τ蛋白磷酸化位点与其促微管组装及与微管结合活性的体外分析
τ蛋白磷酸化位点与其促微管组装及与微管结合活性的体外分析
王建枝 魏泽兰 王群等
摘 要 目的 探讨Alzheimer病(AD)τ蛋白异常磷酸化位点与其促微管组装及与微管结合活性抑制的关系。方法 采用超速离心和离子交换柱层析法分离制备重组τ蛋白及τ蛋白的体外磷酸化，以FeCl3亲和柱分离纯化32Pτ肽，手工Edman降解和氨基酸自动分析仪鉴定32P τ肽磷酸氨基酸位点。 结果 (1) 酪蛋白激酶-1(CK-1)、cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)和糖元合成酶激酶-3(GSK-3)的磷酸化作用可不同程度地抑制τ蛋白的功能，CK-1或PKA的预处理可明显增强GSK-3对τ促微管组装活性的抑制，其中PKA加GSK-3的抑制作用最强。(2) 单纯GSK-3磷酸化τ蛋白的位点为：苏氨酸(Thr)-181，丝氨酸(Ser)-184，Ser-262，Ser-356和Ser-400，而GSK-3对PKA预处理τ蛋白的磷酸化位点为：Ser-195，Ser-198，Ser-199，Ser-202，Ser-235，Ser-262，Ser-356，Ser-404，Thr-205和Thr-231。其中Ser-198，Ser-199，Ser-202，Thr-205，Thr-231，Ser-235，Ser-262，Ser-400和Ser-404为AD患者τ蛋白异常磷酸化位点。此外，Ser-262磷酸化仅轻度抑制τ蛋白活性，而Ser-198，Ser-199，Ser-202，Thr-231，Ser-235，Ser-400和Ser-404位点则同时存在于胎脑τ蛋白中。结论 Thr-205的磷酸化可能是导致τ蛋白促微管组装活性高度抑制的AD τ蛋白特异性异常磷酸化位点。
, http://www.100md.com
关键词：τ蛋白 磷酸化 Alzheimer病 蛋白激酶
微管相关τ蛋白的异常磷酸化和异常糖基化是Alzheimer病(AD)神经原纤维变性的基础[1，2]。过度磷酸化使τ蛋白失去其促微管组装和维持微管稳定的生物学功能，从而导致神经系统微管结构破坏，并被异常修饰的τ蛋白所形成的神经原纤维缠结所取代[3]。AD τ蛋白已发现的21个异常磷酸化位点中，有9个同时存在于胎脑τ蛋白中[4]。但高度磷酸化作用不影响胎脑τ蛋白的上述生物学活性。可见，ADτ蛋白的失活可能与其特定位点磷酸化有关。为证实这一假设，本实验对τ蛋白促微管组装活性及其磷酸化位点的关系进行了研究。
材料和方法
τ蛋白样品的制备 重组人类τ蛋白(τ3L)的cDNA由英国牛津大学Goedert博士提供。τ3L的制备根据Goedert法[5]进行如下改进：将收获的含重组τ3L的细胞于80 mmol/L 2-氮氧六环乙磺酸(2-[morpholino] ethane sulfonic acid, pH6.8 含5 mmol/L DTT)溶液中进行超声破碎，120 000×g 离心后，其上清液用磷酸纤维素柱层析分离，用免疫印迹法确定τ蛋白的洗脱峰。收集富含τ蛋白的组分于沸水浴中煮沸5 min后，用过氯酸抽提。所纯化的τ蛋白达凝胶电泳蛋白染色单点纯。CK-1和GSK-3由纽约州立基础研究所Singh博士[6]提供。GSK-3制剂中α和β同工异构体的比例为1∶3。1U CK-1或GSK-3分别定义为在30℃、每分钟催化掺入1 nmol 32P-ATP以磷酸化(4 mg/ml)酪蛋白或(1 mg/ml)鞘脂碱性蛋白所需CK-1或GSK-3的量。PKA催化亚基购自Sigma公司。用改良Lowry法测定蛋白质含量。
, 百拇医药
τ蛋白的磷酸化 将1 mg/ml τ3L 分别与400 mU/ml CK-1，6 μg/ml PKA和350 mU/ml GSK-3在磷酸化缓冲液(7 mmol/L MgCl2、12 mmol/L β-ME、 0.5 mmol/L ATP、20 mmol/L Hepes pH7.5)中30℃保温4 h。在检测蛋白激酶的协同效应时，先加入CK-1或PKA和非标记ATP保温2 h后，于95℃加热5 min，10 000×g离心10 min后，于上清液中加入GSK-3和32P-ATP，再于30℃保温4 h。τ蛋白促微管组装和微管结合活性的测定参照文献[2，7]。
τ蛋白的胰酶降解及32P多肽的纯化 将单纯GSK-3和PKA加GSK-3处理的τ蛋白分别按1∶1混合后用胰蛋白酶在50 mmol/L NH3HCO3(pH8.0)缓冲液中消化36 h后，再用FeCl3亲和柱以不同浓度和pH的醋酸胺缓冲液进行洗脱分离，大约87%(GSK-3)和97%(PKA+GSK-3)的32P多肽的活性在1%醋酸胺(pH8.5)缓冲液中洗脱。收集各组分后，再用C18反相高效液相层析(RP-HPLC)柱以0～35%乙腈(溶于含0.1%三氟乙酸的水溶液)线性梯度(0.005 min)进行层析纯化，以1 ml/min、每管0.3 ml收集洗脱液，真空干燥后待用。
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手工Edman降解及自动氨基酸序列分析 将RP-HPLC纯化的32Pτ肽重悬于50%乙腈水溶液，取部分样品加于SequelonTM AA Disk (Millipore)，用苯异硫腈和三氟乙酸分别修饰和降解N-末端氨基酸，收集每次循环降解液进行真空干燥后，再用Cerenkov法测定其放射活性，从而确定磷酸化氨基酸所在位置；同时，将同一样品的另一部分用氨基酸自动分析仪进行氨基酸序列分析，以确定τ蛋白的磷酸化位点。
统计学处理 数据以(x±s)表示，组间差异的显著性采用方差分析。
结果
磷酸化对τ蛋白微管结合活性的抑制 CK-1、GSK-3和PKA分别使用时对τ蛋白的微管结合活性分别抑制约10%～20%，而CK-1或PKA与GSK-3的联合应用，则使上述抑制作用增高至40%～50%，PKA与GSK-3联合应用的抑制作用最强(附表)。
, 百拇医药
附表 不同蛋白激酶对τ蛋白微管结合活性的影响
Table Effect of different kinases on microtubule
binding activity of τ protein(x±s,n=12)
Number
Phosphorylation
τ binding activity (%)
1
None
94.1±5.2
2
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CK-1
87.3±6.1
3
GSK-3
86.8±4.6
4
PKA
81.4±10.1
5
CK-1+GSK-3
61.2±5.2*
6
, 百拇医药 PKA+GSK-3
50.5±6.6*
*P<0.01 compared with number 1 to 4 (Varience analysis); Q value: 5 vs 1～4 are 20.0,15.7,15.2,12.5;6 vs 1～4 are 26.2,21.9,21.4,18.7 respectively
磷酸化对τ蛋白促微管组装活性的抑制 CK-1、PKA和GSK-3的磷酸化对τ蛋白促微管组装生物学活性具有强度递增的抑制效应，CK-1和PKA分别与GSK-3的联合使用进一步增强对τ蛋白上述功能的抑制，同样，PKA与GSK-3联合应用的抑制作用最强(图1)。
图 1 不同蛋白激酶对τ蛋白促微管组装的影响
Fig 1 Effect of different kinases on microtubule assembly promoting activity of τ protein
, http://www.100md.com
a.normal τ control； b.CK-1； c.GSK-3； d.PKA；
e.CK-1+GSK-3； f.PKA+GSK-3； g.tubulin control；
OD: optical density
τ蛋白磷酸化位点的检测 单纯GSK-3磷酸化τ蛋白的位点为：Thr-181、Ser-184、Ser-262、Ser-356和Ser-400，它们在τ蛋白中的序列分别为：Thr-181至赖氨酸(Lys)-190、异亮氨酸(Ile)-260至Lys-267、Ile-354至Lys-369和Ser-396至精氨酸(Arg)-406;而经PKA预处理后，GSK-3磷酸化τ蛋白的位点则为：Ser-195、Ser-198、Ser-199、Ser-202、Ser-235、Ser-262、Ser-356、Ser-404、Thr-205和Thr-231，其在τ分子中的序列为：Ser-195至Arg-209、Thr-231至Lys-240、Ile-260至Lys-267、Ile-354至Lys-369和Ser-396至Arg-406(图2)。
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图 2 不同蛋白激酶作用时τ蛋白磷酸化位点图谱
Fig 2 Phosphorylation sites mapping of τ protein phosphorylated by PKA plus GSK-3 (Ⅰ to Ⅷ) or by GSK-3 alone (Ⅸ to ⅩⅠⅠ)
The sequence is the longest human τ isoform, τ441 and the asterisks indicate the phosphorylation sites
讨论
蛋白激酶对τ蛋白磷酸化的正性协同作用 AD患者τ蛋白的异常磷酸化与蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶调节失衡有关。对蛋白磷酸酯酶在τ蛋白异常磷酸化中的作用已有深入研究[1，3，8]，而对蛋白激酶的有关影响却知之甚少。根据丝氨酰/苏氨酰蛋白激酶的催化序列是否依赖脯氨酸，可将其分为脯氨酸指导的蛋白激酶(PDPK)和非脯氨酸指导的蛋白激酶(non-PDPK)。在AD患者τ蛋白中，已经发现的21个异常磷酸化位点中，有10个PDPK和11个non-PDPK位点[4]。可见，PDPK和non-PDPK可能均参与AD的发病过程。CK-1、PKA和GSK-3在体外均可催化重组τ蛋白磷酸化，将GSK-3分别与τ蛋白保温4 h，τ蛋白的32P掺入量约为1.7～3.0 mol/mol，然而，PKA预处理可明显增强GSK-3对τ蛋白的磷酸化，使其32P掺入量分别增高至3.2～4.0 mol/mol[9]。提示：non-PDPK的预处理可明显促进PDPK对τ的磷化作用。
, 百拇医药
τ蛋白促微管组装及与微管结合活性的抑制可能与其特定位点磷酸化有关 经CK-1、PKA和GSK-3单独处理的τ蛋白促微管组装及与微管结合的生物学活性比未经处理的τ低，CK-1或PKA与GSK-3联合使用进一步抑制τ的上述生物学活性。根据32P的掺入量，CK-1使τ蛋白磷酸化的程度比PKA和GSK-3高[9]，但CK-1的磷酸化对τ蛋白生物学活性的抑制比PKA、GSK-3弱(图1和附表)。可见，τ蛋白生物学活性的抑制除与其磷酸化程度有关外，其分子特定位点的磷酸化可能起更重要的作用。
Thr-205可能是导致ADτ蛋白生物学活性抑制的关键性磷酸化位点 在单纯GSK-3磷酸化的位点中，Ser-262和Ser-400为AD τ蛋白的异常磷酸化位点，根据上述磷酸化仅轻度抑制τ蛋白的生物学功能，说明Ser-262和Ser-400可能不是决定τ蛋白生物活性的关键性位点，这一结果与Singh等[7]的报道相符。在PKA和GSK-3联合磷酸化所得的8个ADτ蛋白位点中，Ser-262同时存在于单纯GSK-3磷酸化的τ蛋白样品中，Ser-198、Ser-199、Ser-202、Thr-231、Ser-235和Ser-404 6个位点同时存在于胎脑τ蛋白中[4]，而Thr-205则可能是唯一引起τ蛋白生物学活性丧失且特异性地存在于ADτ蛋白的异常磷酸化位点。因此推测Thr-205可能是引起AD患者τ蛋白生物学活性丧失的关键性位点，而导致Thr-205磷酸化的蛋白激酶(系统)可能是AD神经原纤维变性的责任酶。
, http://www.100md.com
本研究结果为AD的发病机制提出了一种新的见解，为其防治途径的探讨提供了新线索。由于Thr-205的磷酸化尚不能完全抑制τ蛋白的生物学活性，可能存在的其它调节机制，尚待深入研究。
(致谢：氨基酸序列分析曾得到斯坦福大学医学中心Smith A 教授的帮助)
国家自然科学基金(39770175)资助
王建枝(同济医科大学， 病理生理教研室，武汉 430030)
魏泽兰(同济医科大学， 病理生理教研室，武汉 430030)
王群(同济医科大学， 病理生理教研室，武汉 430030)
Inge Grundke-Iqbal(同济医科大学， 病理生理教研室，武汉 430030)
, 百拇医药
Khalid Iqbal(同济医科大学， 病理生理教研室，武汉 430030)
参考文献
1 Wang JZ, Grundke-Iqbal I, Iqbal K. Restoration of biological activity of Alzheimer abnormally phosphorylated tau by dephosphorylation with PP-2A，PP-2B and PP-1. Mol Brain Res, 1996, 38:200-208
2 Wang JZ, Grundke-Iqbal I, Iqbal K. Glycoslation of tau: an abnormal posttranslational modification in Alzheimer disease. Nature Med, 1996, 2(8):971-976
, 百拇医药
3 Wang JZ, Gong CX, Zaidi T, et al. Dephosphorylation of Alzheimer paired helical filaments by PP-2A and PP-2B. J Biol Chem, 1995, 270(9):4854-4860
4 Morishima-Kawashima M, Hasegawa M, Takio K, et al. Proline-directed and non-proline-directed phosphorylation of PHF-tau. J Biol Chem, 1995, 270:823-829
5 Goedert M, Jake R. Expression of separate isoforms of human tau protein: correlation with the tau pattern in brain and effects on tubulin polymerization. EMBO J, 1990, 9:4225-4230
, 百拇医药
6 Sengupta A, Wu QL, Grundke-Iqbal I, et al. Potentiation of GSK-3-activated Alzheimer-like phosphorylation of human tau by cdk5. Mol Cell Biochem, 1997, 70:765-768
7 Singh TJ, Wang JZ, Novak M, et al. Calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ phosphorylates tau at ser-262 but only partially inhibits its binding to microtubules. FEBS Lett, 1996, 387:145-148
8 Gong CX, Wang JZ, Grundke-Iqbal I, et al. Phosphatase activity towards abnormally phosphorylated tau: decrease in Alzheimer disease brain. J Neurochem, 1995, 65:732-738
9 王建枝，王 群，吴琼莉，等.蛋白激酶对τ蛋白的阿尔茨海默样磷酸化的调节作用.生物化学与生物物理进展，1999，26(4)：373-402, 百拇医药
王建枝 魏泽兰 王群等
摘 要 目的 探讨Alzheimer病(AD)τ蛋白异常磷酸化位点与其促微管组装及与微管结合活性抑制的关系。方法 采用超速离心和离子交换柱层析法分离制备重组τ蛋白及τ蛋白的体外磷酸化，以FeCl3亲和柱分离纯化32Pτ肽，手工Edman降解和氨基酸自动分析仪鉴定32P τ肽磷酸氨基酸位点。 结果 (1) 酪蛋白激酶-1(CK-1)、cAMP依赖性蛋白激酶(PKA)和糖元合成酶激酶-3(GSK-3)的磷酸化作用可不同程度地抑制τ蛋白的功能，CK-1或PKA的预处理可明显增强GSK-3对τ促微管组装活性的抑制，其中PKA加GSK-3的抑制作用最强。(2) 单纯GSK-3磷酸化τ蛋白的位点为：苏氨酸(Thr)-181，丝氨酸(Ser)-184，Ser-262，Ser-356和Ser-400，而GSK-3对PKA预处理τ蛋白的磷酸化位点为：Ser-195，Ser-198，Ser-199，Ser-202，Ser-235，Ser-262，Ser-356，Ser-404，Thr-205和Thr-231。其中Ser-198，Ser-199，Ser-202，Thr-205，Thr-231，Ser-235，Ser-262，Ser-400和Ser-404为AD患者τ蛋白异常磷酸化位点。此外，Ser-262磷酸化仅轻度抑制τ蛋白活性，而Ser-198，Ser-199，Ser-202，Thr-231，Ser-235，Ser-400和Ser-404位点则同时存在于胎脑τ蛋白中。结论 Thr-205的磷酸化可能是导致τ蛋白促微管组装活性高度抑制的AD τ蛋白特异性异常磷酸化位点。
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关键词：τ蛋白 磷酸化 Alzheimer病 蛋白激酶
微管相关τ蛋白的异常磷酸化和异常糖基化是Alzheimer病(AD)神经原纤维变性的基础[1，2]。过度磷酸化使τ蛋白失去其促微管组装和维持微管稳定的生物学功能，从而导致神经系统微管结构破坏，并被异常修饰的τ蛋白所形成的神经原纤维缠结所取代[3]。AD τ蛋白已发现的21个异常磷酸化位点中，有9个同时存在于胎脑τ蛋白中[4]。但高度磷酸化作用不影响胎脑τ蛋白的上述生物学活性。可见，ADτ蛋白的失活可能与其特定位点磷酸化有关。为证实这一假设，本实验对τ蛋白促微管组装活性及其磷酸化位点的关系进行了研究。
材料和方法
τ蛋白样品的制备 重组人类τ蛋白(τ3L)的cDNA由英国牛津大学Goedert博士提供。τ3L的制备根据Goedert法[5]进行如下改进：将收获的含重组τ3L的细胞于80 mmol/L 2-氮氧六环乙磺酸(2-[morpholino] ethane sulfonic acid, pH6.8 含5 mmol/L DTT)溶液中进行超声破碎，120 000×g 离心后，其上清液用磷酸纤维素柱层析分离，用免疫印迹法确定τ蛋白的洗脱峰。收集富含τ蛋白的组分于沸水浴中煮沸5 min后，用过氯酸抽提。所纯化的τ蛋白达凝胶电泳蛋白染色单点纯。CK-1和GSK-3由纽约州立基础研究所Singh博士[6]提供。GSK-3制剂中α和β同工异构体的比例为1∶3。1U CK-1或GSK-3分别定义为在30℃、每分钟催化掺入1 nmol 32P-ATP以磷酸化(4 mg/ml)酪蛋白或(1 mg/ml)鞘脂碱性蛋白所需CK-1或GSK-3的量。PKA催化亚基购自Sigma公司。用改良Lowry法测定蛋白质含量。
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τ蛋白的磷酸化 将1 mg/ml τ3L 分别与400 mU/ml CK-1，6 μg/ml PKA和350 mU/ml GSK-3在磷酸化缓冲液(7 mmol/L MgCl2、12 mmol/L β-ME、 0.5 mmol/L ATP、20 mmol/L Hepes pH7.5)中30℃保温4 h。在检测蛋白激酶的协同效应时，先加入CK-1或PKA和非标记ATP保温2 h后，于95℃加热5 min，10 000×g离心10 min后，于上清液中加入GSK-3和32P-ATP，再于30℃保温4 h。τ蛋白促微管组装和微管结合活性的测定参照文献[2，7]。
τ蛋白的胰酶降解及32P多肽的纯化 将单纯GSK-3和PKA加GSK-3处理的τ蛋白分别按1∶1混合后用胰蛋白酶在50 mmol/L NH3HCO3(pH8.0)缓冲液中消化36 h后，再用FeCl3亲和柱以不同浓度和pH的醋酸胺缓冲液进行洗脱分离，大约87%(GSK-3)和97%(PKA+GSK-3)的32P多肽的活性在1%醋酸胺(pH8.5)缓冲液中洗脱。收集各组分后，再用C18反相高效液相层析(RP-HPLC)柱以0～35%乙腈(溶于含0.1%三氟乙酸的水溶液)线性梯度(0.005 min)进行层析纯化，以1 ml/min、每管0.3 ml收集洗脱液，真空干燥后待用。
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手工Edman降解及自动氨基酸序列分析 将RP-HPLC纯化的32Pτ肽重悬于50%乙腈水溶液，取部分样品加于SequelonTM AA Disk (Millipore)，用苯异硫腈和三氟乙酸分别修饰和降解N-末端氨基酸，收集每次循环降解液进行真空干燥后，再用Cerenkov法测定其放射活性，从而确定磷酸化氨基酸所在位置；同时，将同一样品的另一部分用氨基酸自动分析仪进行氨基酸序列分析，以确定τ蛋白的磷酸化位点。
统计学处理 数据以(x±s)表示，组间差异的显著性采用方差分析。
结果
磷酸化对τ蛋白微管结合活性的抑制 CK-1、GSK-3和PKA分别使用时对τ蛋白的微管结合活性分别抑制约10%～20%，而CK-1或PKA与GSK-3的联合应用，则使上述抑制作用增高至40%～50%，PKA与GSK-3联合应用的抑制作用最强(附表)。
, 百拇医药
附表 不同蛋白激酶对τ蛋白微管结合活性的影响
Table Effect of different kinases on microtubule
binding activity of τ protein(x±s,n=12)
Number
Phosphorylation
τ binding activity (%)
1
None
94.1±5.2
2
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CK-1
87.3±6.1
3
GSK-3
86.8±4.6
4
PKA
81.4±10.1
5
CK-1+GSK-3
61.2±5.2*
6
, 百拇医药 PKA+GSK-3
50.5±6.6*
*P<0.01 compared with number 1 to 4 (Varience analysis); Q value: 5 vs 1～4 are 20.0,15.7,15.2,12.5;6 vs 1～4 are 26.2,21.9,21.4,18.7 respectively
磷酸化对τ蛋白促微管组装活性的抑制 CK-1、PKA和GSK-3的磷酸化对τ蛋白促微管组装生物学活性具有强度递增的抑制效应，CK-1和PKA分别与GSK-3的联合使用进一步增强对τ蛋白上述功能的抑制，同样，PKA与GSK-3联合应用的抑制作用最强(图1)。
图 1 不同蛋白激酶对τ蛋白促微管组装的影响
Fig 1 Effect of different kinases on microtubule assembly promoting activity of τ protein
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a.normal τ control； b.CK-1； c.GSK-3； d.PKA；
e.CK-1+GSK-3； f.PKA+GSK-3； g.tubulin control；
OD: optical density
τ蛋白磷酸化位点的检测 单纯GSK-3磷酸化τ蛋白的位点为：Thr-181、Ser-184、Ser-262、Ser-356和Ser-400，它们在τ蛋白中的序列分别为：Thr-181至赖氨酸(Lys)-190、异亮氨酸(Ile)-260至Lys-267、Ile-354至Lys-369和Ser-396至精氨酸(Arg)-406;而经PKA预处理后，GSK-3磷酸化τ蛋白的位点则为：Ser-195、Ser-198、Ser-199、Ser-202、Ser-235、Ser-262、Ser-356、Ser-404、Thr-205和Thr-231，其在τ分子中的序列为：Ser-195至Arg-209、Thr-231至Lys-240、Ile-260至Lys-267、Ile-354至Lys-369和Ser-396至Arg-406(图2)。
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图 2 不同蛋白激酶作用时τ蛋白磷酸化位点图谱
Fig 2 Phosphorylation sites mapping of τ protein phosphorylated by PKA plus GSK-3 (Ⅰ to Ⅷ) or by GSK-3 alone (Ⅸ to ⅩⅠⅠ)
The sequence is the longest human τ isoform, τ441 and the asterisks indicate the phosphorylation sites
讨论
蛋白激酶对τ蛋白磷酸化的正性协同作用 AD患者τ蛋白的异常磷酸化与蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶调节失衡有关。对蛋白磷酸酯酶在τ蛋白异常磷酸化中的作用已有深入研究[1，3，8]，而对蛋白激酶的有关影响却知之甚少。根据丝氨酰/苏氨酰蛋白激酶的催化序列是否依赖脯氨酸，可将其分为脯氨酸指导的蛋白激酶(PDPK)和非脯氨酸指导的蛋白激酶(non-PDPK)。在AD患者τ蛋白中，已经发现的21个异常磷酸化位点中，有10个PDPK和11个non-PDPK位点[4]。可见，PDPK和non-PDPK可能均参与AD的发病过程。CK-1、PKA和GSK-3在体外均可催化重组τ蛋白磷酸化，将GSK-3分别与τ蛋白保温4 h，τ蛋白的32P掺入量约为1.7～3.0 mol/mol，然而，PKA预处理可明显增强GSK-3对τ蛋白的磷酸化，使其32P掺入量分别增高至3.2～4.0 mol/mol[9]。提示：non-PDPK的预处理可明显促进PDPK对τ的磷化作用。
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τ蛋白促微管组装及与微管结合活性的抑制可能与其特定位点磷酸化有关 经CK-1、PKA和GSK-3单独处理的τ蛋白促微管组装及与微管结合的生物学活性比未经处理的τ低，CK-1或PKA与GSK-3联合使用进一步抑制τ的上述生物学活性。根据32P的掺入量，CK-1使τ蛋白磷酸化的程度比PKA和GSK-3高[9]，但CK-1的磷酸化对τ蛋白生物学活性的抑制比PKA、GSK-3弱(图1和附表)。可见，τ蛋白生物学活性的抑制除与其磷酸化程度有关外，其分子特定位点的磷酸化可能起更重要的作用。
Thr-205可能是导致ADτ蛋白生物学活性抑制的关键性磷酸化位点 在单纯GSK-3磷酸化的位点中，Ser-262和Ser-400为AD τ蛋白的异常磷酸化位点，根据上述磷酸化仅轻度抑制τ蛋白的生物学功能，说明Ser-262和Ser-400可能不是决定τ蛋白生物活性的关键性位点，这一结果与Singh等[7]的报道相符。在PKA和GSK-3联合磷酸化所得的8个ADτ蛋白位点中，Ser-262同时存在于单纯GSK-3磷酸化的τ蛋白样品中，Ser-198、Ser-199、Ser-202、Thr-231、Ser-235和Ser-404 6个位点同时存在于胎脑τ蛋白中[4]，而Thr-205则可能是唯一引起τ蛋白生物学活性丧失且特异性地存在于ADτ蛋白的异常磷酸化位点。因此推测Thr-205可能是引起AD患者τ蛋白生物学活性丧失的关键性位点，而导致Thr-205磷酸化的蛋白激酶(系统)可能是AD神经原纤维变性的责任酶。
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本研究结果为AD的发病机制提出了一种新的见解，为其防治途径的探讨提供了新线索。由于Thr-205的磷酸化尚不能完全抑制τ蛋白的生物学活性，可能存在的其它调节机制，尚待深入研究。
(致谢：氨基酸序列分析曾得到斯坦福大学医学中心Smith A 教授的帮助)
国家自然科学基金(39770175)资助
王建枝(同济医科大学， 病理生理教研室，武汉 430030)
魏泽兰(同济医科大学， 病理生理教研室，武汉 430030)
王群(同济医科大学， 病理生理教研室，武汉 430030)
Inge Grundke-Iqbal(同济医科大学， 病理生理教研室，武汉 430030)
, 百拇医药
Khalid Iqbal(同济医科大学， 病理生理教研室，武汉 430030)
参考文献
1 Wang JZ, Grundke-Iqbal I, Iqbal K. Restoration of biological activity of Alzheimer abnormally phosphorylated tau by dephosphorylation with PP-2A，PP-2B and PP-1. Mol Brain Res, 1996, 38:200-208
2 Wang JZ, Grundke-Iqbal I, Iqbal K. Glycoslation of tau: an abnormal posttranslational modification in Alzheimer disease. Nature Med, 1996, 2(8):971-976
, 百拇医药
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