛋白质产生，但未发现1，25(OH)2D3对hMS细胞系OPG mRNA表达有任何影响，从而说明成熟的OB而非OB前体细胞能对1，25(OH)2D3发生反应，OPG的表达可能与OB的分化状态有关。
4.4 骨形态发生蛋白-2(BMP-2)是一种高效的骨诱导物质，可促进骨基质的形成和钙化。BMP-2仅增加hFOB的OPG mRNA水平[14]，可能与hFOB的来源有关，因在胚胎发生中BMP-2的量最多且与器官形成关系最密切。另外，BMP-2能促进OB前体细胞向成熟OB转化，故BMP-2间接调节OC生成。
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4.5 在体外TNF-α、IL-1β有抑制骨形成和促进骨吸收的作用，经TNF-α、IL-β处理hFOB细胞后，OPG mRNA 表达持续增强并OPG蛋白质生成增多。TNF-α的生成能使可溶性TNFR蛋白生成增加，但这并不完全抵消其全身作用，IL-1β上调OPG mRNA转录。由此可见，抗骨吸收因子OPG的产生与对抗骨吸收因子INF-α，IL-1β的作用有关，并限制这些细胞因子对骨吸收的作用[14]。
综上所述，OCIF/OPG是一种新发现的重要的抑制OC发生的细胞因子，对它及其配基的研究，可进一步明确OCIF/OPG在骨质疏松中的核心作用和它与其他激素、细胞因子的关系，对深入研究OC精细调控机制具有重要意义，并为探讨骨质疏松发病机制及预防、治疗(如通过控制OPG水平)骨质疏松开辟了更广阔的领域。
作者简介：李晓佳(1974-)，女，成都人，在读硕士。
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