神经酰胺诱导鼻咽癌细胞凋亡
朱孝峰 张晓实 李志铭 姚毓奇 刘宗潮 谢冰芬 曾益新
摘 要 目的 了解第二信使神经酰胺信号转导对鼻咽癌细胞生长的影响。方法 采用MTT法检测神经酰胺对鼻咽癌细胞株(CNE 2)增殖的抑制作用。光镜观察、荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡改变。Western blot法检测p21WAF1的表达。结果 神经酰胺在6.25、12.5、25、50 μm浓度下，对CNE 2细胞生长有明显的抑制作用，流式细胞仪检测发现亚G1峰出现，荧光染色可见核荧光强度增加、核片段化和凋亡小体。p21WAF1蛋白表达明显上调。结论 神经酰胺能诱导鼻咽癌细胞株CNE 2凋亡，且上调p21WAF1蛋白表达。p21WAF1可能是神经酰胺诱导鼻咽癌细胞凋亡中起作用的因素之一。
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关键词：神经酰胺 凋亡 p21WAF1
神经酰胺是一种抑制性第二信使，参与多种细胞功能，如分化、凋亡、生长停止、细胞因子合成和分泌、免疫反应等[1]。许多因素如放射、抗癌药物、热休克等刺激能激活神经酰胺信号途经。神经酰胺可以直接调控神经酰胺激活的蛋白激酶和磷酸酶，从而调控Rb磷酸化状态、紧张激活的蛋白激酶(JNK或SAPK/JNK)途经和蛋白水解酶系统，发挥其生物学作用[2]。另外，PKC的激活、Bcr-Abl和bcl-2的表达能抑制此信号途径[3，4]。临床上鼻咽癌以放疗为主，对药物中等敏感，放疗或某些抗癌药物可能会激活神经酰胺信号通路从而发挥其作用。本实验应用外源性加入神经酰胺了解其在鼻咽癌细胞中的生物学作用。
1 材料与方法
1.1 材料 人鼻咽癌细胞株(CNE 2)由本室传代保株。MTT为Janssen Chimica公司产品。RPMI 1640培养基、溴化丙啶、C2-神经酰胺、DMSO均为Sigma公司产品。p21WAF1抗体为Pharmingen公司产品，聚丙烯酰胺、双聚丙烯酰胺、SDS等为宝灵曼公司产品。
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1.2 方法
1.2.1 体外噻唑兰(MTT)法 取对数生长的CNE 2细胞1.0×107.L-1加入96孔板中，每孔0.2 ml。设阴性对照组，阳性对照药顺铂(DDP)和不同浓度的C2-神经酰胺，每组设4个平行孔，置37培养72 h，实验终止前4 h加入MTT液，再培养4 h，测试前弃去培养液，加0.2 ml DMSO，待结晶溶解后在酶联检测仪上于570 nm波长测每孔的OD值。按下列公式求出生长抑制率。再按Bliss法计算机程序，求出半数抑制浓度(IC50值)。
1.2.2 光镜观察 取处于对数生长期的CNE 2细胞，稀释成1×107.L-1，接种于96孔板上培养，设无药对照和不同浓度神经酰胺处理组，48 h后，倒置显微镜下观察，并摄影记录。
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1.2.3 荧光染色 取处于对数生长期的CNE 2细胞，稀释成1×107.L-1，接种于6孔板上培养，设无药对照组和不同浓度神经酰胺处理组，48 h后，PBS洗涤2次，涂片，甲醇：冰醋酸固定20 min后，加入100 μmol.L-1 Hoechst 33342液染色15 min，清水冲洗后，荧光显微镜下观察。
1.2.4 流式细胞术 取不同浓度神经酰胺处理的CNE 2细胞，胰酶消化后，PBS洗涤2次，体积分数为70%乙醇固定过液，加入溴化丙啶(PI，10 mg.L-1)染色5 min后，在流式细胞仪(Becton Dickinson公司产品)上用488 nm激发光激发检测DNA含量，LYSIS软件(Becton Dickinson公司产品)分析。
1.2.5 Western blot法检测 无药处理组和12.5、25、50 μmol.L-1浓度的C2-神经酰胺处理2×106 CNE 2细胞24 h后，胰酶消化后，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液100 μl，100℃下10 min。Western blot实验方法参考分子克隆实验指南[5]，SDS电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，50 g.L-1脱脂牛奶封闭再加入抗p21WAF1抗体，2 h后，TBS缓冲液洗涤3次，每次10 min。然后加入二抗，2.5 h后，加入化学发光剂，再放入暗盒并压片，10 min后，显影、定影。
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2 结果
2.1 C2-神经酰胺对鼻咽癌细胞CNE 2增殖的影响 在6.25、12.5、25、50 μmol.L-1浓度下，C2-神经酰胺对CNE 2细胞生长抑制率分别为20.8%±3.5%、40.0%±2.9%、72.5%±5.8%、75.8%±6.1%，IC50值为16.25(13.7, 19.3)μmol.L-1。
2.2 光镜观察 C2-神经酰胺加入CNE 2细胞中后，24 h开始可见细胞分离，生长停止，细胞开始死亡。无药对照组细胞生长旺盛，贴壁生长、细胞之间紧密接触无分离。见图1。
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Fig 1 Growth inhibition by ceramide in NPC cell line CNE 2
A:0.1% DMSO;B:50 μmol.L-1 ceramide
2.3 荧光染色 研究结果显示C2-神经酰胺处理的CNE 2细胞Hoechst 33342染色后，细胞核内可见浓染致密的颗粒荧光，典型细胞可见新月形改变，固缩或片段化的核，而正常细胞核呈弥散均匀的荧光、荧光较弱。见图2。
Fig 2 Fluorescent micrographs of CNE 2 cells treated for 24 h with 1 g.L-1 DMSO(A) or 25 μmol.L-1 ceramide (B) and stained with Hoechst 33342
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2.4 流式细胞仪检测 C2-神经酰胺处理的CNE 2细胞，在流式细胞仪上检测可见明显的亚G1峰。在浓度为0、6.25、12.5、25、50 μmol.L-1处理48 h后，C2-神经酰胺诱导CNE 2细胞凋亡的指数分别为 4.1%、16.9%、46.8%、54.9%、79.4%；10 μmol.L-1 C2-神经酰胺处理CNE 2细胞0、12、24、48 h，凋亡指数分别为4.2%、3.1%、16.2%、32.1%。流式细胞仪分析的图形见图3。
Fig 3 Flow cytometric analyses of CNE 2 cells treated with 1 g.L-1 DMSO(A) or ceramide 6.25(B), 12.5 (C), 25(D), 50(E) μmol.L-1 for 24 h
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2.5 Western blot检测p21WAF1表达 C2-神经酰胺和溶剂分别处理的CNE 2细胞，Western blot检测可见溶剂处理的CNE 2细胞无p21WAF1表达，不同浓度C2-神经酰胺处理的CNE 2可见明显的p21WAF1蛋白条带。
3 讨论
神经酰胺是一种抑制性第二信使，神经酰胺信号途径是一独特、进化上保守的信号系统，与cAMP和磷酸肌醇途径相似，大多数哺乳动物细胞表现为能够传递神经酰胺信号。神经酰胺是神经鞘磷脂经神经鞘磷脂酶水解而产生的。神经酰胺产生的另一条途径为神经酰胺合成酶合成二氢神经酰胺，接下来迅速氧化产生神经酰胺[6]。细胞在受到刺激后神经酰胺立即升高，随后稳定，1 h或几小时后表现为持续升高。最后在鞘氨醇-1-磷酸激酶作用下，磷酸化成为鞘氨醇-1-磷酸从而失去作用[2]。神经酰胺在不同的细胞中表现的功能不同，有分化、凋亡、衰老甚至增殖。本实验结果表明神经酰胺信号转导在鼻咽癌细胞中的功能是诱导凋亡。神经酰胺诱导凋亡的机制被认为主要是相关于JNK途径的激活和caspase途径的激活[2]。但精确的机制还不太清楚。SAPK/JNK信号系统涉及MEKK 1，SEK，SAPK和c-jun的序贯激活。细胞中神经酰胺的升高显著地激活SAPK/JNK联连反应，JNK激活c-jun，从而激活许多基因的表达诱导凋亡。本实验发现神经酰胺能诱导鼻咽癌细胞凋亡，并上调p21WAF1的表达。鼻咽癌细胞为p53基因功能异常的细胞(未出版的资料)，异常的p53功能不能上调p21WAF1的表达，所以神经酰胺诱导p21WAF1的表达应为p53非依赖性途径。神经酰胺信号转导主要被认为是激活JNK通路，JNK激活后可激活c-jun的表达，c-jun与c-fos结合形成AP-1因子，AP-1转录因子可以直接调控p21WAF1的表达[8]，这可能是神经酰胺调节p21WAF1表达的机制。p21WAF1参与多种细胞功能，它主要是参与细胞周期的调控[9]，抑制CDK从而使细胞停止于G1期；另外p21WAF1参与凋亡的诱导以及细胞分化和衰老调控。神经酰胺诱导鼻咽癌细胞凋亡且上调p21WAF1表达，因此神经酰胺信号转导可能在鼻咽癌治疗中具有重要的作用，下一步将对此进行深入研究。
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作者简介：朱孝峰，男，28岁，博士生，助理研究员；
曾益新，男，38岁，研究员，博士生导师
朱孝峰(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
张晓实(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
李志铭(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
姚毓奇(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
刘宗潮(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
谢冰芬(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
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曾益新(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
参考文献
1.Hannun YA. Functions of ceramide in coordinating cellular responses to stress. Science, 1996; 274(5294):1855～9
2.Haimovitz-Friedman A, Kolesnick RN, Fuks Z. Ceramide signaling in apoptosis. British Med Bull, 1997; 53(3):539～53
3.Zhang J, Alter N, Reed J et al. bcl-2 interrupts the ceramide-mediated pathway of cell death. PNAS, 1996; 93(11):5325～8
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4.Sawai H, Okazaki T, Takeda Y et al. Ceramide-induced translocation of protein kinase C-delta and epsilon to the cytosol. Implications in apoptosis.J Biol Chem, 1997;272(4):2452～8
5.Sambrook J ed. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd， Cold spring harbor laboratory press, 1989:888～98
6.Gomez-Munoz A. Modulation of cell signalling by ceramides. Biochimica Biophysica Acta，1998; 1391(1):92～109
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7.Fuchs SY, Fried VA, Ronai Z et al. Stress-activated kinases regulate protein stability. Oncogene, 1998; 17(11):1483～90
8.Zeng YX， Somasundaram K， el Deiry WS. AP2 inhibits cancer cell growth and activates p21WAF1/CIP1 expression. Nat Genet,1997;15(1):78～82
9.Sawada N, Kojima,T,Obata H et al.p21WAF1/CIP1/SDI1 is expressed at G1 phase in primary culture of hepatocytes from old rats, presumably preventingthe cellfrom entering the S phase of the cell cycle. Biochem Biophys Res Commun,1996; 228(3):819～24, 百拇医药
摘 要 目的 了解第二信使神经酰胺信号转导对鼻咽癌细胞生长的影响。方法 采用MTT法检测神经酰胺对鼻咽癌细胞株(CNE 2)增殖的抑制作用。光镜观察、荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡改变。Western blot法检测p21WAF1的表达。结果 神经酰胺在6.25、12.5、25、50 μm浓度下，对CNE 2细胞生长有明显的抑制作用，流式细胞仪检测发现亚G1峰出现，荧光染色可见核荧光强度增加、核片段化和凋亡小体。p21WAF1蛋白表达明显上调。结论 神经酰胺能诱导鼻咽癌细胞株CNE 2凋亡，且上调p21WAF1蛋白表达。p21WAF1可能是神经酰胺诱导鼻咽癌细胞凋亡中起作用的因素之一。
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关键词：神经酰胺 凋亡 p21WAF1
神经酰胺是一种抑制性第二信使，参与多种细胞功能，如分化、凋亡、生长停止、细胞因子合成和分泌、免疫反应等[1]。许多因素如放射、抗癌药物、热休克等刺激能激活神经酰胺信号途经。神经酰胺可以直接调控神经酰胺激活的蛋白激酶和磷酸酶，从而调控Rb磷酸化状态、紧张激活的蛋白激酶(JNK或SAPK/JNK)途经和蛋白水解酶系统，发挥其生物学作用[2]。另外，PKC的激活、Bcr-Abl和bcl-2的表达能抑制此信号途径[3，4]。临床上鼻咽癌以放疗为主，对药物中等敏感，放疗或某些抗癌药物可能会激活神经酰胺信号通路从而发挥其作用。本实验应用外源性加入神经酰胺了解其在鼻咽癌细胞中的生物学作用。
1 材料与方法
1.1 材料 人鼻咽癌细胞株(CNE 2)由本室传代保株。MTT为Janssen Chimica公司产品。RPMI 1640培养基、溴化丙啶、C2-神经酰胺、DMSO均为Sigma公司产品。p21WAF1抗体为Pharmingen公司产品，聚丙烯酰胺、双聚丙烯酰胺、SDS等为宝灵曼公司产品。
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1.2 方法
1.2.1 体外噻唑兰(MTT)法 取对数生长的CNE 2细胞1.0×107.L-1加入96孔板中，每孔0.2 ml。设阴性对照组，阳性对照药顺铂(DDP)和不同浓度的C2-神经酰胺，每组设4个平行孔，置37培养72 h，实验终止前4 h加入MTT液，再培养4 h，测试前弃去培养液，加0.2 ml DMSO，待结晶溶解后在酶联检测仪上于570 nm波长测每孔的OD值。按下列公式求出生长抑制率。再按Bliss法计算机程序，求出半数抑制浓度(IC50值)。
1.2.2 光镜观察 取处于对数生长期的CNE 2细胞，稀释成1×107.L-1，接种于96孔板上培养，设无药对照和不同浓度神经酰胺处理组，48 h后，倒置显微镜下观察，并摄影记录。
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1.2.3 荧光染色 取处于对数生长期的CNE 2细胞，稀释成1×107.L-1，接种于6孔板上培养，设无药对照组和不同浓度神经酰胺处理组，48 h后，PBS洗涤2次，涂片，甲醇：冰醋酸固定20 min后，加入100 μmol.L-1 Hoechst 33342液染色15 min，清水冲洗后，荧光显微镜下观察。
1.2.4 流式细胞术 取不同浓度神经酰胺处理的CNE 2细胞，胰酶消化后，PBS洗涤2次，体积分数为70%乙醇固定过液，加入溴化丙啶(PI，10 mg.L-1)染色5 min后，在流式细胞仪(Becton Dickinson公司产品)上用488 nm激发光激发检测DNA含量，LYSIS软件(Becton Dickinson公司产品)分析。
1.2.5 Western blot法检测 无药处理组和12.5、25、50 μmol.L-1浓度的C2-神经酰胺处理2×106 CNE 2细胞24 h后，胰酶消化后，PBS洗涤2次，加入细胞裂解液100 μl，100℃下10 min。Western blot实验方法参考分子克隆实验指南[5]，SDS电泳后电转移至硝酸纤维素膜上，50 g.L-1脱脂牛奶封闭再加入抗p21WAF1抗体，2 h后，TBS缓冲液洗涤3次，每次10 min。然后加入二抗，2.5 h后，加入化学发光剂，再放入暗盒并压片，10 min后，显影、定影。
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2 结果
2.1 C2-神经酰胺对鼻咽癌细胞CNE 2增殖的影响 在6.25、12.5、25、50 μmol.L-1浓度下，C2-神经酰胺对CNE 2细胞生长抑制率分别为20.8%±3.5%、40.0%±2.9%、72.5%±5.8%、75.8%±6.1%，IC50值为16.25(13.7, 19.3)μmol.L-1。
2.2 光镜观察 C2-神经酰胺加入CNE 2细胞中后，24 h开始可见细胞分离，生长停止，细胞开始死亡。无药对照组细胞生长旺盛，贴壁生长、细胞之间紧密接触无分离。见图1。
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Fig 1 Growth inhibition by ceramide in NPC cell line CNE 2
A:0.1% DMSO;B:50 μmol.L-1 ceramide
2.3 荧光染色 研究结果显示C2-神经酰胺处理的CNE 2细胞Hoechst 33342染色后，细胞核内可见浓染致密的颗粒荧光，典型细胞可见新月形改变，固缩或片段化的核，而正常细胞核呈弥散均匀的荧光、荧光较弱。见图2。
Fig 2 Fluorescent micrographs of CNE 2 cells treated for 24 h with 1 g.L-1 DMSO(A) or 25 μmol.L-1 ceramide (B) and stained with Hoechst 33342
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2.4 流式细胞仪检测 C2-神经酰胺处理的CNE 2细胞，在流式细胞仪上检测可见明显的亚G1峰。在浓度为0、6.25、12.5、25、50 μmol.L-1处理48 h后，C2-神经酰胺诱导CNE 2细胞凋亡的指数分别为 4.1%、16.9%、46.8%、54.9%、79.4%；10 μmol.L-1 C2-神经酰胺处理CNE 2细胞0、12、24、48 h，凋亡指数分别为4.2%、3.1%、16.2%、32.1%。流式细胞仪分析的图形见图3。
Fig 3 Flow cytometric analyses of CNE 2 cells treated with 1 g.L-1 DMSO(A) or ceramide 6.25(B), 12.5 (C), 25(D), 50(E) μmol.L-1 for 24 h
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2.5 Western blot检测p21WAF1表达 C2-神经酰胺和溶剂分别处理的CNE 2细胞，Western blot检测可见溶剂处理的CNE 2细胞无p21WAF1表达，不同浓度C2-神经酰胺处理的CNE 2可见明显的p21WAF1蛋白条带。
3 讨论
神经酰胺是一种抑制性第二信使，神经酰胺信号途径是一独特、进化上保守的信号系统，与cAMP和磷酸肌醇途径相似，大多数哺乳动物细胞表现为能够传递神经酰胺信号。神经酰胺是神经鞘磷脂经神经鞘磷脂酶水解而产生的。神经酰胺产生的另一条途径为神经酰胺合成酶合成二氢神经酰胺，接下来迅速氧化产生神经酰胺[6]。细胞在受到刺激后神经酰胺立即升高，随后稳定，1 h或几小时后表现为持续升高。最后在鞘氨醇-1-磷酸激酶作用下，磷酸化成为鞘氨醇-1-磷酸从而失去作用[2]。神经酰胺在不同的细胞中表现的功能不同，有分化、凋亡、衰老甚至增殖。本实验结果表明神经酰胺信号转导在鼻咽癌细胞中的功能是诱导凋亡。神经酰胺诱导凋亡的机制被认为主要是相关于JNK途径的激活和caspase途径的激活[2]。但精确的机制还不太清楚。SAPK/JNK信号系统涉及MEKK 1，SEK，SAPK和c-jun的序贯激活。细胞中神经酰胺的升高显著地激活SAPK/JNK联连反应，JNK激活c-jun，从而激活许多基因的表达诱导凋亡。本实验发现神经酰胺能诱导鼻咽癌细胞凋亡，并上调p21WAF1的表达。鼻咽癌细胞为p53基因功能异常的细胞(未出版的资料)，异常的p53功能不能上调p21WAF1的表达，所以神经酰胺诱导p21WAF1的表达应为p53非依赖性途径。神经酰胺信号转导主要被认为是激活JNK通路，JNK激活后可激活c-jun的表达，c-jun与c-fos结合形成AP-1因子，AP-1转录因子可以直接调控p21WAF1的表达[8]，这可能是神经酰胺调节p21WAF1表达的机制。p21WAF1参与多种细胞功能，它主要是参与细胞周期的调控[9]，抑制CDK从而使细胞停止于G1期；另外p21WAF1参与凋亡的诱导以及细胞分化和衰老调控。神经酰胺诱导鼻咽癌细胞凋亡且上调p21WAF1表达，因此神经酰胺信号转导可能在鼻咽癌治疗中具有重要的作用，下一步将对此进行深入研究。
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曾益新，男，38岁，研究员，博士生导师
朱孝峰(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
张晓实(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
李志铭(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
姚毓奇(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
刘宗潮(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
谢冰芬(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
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曾益新(中山医科大学肿瘤防治中心治疗基础室，广州 510060)
参考文献
1.Hannun YA. Functions of ceramide in coordinating cellular responses to stress. Science, 1996; 274(5294):1855～9
2.Haimovitz-Friedman A, Kolesnick RN, Fuks Z. Ceramide signaling in apoptosis. British Med Bull, 1997; 53(3):539～53
3.Zhang J, Alter N, Reed J et al. bcl-2 interrupts the ceramide-mediated pathway of cell death. PNAS, 1996; 93(11):5325～8
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4.Sawai H, Okazaki T, Takeda Y et al. Ceramide-induced translocation of protein kinase C-delta and epsilon to the cytosol. Implications in apoptosis.J Biol Chem, 1997;272(4):2452～8
5.Sambrook J ed. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd， Cold spring harbor laboratory press, 1989:888～98
6.Gomez-Munoz A. Modulation of cell signalling by ceramides. Biochimica Biophysica Acta，1998; 1391(1):92～109
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7.Fuchs SY, Fried VA, Ronai Z et al. Stress-activated kinases regulate protein stability. Oncogene, 1998; 17(11):1483～90
8.Zeng YX， Somasundaram K， el Deiry WS. AP2 inhibits cancer cell growth and activates p21WAF1/CIP1 expression. Nat Genet,1997;15(1):78～82
9.Sawada N, Kojima,T,Obata H et al.p21WAF1/CIP1/SDI1 is expressed at G1 phase in primary culture of hepatocytes from old rats, presumably preventingthe cellfrom entering the S phase of the cell cycle. Biochem Biophys Res Commun,1996; 228(3):819～24, 百拇医药