合并应用甾体激素与低剂量棉酚对雄性大鼠的抗生育效果及其作用机制
育效果及其作用机制
王岚 叶惟三 刘霄 郭燕
摘 要 目的 论证甾体激素与低剂量棉酚组合用药的雄性抗生育作用的可行性及其作用机制 。方法 用低剂量棉酚12 mg/(kg.d),甲基睾丸素20 mg/(kg.d)、炔雌醇100 μg/(kg.d)喂服Wistar大鼠6周，部分取材，开始合笼；继续用棉酚12 mg/ (kg.d)维持12周，部分取材；余下大鼠停药，观察恢复情况。取材做大鼠睾丸精子计数、 精子活动度，睾丸切片的形态学观察等。结果 用药6周大鼠的生精过程受到不完全抑制，附睾精子全 部失去活力。用药6+12周大鼠的曲细精管Ⅱ-Ⅲ期数量比例为(9.3±3.4)%，比对照组(26.8 ±1.7)%显著下降；Ⅳ-Ⅵ期数量比例为(36.7±5.0)%，比对照组(24.5±2.7)%显著上升； Ⅸ-Ⅹ期数量比例为(3.6±0.6)%，比对照组(6.0±0.4)%显著下降。附睾精子全部失去活 力。结论 甾体激素与低剂量棉酚从不同的作用位点共同作用于 生精过程，在短时间内完全可以达到抗生育效果；低剂量棉酚长时期作用，不仅在附睾行使 其抗生育功能，还影响生精过程产生精子的质量。此雄性抗生育作用具有可逆性。
, http://www.100md.com
关键词：甾体激素 低剂量棉酚 雄性抗生育作用
目前国际上广泛采用的男性避孕药是雄激素类和孕激素类甾体激 素的药物组合，如醋酸赛普特隆(cyproterone acetate)和11酸睾酮(testosterone undecan oate)，以避免因单独使用雄激素而导致其血液浓度的巨大波动[1]。但由于在服药 期间会引起机体内性激素水平的波动，而这种波动的长期持续性，很可能会对雄激素依赖的 生理功能，如骨质代谢、肌肉力量和性功能等造成负面影响[2]，因此具有潜在的 副作用。男性避孕药棉酚因副作用明显，不能普及应用[3]；而低剂量棉酚(10 mg/ d或12.5 mg/d)的男性避孕作用的起效时间又较长，约需6个月[4]。目前，将甾体 激素与低剂量棉酚组合使用，已成为男性避孕药研究的新方向。叶惟三等[5]应用 皮下植入睾酮与雌二醇长硅胶管和低剂量棉酚组合，对大鼠进行雄性抗生育观察，并与单独 使用棉酚或单独使用激素的雄性抗生育效果比较，表明低剂量棉酚可以同甾体激素组合的抗 生育作用接轨且具有优越性。本实验改进了此组合用药的给药方式，即改为方便的、易于为 人们接受的口服方式，并对口服用药的可行性进行观察，以形态学观察为基础着重对组合用 药的作用机制进行初步探讨。
, 百拇医药
材料和方法
药品与试剂 醋酸棉酚(G)由中国医学科学院药物研究所黄量教授 提供；甾体激素(H)炔雌醇为北京制药三厂产品；甲基睾丸素为天津力生制药厂产品。
动 物 Wistar 健康雄性大鼠由中国医学科学院医学动 物研究所提供，体重180～220 g，分为两组，每组18只。Ⅰ组为12 mg/(kg.d)G+H实验组， 甾体激素H包括甲基睾丸素20 mg/(kg.d)、炔雌醇100 μg/(kg.d),药物混悬于1%甲基纤维 素中胃饲给药。Ⅱ组为对照组，喂服1%的甲基纤维素，剂量为2 ml/(kg.d)。每周称体重， 根据体重调整喂药量。实验组于喂药6周后第1次部分取材(6只)；余下大鼠单独喂服棉酚12 mg/(kg.d),并进行合笼实验，12周后第2次部分取材(6只)；其余(6只)大鼠停药继续合笼， 观察其生育能力的恢复情况。动物饲养于12：12 h日夜周期的空调房内，自由进食块饲料和 饮自来水。
, http://www.100md.com
大鼠体重、生殖器官的重量 分别称取大鼠体重、睾丸和附睾重 量。
12 mg/(kg.d)G+H服用6周和再用12 mg/(kg.d)G维持12周对生 精过程的影响 睾丸精子计数、附睾精子活动度、附睾 精子银染方法：见文献[6]：
睾丸组织切片方法：见文献[6]。观察：(1)200个曲细精管中Ⅰ-Ⅵ、Ⅶ-Ⅷ、Ⅸ-Ⅹ、 Ⅺ-ⅩⅠⅠⅠ、ⅩⅠⅤ期的数量比例，50个Ⅰ-Ⅵ期曲细精管中Ⅰ、Ⅱ-Ⅲ 、Ⅳ-Ⅵ期的数量比例；(2)具有形成空泡、出现3个以上退化的精母细胞、变形精子缺失、 出现脂肪滴、管腔内有脱落的生精细胞，Ⅸ-Ⅹ期晚期精子延迟释放等现象的曲细精管所占 比例；(3)每个大鼠测量20个曲细精管横截面直径；(4)根据Floderus公式计算睾丸不同生精 细胞(A1精原细胞、前细线期精母细胞PL、粗线期精母细胞P、圆形精子细胞RS)与支 持细胞的比例[7]，支持细胞以看清核仁为准。
, 百拇医药
Floderus公式:NV=NA/(T+D-2h)，NA：单位面积曲细精管中细 胞核的数量；T：切片的厚度；D：生精细胞核或支持细胞核仁的平均直径；h ：一张切片中细胞核或核仁的最小直径。
外周血激素的测定：取大鼠心脏血，按照中国医学科学院放射医学研究所核医学中心放射免 疫试剂盒提供的方法，测血清中睾酮(T)、促黄体生成激素(LH)、促卵泡生成激素(FSH)的含 量。
合笼实验：用药6周后进行雄鼠与雌鼠(1∶2)的合笼实验。
用药后恢复生育的第一代仔鼠的发育 观测仔鼠的平面翻正反射 、视觉定向反射、痛觉反射、触须定位反射、嗅觉反射、负向趋地性反射、断崖回避反射、 运动性与协调性能力，如在8～16 d内以上指标均达标(视觉定向反射为16 d后测试)，即可 确定仔鼠发育正常[8]。
, http://www.100md.com
心肝肾的组织形态学观察 取部分心、肝、肾组织，Bouin固定， 石蜡包埋切片(片厚6 μm)，HE、PAS染色，光镜下观察。
统计学处理 实验结果以平均值±标准差(X±s) 表示，组间比较用t检验。
结 果
大鼠体重、生殖器官的重量 与对照组相比，实验组大鼠在喂药6 周后的体重增加较为缓慢(P<0.01)，睾丸和附睾重量也降低，两者差异有显著性( P<0.05)；但实验组继续单独喂服G12周后，大鼠体重及睾丸重量与对照组相比均无显 著差异，只有附睾的重量与对照组相比有显著差异(P<0.01，附图)。
附图 大鼠体重增加及睾丸、 附睾重量变化
Fig Change of the weight of rats' bodies increase, testis, and epididymis
, http://www.100md.com
*P<0.05,**P<0.01 compared with control;G+H: gossypol plus hor mone
12 mg/(kg.d)G+H服用6周和再用12 mg/(kg.d) G维持12周对生精过程的影响
睾丸精子计数、附睾精子 活力及形态：实验组大鼠用药6周的精子计数为(629±340)×106/g，比对照组的(781 ±112)×106/g有所降低，但两者差异无显著性；继续用药12周精子计数为(846±158 )×106/g，与对照组(678±175)×106/g相比也无显著差异。实验组大鼠2次取 材附睾精子活力全为0，对照组分别为(80±5)%、(55±5)%。2次取材附睾精子银染结果均显 示实验组无形态正常精子，主要表现为精子头颈分离，尾部环粒受损分离(表1)。
, 百拇医药
睾丸组 织切片：(1)服用G+H 6周后，各期曲细精管的比例变化不明显；继续单独服用低剂量G 12周 ，Ⅱ-Ⅲ期曲细精管数量比例(9.3±3.4)%较对照组(26.8±1.7)%显著下降P<0.01)， Ⅳ-Ⅵ期曲细精管数量比例(36.7±5.0)%较对照组(2.45±2.7)%显著上升(p<0.05)， Ⅸ-Ⅹ期比例(3.6±0.6)%较对照组(6.0±0.4)%显著下降(p<0.05)(表2)；(2)用药6周 后，实验组只有1只大鼠的Ⅰ-Ⅷ期(尤其是第Ⅶ、Ⅷ期)曲细精管有退化的精母细胞和精子 细胞出现，且缺乏晚期精子，而其余实验鼠规此异常表现，但具其它异常现象的曲细精管比 例上升至(11.73±7.47)%，比对照组(2.97±2.37)%(主要为生精细胞脱落)显著上升( p<0.05)；用药6+12周实验组异常曲细精管比例为(3.80±2.16)%(主要也为生精细胞脱落 )，对照组为(5.0±2.8)%，差异不明显；(3)实验组用药6周与6+12周后曲细精管直径分别为(0.284±0.053)μm和(0.325±0.031)μm，与对照组(0.330±0.017) μm和(0.338±0.006)μm比较无显著变化；(4)只有G+H共同作用6周大鼠的A1精原细 胞比例显著增加，其它生精细胞与支持细胞的比例无明显变化(表3)。
, http://www.100md.com
表1 附睾精子银染结果
Tablel 1 Sperm morphology fol lowing silver staining in rats(%,X±s)
Group
n
Fore 6 weeks
6 weeks + next 12 weeks
A
B
C
D
A
, 百拇医药
B
C
D
G+H
6
0
0
28.1±
71.9±
0
0
25.7±
74.3±
9.3
, http://www.100md.com
9.4
9.4
9.4
Control
6
80.0±
0
0.9±
19.1±
80.4±
0
6.3±
13.3±
, 百拇医药
21.0
0.5
20.1
11.4
3.2
9.0
A:normal;B:abmormal in sperm heads;C:separation or frag mentation in annular granule of sperm tail;D:segregation of sperm nucha from spe rm head;G+H:gossypol plus hormone表2 曲细精管各期数量比例
Table 2 Numerica l ratios of tubular stages Ⅰ-ⅩⅠⅤ in rats(%,X±s)
, 百拇医药
Group
n
Foue 6 weeks
6 weeks+next 12 weeks
Ⅰ- Ⅵ
Ⅶ-Ⅷ
Ⅸ-Ⅹ
Ⅺ-ⅩⅠⅠⅠ
ⅩⅠⅤ
Ⅰ-Ⅵ
Ⅶ-Ⅷ
Ⅸ-Ⅹ
Ⅺ-ⅩⅠⅠⅠ
, 百拇医药
ⅩⅠⅤ
G+H
6
46.2±4.2
29.2±2.7
5.3±1.7
16.7±1.0
2.7±1.4
41.0±4.8
29.4±2.8
3.6±0.6*
21.3±3.3
, 百拇医药
4.6±1.5
Control
6
40.5±0.8
30.0±1.8
7.8±1.6
8.5±1.8
4.0±1.8
38.7±0.9
28.8±1.0
6.0±0.4
22 .2±1.3
, 百拇医药
4.3±1.2
*P<0.05 compared with control
外周血激素浓度的测定：实验组大鼠用药6周后，外周血T浓度为(0.11±0.02)ng/ml，比对 照组(1.25±0.24)ng/ml显著下降(P〈0.01)，LH、FSH浓度与对照组相比变化不明显。 继续用药12周后，实验组T激素水平恢复正常。
合笼实验结果：实验鼠在用药6周与用药6+12周后，无一怀孕；而对照组全部怀孕。
用药后恢复生育的第一代仔鼠的发育 实验组大鼠停药6周后恢复 生育能力，产下的仔鼠经系列行为反射检测，8～16 d内全部达标，证明发育正常。
心肝肾的组织形态学观察结果 组织切片的糖元反应和HE染色结果均未见明 显异常。
, http://www.100md.com
表3 Ⅶ-Ⅷ期不同生精细胞与支持 细胞的比例
Table 3 Sperm atogenic cell-sertoli cell ratios at stages Ⅶ,Ⅷ in rats(±s)
Group
n
Fore 6 weeks
6 weeks+next 12 weeks
A1
PL
P
RS
, 百拇医药
A1
PL
P
RS
G+H
6
0.221±
2.699±
3.328±
8.385±
0.319±
3.441±
4.84 4
, 百拇医药
13.761
0.007*
0.124
0.885
2.446
0.058
0.378
0.395
±1. 237
Control
6
0.176±
, http://www.100md.com
3.175±
4.230±
11.902±
0.186±
3.985±
6.0 67±
17.019
0.002
0.005
0.131
0.174
0.035
, 百拇医药 0.676
1.046
±3.179
*P<0.05 compared with comtrol;A1:A1 spermatogonia;PL:preleptotene sperm atocytes;P:pachytene spermatocytes;RS:round spermatids 讨 论
激素与低剂量棉酚共同作用6周后，大鼠睾丸精子计数、曲细精管直径减低，但与 对照相比差异不显著。虽然实验组大鼠全部出现Ⅸ-Ⅹ期晚期精子延迟释放现象，且受影响 的曲细精管数量显著升高，但各期曲细精管比例无明显改变，且只有1只大鼠具激素完全抑 制生精过程的特征：Ⅰ-Ⅷ期(尤其是第Ⅶ、Ⅷ期)曲细精管有3个以上退化的精母细胞和精 子细胞出现，且Ⅰ-Ⅷ期无晚期精子[1]。实验组外周血仅T浓度明显下降。附睾精 子银染表明，附睾精子膜结构异常。这些结果说明，本实验所用激素剂量不足以完全抑制生 精过程，并揭示低剂量棉酚在短时间内(6周)，并不显著影响睾丸内的生精过程，而是通过 破坏附睾中变形后精子的膜结构，使没有被激素抑制而产生的精子全部失去活力，同时可能 还抑制附睾的精子获能等其它功能[9]。合笼实验无一母鼠怀孕，表明激素与低剂 量棉酚从不同的作用位点共同作用于生精过程，在短时间内完全可以达到抗生育效果，而且 对睾丸组织无严重损伤，并不会对心肝肾产生毒副作用。A1精原细胞与支持细胞的比 例在用药6周后，比对照组显著增高，而Kainz等[10]于1988年观察到长期应用棉酚 使精原细胞减少，提示本实验结果是引发激素对精原细胞的保护机制所致[11]。其 机制是雄激素与孕激素共同作用，使睾丸组织内睾酮水平显著降低，保留了雄激素反应细胞 曲细精(管上皮细胞和支持细胞)对恢复产生精子的反应能力，即产生分泌因子[1] ，这也是本实验同时使用雄激素与孕激素的原因之一。
, 百拇医药
用药6周达到抗生育效果后，用低剂量棉酚维持药效，12周内无一母鼠怀孕。用药6+12周后 大鼠体重的增加、睾丸重量恢复正常，且低剂量棉酚对内脏器官组织无毒副作用，叶惟三等 [5]发现，组合应用激素与低剂量棉酚的Wistar大鼠中没有低血钾发生。本实验结 果表明，外周血中T、LH、FSH的浓度均在正常范围内，提示低剂量棉酚对下丘脑-垂体轴系 无影响。睾丸精子计数、受影响的曲细精管的比例、曲细精管直径均与对照无明显差异，提 示低剂量棉酚维持抗生育效果的方式并不是影响睾丸产生精子的能力与数量。低剂量棉酚长 期作用对曲线精管Ⅱ-Ⅲ、Ⅳ-Ⅵ、Ⅸ-Ⅹ期的影响十分明显，Ⅱ-Ⅲ期比例显著下降，Ⅳ -Ⅵ期比例显著上升，但第Ⅰ期、Ⅰ-Ⅵ期比例总和改变不明显，提示即变化只发生在Ⅱ- Ⅲ期和Ⅳ-Ⅵ期，这很可能是因为低剂量棉酚使生精过程在Ⅱ-Ⅲ期快速完成，并滞留于Ⅳ -Ⅵ期之故。第Ⅰ-Ⅶ期的主要生物学事件是顶体的发生与形成，低剂量棉酚很可能涉及这 一过程，与Kalla等[12]于1990年发现Stage7与16期精子细胞对棉酚最敏感的结论 符合，因为Stage16期精子细胞在第Ⅱ期曲细精管中，Stage7期精子细胞在第Ⅶ期中，都处 于顶体的形式时期。低剂量棉酚对生精过程的另一影响是使曲细精管Ⅸ-Ⅹ期比例显著下降 ，而Ⅺ-ⅩⅠⅠⅠ期比例没有明显改变，即Ⅸ-Ⅹ期以后各期没有改变，因此是生 精过程在第Ⅸ期以前受阻；而第Ⅷ-Ⅸ期是精子细胞将要变形的过渡阶段，因此实验组大鼠 的生精过程在此阶段可能也遇到了困难，却因在Ⅳ-Ⅵ期有明显地累积，所以Ⅶ-Ⅷ期的比 例变化不显著，如果在Ⅳ-Ⅵ期没有停滞累积，那么Ⅶ-Ⅷ期的比例一定会显著增加。这与Kainz等 [10]于1988年观察到用棉酚15 mg/(kg.d)16周后，Ⅶ-Ⅹ期粗线期精母细胞(P)和精 子细胞(RS)显著减少，棉酚影响精子细胞的变形的结论相符合；另外，也和薛社普等[ 13]1979年观察到用棉酚30 mg/(kg.d)10周后，Ⅶ-Ⅹ期粗线期精母细胞(P)和精子细胞 (RS)是对棉酚最敏感的两种靶细胞的结论一致。低剂量棉酚除了使附睾中精子完全失去活力 外，还使附睾重量在用药6+12周后仍明显低于对照组，表明附睾是低剂量棉酚雄性抗生育作 用的重要靶器官。有报道证明，棉酚在附睾对顶体复合物作用，使其变形、空泡化，并且抑 制精子获能[Δ]。综上所述，低剂量棉酚不仅在附睾行使其抗生育功能，还影响生 精过程产生精子的质量，作用位点是顶体的形成与精子的变形过程。
, 百拇医药
本实验结果说明素与低剂量棉酚组合用药方式的雄性抗生育作用的可行性：(1)组合用药毒 副作用很小，并且无新的异常毒副作用出现，两者的雄性抗生育作用可以接轨；(2)组合用 药可以在短时间内(6周)起效，并可用低剂量棉酚长时间维持药效(12周)，停药6周后可完全 恢复生育能力(具有可逆性)；(3)恢复生育能力后，第一代仔鼠发育状况良好[5]。
国家自然科学基金(3967763)和卫生部科学研究基金(96-1-074)资助
王岚(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室， 北京100005)
叶惟三(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室， 北京100005)
刘霄(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室， 北京100005)
, 百拇医药
郭燕(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室， 北京100005)
参考文献
[1]Meistrich ML, Wilson G, Ye WS,etal. Relationship among hormon al treatments, suppression of spermatogenesis, and testicular protection from ch emotheray-induced damage. Emdo crinology, 1996,137(9)：3823-3831
[2]Meriggiola ME, Bremner WJ, Costantino A, et al. An oral reg imen of cyproteroneacetateand testosterone undecanoate for spermatogenic suppres sion in mem. Fertil Steril, 1997,68：844-850
, 百拇医药
[3]Waites GMH, Wang C, Griffin PD. Gossypol： reasons for its fai lure to be accepted as a safe, reversible male antifertility drug. Inter J Andro l, 1998,21：8-12
[4]顾芝萍，章仁安，王益鑫，等.低剂量棉酚男性避孕效果和副作用的临床 观察.生殖与避孕，1994，14(1)：13-18
[5]叶惟三，但 凌，郭 燕，等.睾丸酮、雌二醇和棉酚合并用药的雄性抗生 育作用及其安全性的研究.药学学报，1996，31(4)：313-315
[6]王 岚，叶惟三，惠 玲，等.雷公藤的雄性抗生育作用及其作用机制的探 讨.中国医学科学院学报，2000，22(3)：
[7]Yanhe Lue, Hikim A, Christina Wang, et al Triptolide: a pot ential male contraceptive. J Androl, 1998,19(4)：479-485
, 百拇医药
[8]Adams PM, Fabricant JD, Legator MS.Cyclophosphamide-induced s p ermatogenic effects detected in the F1 generation by behavioral testing. Science ,1981,211(4477)：80-82
[9]Baccetti B, Bigliardi E, Burrini AG, et al. Action of gossyp ol on rat germial cells. Ⅱ.the acrosome. Gamete Res, 1987,16(1)：10-21
[10]Kainz V, Fick J, Kainz P, et al. The effect of gossypol acetic a cid on the different stages of the spermatogenic cycle in the rat. Int J Androl, 1988,11(6)：533-546
, 百拇医药
[11]叶惟三，但 凌，Meistrich ML, 等甾体激素保护睾丸生精功能免受化疗损伤 的作用机理.中国医学科学院学报，1995，17(3)：204-209
[12]Kalla NR, Grewal R, Ranga A, et al Spermatogenic events in rat a nd mice following intratesticular administration of optical isomers of gossypol. Acta Eur Fertil,1990,21(20)：91-94
[13]薛社普，宗书东，苏树芸，等.棉酚对大鼠抗精子发生作用的细胞学、放射自 显影及超微结构的观察.中国科学，1979，9：915-923, 百拇医药
王岚 叶惟三 刘霄 郭燕
摘 要 目的 论证甾体激素与低剂量棉酚组合用药的雄性抗生育作用的可行性及其作用机制 。方法 用低剂量棉酚12 mg/(kg.d),甲基睾丸素20 mg/(kg.d)、炔雌醇100 μg/(kg.d)喂服Wistar大鼠6周，部分取材，开始合笼；继续用棉酚12 mg/ (kg.d)维持12周，部分取材；余下大鼠停药，观察恢复情况。取材做大鼠睾丸精子计数、 精子活动度，睾丸切片的形态学观察等。结果 用药6周大鼠的生精过程受到不完全抑制，附睾精子全 部失去活力。用药6+12周大鼠的曲细精管Ⅱ-Ⅲ期数量比例为(9.3±3.4)%，比对照组(26.8 ±1.7)%显著下降；Ⅳ-Ⅵ期数量比例为(36.7±5.0)%，比对照组(24.5±2.7)%显著上升； Ⅸ-Ⅹ期数量比例为(3.6±0.6)%，比对照组(6.0±0.4)%显著下降。附睾精子全部失去活 力。结论 甾体激素与低剂量棉酚从不同的作用位点共同作用于 生精过程，在短时间内完全可以达到抗生育效果；低剂量棉酚长时期作用，不仅在附睾行使 其抗生育功能，还影响生精过程产生精子的质量。此雄性抗生育作用具有可逆性。
, http://www.100md.com
关键词：甾体激素 低剂量棉酚 雄性抗生育作用
目前国际上广泛采用的男性避孕药是雄激素类和孕激素类甾体激 素的药物组合，如醋酸赛普特隆(cyproterone acetate)和11酸睾酮(testosterone undecan oate)，以避免因单独使用雄激素而导致其血液浓度的巨大波动[1]。但由于在服药 期间会引起机体内性激素水平的波动，而这种波动的长期持续性，很可能会对雄激素依赖的 生理功能，如骨质代谢、肌肉力量和性功能等造成负面影响[2]，因此具有潜在的 副作用。男性避孕药棉酚因副作用明显，不能普及应用[3]；而低剂量棉酚(10 mg/ d或12.5 mg/d)的男性避孕作用的起效时间又较长，约需6个月[4]。目前，将甾体 激素与低剂量棉酚组合使用，已成为男性避孕药研究的新方向。叶惟三等[5]应用 皮下植入睾酮与雌二醇长硅胶管和低剂量棉酚组合，对大鼠进行雄性抗生育观察，并与单独 使用棉酚或单独使用激素的雄性抗生育效果比较，表明低剂量棉酚可以同甾体激素组合的抗 生育作用接轨且具有优越性。本实验改进了此组合用药的给药方式，即改为方便的、易于为 人们接受的口服方式，并对口服用药的可行性进行观察，以形态学观察为基础着重对组合用 药的作用机制进行初步探讨。
, 百拇医药
材料和方法
药品与试剂 醋酸棉酚(G)由中国医学科学院药物研究所黄量教授 提供；甾体激素(H)炔雌醇为北京制药三厂产品；甲基睾丸素为天津力生制药厂产品。
动 物 Wistar 健康雄性大鼠由中国医学科学院医学动 物研究所提供，体重180～220 g，分为两组，每组18只。Ⅰ组为12 mg/(kg.d)G+H实验组， 甾体激素H包括甲基睾丸素20 mg/(kg.d)、炔雌醇100 μg/(kg.d),药物混悬于1%甲基纤维 素中胃饲给药。Ⅱ组为对照组，喂服1%的甲基纤维素，剂量为2 ml/(kg.d)。每周称体重， 根据体重调整喂药量。实验组于喂药6周后第1次部分取材(6只)；余下大鼠单独喂服棉酚12 mg/(kg.d),并进行合笼实验，12周后第2次部分取材(6只)；其余(6只)大鼠停药继续合笼， 观察其生育能力的恢复情况。动物饲养于12：12 h日夜周期的空调房内，自由进食块饲料和 饮自来水。
, http://www.100md.com
大鼠体重、生殖器官的重量 分别称取大鼠体重、睾丸和附睾重 量。
12 mg/(kg.d)G+H服用6周和再用12 mg/(kg.d)G维持12周对生 精过程的影响 睾丸精子计数、附睾精子活动度、附睾 精子银染方法：见文献[6]：
睾丸组织切片方法：见文献[6]。观察：(1)200个曲细精管中Ⅰ-Ⅵ、Ⅶ-Ⅷ、Ⅸ-Ⅹ、 Ⅺ-ⅩⅠⅠⅠ、ⅩⅠⅤ期的数量比例，50个Ⅰ-Ⅵ期曲细精管中Ⅰ、Ⅱ-Ⅲ 、Ⅳ-Ⅵ期的数量比例；(2)具有形成空泡、出现3个以上退化的精母细胞、变形精子缺失、 出现脂肪滴、管腔内有脱落的生精细胞，Ⅸ-Ⅹ期晚期精子延迟释放等现象的曲细精管所占 比例；(3)每个大鼠测量20个曲细精管横截面直径；(4)根据Floderus公式计算睾丸不同生精 细胞(A1精原细胞、前细线期精母细胞PL、粗线期精母细胞P、圆形精子细胞RS)与支 持细胞的比例[7]，支持细胞以看清核仁为准。
, 百拇医药
Floderus公式:NV=NA/(T+D-2h)，NA：单位面积曲细精管中细 胞核的数量；T：切片的厚度；D：生精细胞核或支持细胞核仁的平均直径；h ：一张切片中细胞核或核仁的最小直径。
外周血激素的测定：取大鼠心脏血，按照中国医学科学院放射医学研究所核医学中心放射免 疫试剂盒提供的方法，测血清中睾酮(T)、促黄体生成激素(LH)、促卵泡生成激素(FSH)的含 量。
合笼实验：用药6周后进行雄鼠与雌鼠(1∶2)的合笼实验。
用药后恢复生育的第一代仔鼠的发育 观测仔鼠的平面翻正反射 、视觉定向反射、痛觉反射、触须定位反射、嗅觉反射、负向趋地性反射、断崖回避反射、 运动性与协调性能力，如在8～16 d内以上指标均达标(视觉定向反射为16 d后测试)，即可 确定仔鼠发育正常[8]。
, http://www.100md.com
心肝肾的组织形态学观察 取部分心、肝、肾组织，Bouin固定， 石蜡包埋切片(片厚6 μm)，HE、PAS染色，光镜下观察。
统计学处理 实验结果以平均值±标准差(X±s) 表示，组间比较用t检验。
结 果
大鼠体重、生殖器官的重量 与对照组相比，实验组大鼠在喂药6 周后的体重增加较为缓慢(P<0.01)，睾丸和附睾重量也降低，两者差异有显著性( P<0.05)；但实验组继续单独喂服G12周后，大鼠体重及睾丸重量与对照组相比均无显 著差异，只有附睾的重量与对照组相比有显著差异(P<0.01，附图)。
附图 大鼠体重增加及睾丸、 附睾重量变化
Fig Change of the weight of rats' bodies increase, testis, and epididymis
, http://www.100md.com
*P<0.05,**P<0.01 compared with control;G+H: gossypol plus hor mone
12 mg/(kg.d)G+H服用6周和再用12 mg/(kg.d) G维持12周对生精过程的影响
睾丸精子计数、附睾精子 活力及形态：实验组大鼠用药6周的精子计数为(629±340)×106/g，比对照组的(781 ±112)×106/g有所降低，但两者差异无显著性；继续用药12周精子计数为(846±158 )×106/g，与对照组(678±175)×106/g相比也无显著差异。实验组大鼠2次取 材附睾精子活力全为0，对照组分别为(80±5)%、(55±5)%。2次取材附睾精子银染结果均显 示实验组无形态正常精子，主要表现为精子头颈分离，尾部环粒受损分离(表1)。
, 百拇医药
睾丸组 织切片：(1)服用G+H 6周后，各期曲细精管的比例变化不明显；继续单独服用低剂量G 12周 ，Ⅱ-Ⅲ期曲细精管数量比例(9.3±3.4)%较对照组(26.8±1.7)%显著下降P<0.01)， Ⅳ-Ⅵ期曲细精管数量比例(36.7±5.0)%较对照组(2.45±2.7)%显著上升(p<0.05)， Ⅸ-Ⅹ期比例(3.6±0.6)%较对照组(6.0±0.4)%显著下降(p<0.05)(表2)；(2)用药6周 后，实验组只有1只大鼠的Ⅰ-Ⅷ期(尤其是第Ⅶ、Ⅷ期)曲细精管有退化的精母细胞和精子 细胞出现，且缺乏晚期精子，而其余实验鼠规此异常表现，但具其它异常现象的曲细精管比 例上升至(11.73±7.47)%，比对照组(2.97±2.37)%(主要为生精细胞脱落)显著上升( p<0.05)；用药6+12周实验组异常曲细精管比例为(3.80±2.16)%(主要也为生精细胞脱落 )，对照组为(5.0±2.8)%，差异不明显；(3)实验组用药6周与6+12周后曲细精管直径分别为(0.284±0.053)μm和(0.325±0.031)μm，与对照组(0.330±0.017) μm和(0.338±0.006)μm比较无显著变化；(4)只有G+H共同作用6周大鼠的A1精原细 胞比例显著增加，其它生精细胞与支持细胞的比例无明显变化(表3)。
, http://www.100md.com
表1 附睾精子银染结果
Tablel 1 Sperm morphology fol lowing silver staining in rats(%,X±s)
Group
n
Fore 6 weeks
6 weeks + next 12 weeks
A
B
C
D
A
, 百拇医药
B
C
D
G+H
6
0
0
28.1±
71.9±
0
0
25.7±
74.3±
9.3
, http://www.100md.com
9.4
9.4
9.4
Control
6
80.0±
0
0.9±
19.1±
80.4±
0
6.3±
13.3±
, 百拇医药
21.0
0.5
20.1
11.4
3.2
9.0
A:normal;B:abmormal in sperm heads;C:separation or frag mentation in annular granule of sperm tail;D:segregation of sperm nucha from spe rm head;G+H:gossypol plus hormone表2 曲细精管各期数量比例
Table 2 Numerica l ratios of tubular stages Ⅰ-ⅩⅠⅤ in rats(%,X±s)
, 百拇医药
Group
n
Foue 6 weeks
6 weeks+next 12 weeks
Ⅰ- Ⅵ
Ⅶ-Ⅷ
Ⅸ-Ⅹ
Ⅺ-ⅩⅠⅠⅠ
ⅩⅠⅤ
Ⅰ-Ⅵ
Ⅶ-Ⅷ
Ⅸ-Ⅹ
Ⅺ-ⅩⅠⅠⅠ
, 百拇医药
ⅩⅠⅤ
G+H
6
46.2±4.2
29.2±2.7
5.3±1.7
16.7±1.0
2.7±1.4
41.0±4.8
29.4±2.8
3.6±0.6*
21.3±3.3
, 百拇医药
4.6±1.5
Control
6
40.5±0.8
30.0±1.8
7.8±1.6
8.5±1.8
4.0±1.8
38.7±0.9
28.8±1.0
6.0±0.4
22 .2±1.3
, 百拇医药
4.3±1.2
*P<0.05 compared with control
外周血激素浓度的测定：实验组大鼠用药6周后，外周血T浓度为(0.11±0.02)ng/ml，比对 照组(1.25±0.24)ng/ml显著下降(P〈0.01)，LH、FSH浓度与对照组相比变化不明显。 继续用药12周后，实验组T激素水平恢复正常。
合笼实验结果：实验鼠在用药6周与用药6+12周后，无一怀孕；而对照组全部怀孕。
用药后恢复生育的第一代仔鼠的发育 实验组大鼠停药6周后恢复 生育能力，产下的仔鼠经系列行为反射检测，8～16 d内全部达标，证明发育正常。
心肝肾的组织形态学观察结果 组织切片的糖元反应和HE染色结果均未见明 显异常。
, http://www.100md.com
表3 Ⅶ-Ⅷ期不同生精细胞与支持 细胞的比例
Table 3 Sperm atogenic cell-sertoli cell ratios at stages Ⅶ,Ⅷ in rats(±s)
Group
n
Fore 6 weeks
6 weeks+next 12 weeks
A1
PL
P
RS
, 百拇医药
A1
PL
P
RS
G+H
6
0.221±
2.699±
3.328±
8.385±
0.319±
3.441±
4.84 4
, 百拇医药
13.761
0.007*
0.124
0.885
2.446
0.058
0.378
0.395
±1. 237
Control
6
0.176±
, http://www.100md.com
3.175±
4.230±
11.902±
0.186±
3.985±
6.0 67±
17.019
0.002
0.005
0.131
0.174
0.035
, 百拇医药 0.676
1.046
±3.179
*P<0.05 compared with comtrol;A1:A1 spermatogonia;PL:preleptotene sperm atocytes;P:pachytene spermatocytes;RS:round spermatids 讨 论
激素与低剂量棉酚共同作用6周后，大鼠睾丸精子计数、曲细精管直径减低，但与 对照相比差异不显著。虽然实验组大鼠全部出现Ⅸ-Ⅹ期晚期精子延迟释放现象，且受影响 的曲细精管数量显著升高，但各期曲细精管比例无明显改变，且只有1只大鼠具激素完全抑 制生精过程的特征：Ⅰ-Ⅷ期(尤其是第Ⅶ、Ⅷ期)曲细精管有3个以上退化的精母细胞和精 子细胞出现，且Ⅰ-Ⅷ期无晚期精子[1]。实验组外周血仅T浓度明显下降。附睾精 子银染表明，附睾精子膜结构异常。这些结果说明，本实验所用激素剂量不足以完全抑制生 精过程，并揭示低剂量棉酚在短时间内(6周)，并不显著影响睾丸内的生精过程，而是通过 破坏附睾中变形后精子的膜结构，使没有被激素抑制而产生的精子全部失去活力，同时可能 还抑制附睾的精子获能等其它功能[9]。合笼实验无一母鼠怀孕，表明激素与低剂 量棉酚从不同的作用位点共同作用于生精过程，在短时间内完全可以达到抗生育效果，而且 对睾丸组织无严重损伤，并不会对心肝肾产生毒副作用。A1精原细胞与支持细胞的比 例在用药6周后，比对照组显著增高，而Kainz等[10]于1988年观察到长期应用棉酚 使精原细胞减少，提示本实验结果是引发激素对精原细胞的保护机制所致[11]。其 机制是雄激素与孕激素共同作用，使睾丸组织内睾酮水平显著降低，保留了雄激素反应细胞 曲细精(管上皮细胞和支持细胞)对恢复产生精子的反应能力，即产生分泌因子[1] ，这也是本实验同时使用雄激素与孕激素的原因之一。
, 百拇医药
用药6周达到抗生育效果后，用低剂量棉酚维持药效，12周内无一母鼠怀孕。用药6+12周后 大鼠体重的增加、睾丸重量恢复正常，且低剂量棉酚对内脏器官组织无毒副作用，叶惟三等 [5]发现，组合应用激素与低剂量棉酚的Wistar大鼠中没有低血钾发生。本实验结 果表明，外周血中T、LH、FSH的浓度均在正常范围内，提示低剂量棉酚对下丘脑-垂体轴系 无影响。睾丸精子计数、受影响的曲细精管的比例、曲细精管直径均与对照无明显差异，提 示低剂量棉酚维持抗生育效果的方式并不是影响睾丸产生精子的能力与数量。低剂量棉酚长 期作用对曲线精管Ⅱ-Ⅲ、Ⅳ-Ⅵ、Ⅸ-Ⅹ期的影响十分明显，Ⅱ-Ⅲ期比例显著下降，Ⅳ -Ⅵ期比例显著上升，但第Ⅰ期、Ⅰ-Ⅵ期比例总和改变不明显，提示即变化只发生在Ⅱ- Ⅲ期和Ⅳ-Ⅵ期，这很可能是因为低剂量棉酚使生精过程在Ⅱ-Ⅲ期快速完成，并滞留于Ⅳ -Ⅵ期之故。第Ⅰ-Ⅶ期的主要生物学事件是顶体的发生与形成，低剂量棉酚很可能涉及这 一过程，与Kalla等[12]于1990年发现Stage7与16期精子细胞对棉酚最敏感的结论 符合，因为Stage16期精子细胞在第Ⅱ期曲细精管中，Stage7期精子细胞在第Ⅶ期中，都处 于顶体的形式时期。低剂量棉酚对生精过程的另一影响是使曲细精管Ⅸ-Ⅹ期比例显著下降 ，而Ⅺ-ⅩⅠⅠⅠ期比例没有明显改变，即Ⅸ-Ⅹ期以后各期没有改变，因此是生 精过程在第Ⅸ期以前受阻；而第Ⅷ-Ⅸ期是精子细胞将要变形的过渡阶段，因此实验组大鼠 的生精过程在此阶段可能也遇到了困难，却因在Ⅳ-Ⅵ期有明显地累积，所以Ⅶ-Ⅷ期的比 例变化不显著，如果在Ⅳ-Ⅵ期没有停滞累积，那么Ⅶ-Ⅷ期的比例一定会显著增加。这与Kainz等 [10]于1988年观察到用棉酚15 mg/(kg.d)16周后，Ⅶ-Ⅹ期粗线期精母细胞(P)和精 子细胞(RS)显著减少，棉酚影响精子细胞的变形的结论相符合；另外，也和薛社普等[ 13]1979年观察到用棉酚30 mg/(kg.d)10周后，Ⅶ-Ⅹ期粗线期精母细胞(P)和精子细胞 (RS)是对棉酚最敏感的两种靶细胞的结论一致。低剂量棉酚除了使附睾中精子完全失去活力 外，还使附睾重量在用药6+12周后仍明显低于对照组，表明附睾是低剂量棉酚雄性抗生育作 用的重要靶器官。有报道证明，棉酚在附睾对顶体复合物作用，使其变形、空泡化，并且抑 制精子获能[Δ]。综上所述，低剂量棉酚不仅在附睾行使其抗生育功能，还影响生 精过程产生精子的质量，作用位点是顶体的形成与精子的变形过程。
, 百拇医药
本实验结果说明素与低剂量棉酚组合用药方式的雄性抗生育作用的可行性：(1)组合用药毒 副作用很小，并且无新的异常毒副作用出现，两者的雄性抗生育作用可以接轨；(2)组合用 药可以在短时间内(6周)起效，并可用低剂量棉酚长时间维持药效(12周)，停药6周后可完全 恢复生育能力(具有可逆性)；(3)恢复生育能力后，第一代仔鼠发育状况良好[5]。
国家自然科学基金(3967763)和卫生部科学研究基金(96-1-074)资助
王岚(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室， 北京100005)
叶惟三(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室， 北京100005)
刘霄(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室， 北京100005)
, 百拇医药
郭燕(中国医学科学院 中国协和医科大学 基础医学研究所组织胚胎教研室， 北京100005)
参考文献
[1]Meistrich ML, Wilson G, Ye WS,etal. Relationship among hormon al treatments, suppression of spermatogenesis, and testicular protection from ch emotheray-induced damage. Emdo crinology, 1996,137(9)：3823-3831
[2]Meriggiola ME, Bremner WJ, Costantino A, et al. An oral reg imen of cyproteroneacetateand testosterone undecanoate for spermatogenic suppres sion in mem. Fertil Steril, 1997,68：844-850
, 百拇医药
[3]Waites GMH, Wang C, Griffin PD. Gossypol： reasons for its fai lure to be accepted as a safe, reversible male antifertility drug. Inter J Andro l, 1998,21：8-12
[4]顾芝萍，章仁安，王益鑫，等.低剂量棉酚男性避孕效果和副作用的临床 观察.生殖与避孕，1994，14(1)：13-18
[5]叶惟三，但 凌，郭 燕，等.睾丸酮、雌二醇和棉酚合并用药的雄性抗生 育作用及其安全性的研究.药学学报，1996，31(4)：313-315
[6]王 岚，叶惟三，惠 玲，等.雷公藤的雄性抗生育作用及其作用机制的探 讨.中国医学科学院学报，2000，22(3)：
[7]Yanhe Lue, Hikim A, Christina Wang, et al Triptolide: a pot ential male contraceptive. J Androl, 1998,19(4)：479-485
, 百拇医药
[8]Adams PM, Fabricant JD, Legator MS.Cyclophosphamide-induced s p ermatogenic effects detected in the F1 generation by behavioral testing. Science ,1981,211(4477)：80-82
[9]Baccetti B, Bigliardi E, Burrini AG, et al. Action of gossyp ol on rat germial cells. Ⅱ.the acrosome. Gamete Res, 1987,16(1)：10-21
[10]Kainz V, Fick J, Kainz P, et al. The effect of gossypol acetic a cid on the different stages of the spermatogenic cycle in the rat. Int J Androl, 1988,11(6)：533-546
, 百拇医药
[11]叶惟三，但 凌，Meistrich ML, 等甾体激素保护睾丸生精功能免受化疗损伤 的作用机理.中国医学科学院学报，1995，17(3)：204-209
[12]Kalla NR, Grewal R, Ranga A, et al Spermatogenic events in rat a nd mice following intratesticular administration of optical isomers of gossypol. Acta Eur Fertil,1990,21(20)：91-94
[13]薛社普，宗书东，苏树芸，等.棉酚对大鼠抗精子发生作用的细胞学、放射自 显影及超微结构的观察.中国科学，1979，9：915-923, 百拇医药