丙型肝炎病毒与恶性疟原虫复合多表位抗原基因在小鼠及家兔中免疫应答的研究
http://www.100md.com
中国免疫学杂志 2000年第10期第16卷 分子与细胞免疫学
作者：黄建生 解咏梅 张潜 沈先荣 钟雄林 张丽芸 郭明秋 任大明
单位：解咏梅(复旦大学生命科学院，上海 200433)；张潜(复旦大学生命科学院，上海 200433)沈先荣(复旦大学生命科学院，上海 200433)；钟雄林(第一军医大学抗衰老研究室，广州 510515)
关键词：丙型肝炎病毒；恶性疟原虫；多表位抗原；DNA疫苗；免疫应答
中国免疫学杂志001005 摘 要 目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)及恶性疟原虫(Pf)复合 DNA 疫苗的可行性。方法：把HCV复合多表位抗原基因PCX与Pf复合基因AB克隆到带CMV启动子的真核表达载体pcDNA3中，构建真核表达载体pcDNA3/CAB，肌肉注射免疫小鼠及家兔，检测其诱发特异性免疫应答水平及安全性。结果：小鼠及家兔分别于免疫后第6周及第8周可检测到抗GZ-PCX抗体，于第10周达最高，滴度分别为1：400及1：3 200，但持续时间较短；免疫血清可识别Pf抗原；免疫动物还可产生针对GZ-PCX融合蛋白的迟发性超敏反应；免疫后小鼠体重正常，肝脾脏未见明显肿大，具有良好的安全性。结论：HCV/Pf双价多表位DNA抗原基因在小鼠及家兔中可诱发特异性免疫应答，但抗体的持续时间较短。
, http://www.100md.com
中国图书分类号 R979.5
Immunogenicity of a hybrid multiple epitopes antigen gene of hepatitis C virus and P.falciparum in mice and rabbits
HUANG Jian-Sheng，XIE Yong-Mei，ZHANG Qian
(School of Life Science,Fudan University,Shanghai 200433)
Abstract Objective:To explore the possibility of a bivalent DNA vaccine specific for hepatitis C virus (HCV) and Plasmodium falciparum(Pf).Methods:Two synthetic multiple epitopes antigen gene PCX of HCV and AB of Pf were cloned into eukaryotic vector pcDNA3 with CMV promoter to construct a HCV/Pf eukaryotic expression vector pcDNA3/CAB.Humoral and cellular immunity and safety were studied after the plasmid was genetically immunized mice and rabbits.Results:Specific antibodies against GZ-PCX antigen were detected at week 6th and 8th in mice and rabbits and the highest titers of anti-GZ-PCX IgG were 1:400 and 1:3 200,respectively.The immunized antisera also recognized Pf antigen.Delayed type hypersensitivity (DTH)reactions were induced by GZ-PCX protein.The body weight immunized mice and rabbit were normal and no obvious toxicity appeared.Conclusion:The study shows that the HCV/Pf hybrid antigen gene induced specific immune responses and might be able to provide some data for the researches of bivalent vaccine against HCV and Pf.
, 百拇医药
Key words Hepatitis C virus (HCV) Plasmodium falciparum Multiple epitopes antigen DNA vaccine Immune response
研究发现，丙型肝炎与疟疾的感染具有一定的相关性[1，2]，因此设计一种能同时针对这两种广泛流行的疾病，特别是可诱发高水平细胞免疫应答的疫苗，将具有重要的意义。本研究将人工合成的已经被证实具有良好免疫原性的HCV多表位复合抗原基因PCX[3]及Pf复合多价疫苗基因AB(SPf66+SPf105)[4]串联起来，克隆到真核表达载体pcDNA3中，研究该HCV/Pf双价抗原基因在小鼠及家兔体内的免疫应答及安全性。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药 1.1.1 质粒与菌株 质粒pUC119/PCX及大肠杆菌TG1为复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室提供；质粒 pWR/AB[4]、pcDNA3为第一军医大学钟雄林老师及王昌才教授惠赠。
1.1.2 试剂 限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自Promega公司；HRP-兔抗鼠IgA、小牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；HRP-羊抗兔IgG、HRP-兔抗鼠IgG购自Calbiochem-Novabiochem International Inc.；蛋白质GZ-PCX为我室纯化样品[5],Pf抗原为第一军医大学热带医学研究所毕惠祥老师赠送。
1.1.3 动物 ICR小鼠及新西兰家兔均购自海军医学研究所实验动物中心，健康6周龄小鼠17～21 g，新西兰家兔2～2.5 kg。每组小鼠8只，家兔3只。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 真核表达载体的构建[6] pUC119/PCX、pWR/AB分别经SalI/BamHI双酶切后，用胶回收Kit(华舜生物工程公司)分别回收前者的大片段及后者的AB基因小片段，常规连接、转化及筛选重组子pUC119/CAB(PCX与AB连接的片段命名为CAB),再用HindⅢ/BamHI酶切回收CAB片段，与载体pcDNA3的相应酶切片段连接，构建重组子pcDNA3/CAB。
1.2.2 DNA免疫 参照文献大量抽提质粒DNA，获得的高纯度DNA用于腿部肌肉注射免疫ICR小鼠及新西兰家兔，免疫量分别为0.1、1.0 mg/(只*次)，隔周连续免疫3次。免疫后隔2～4 w采集血清1次。
1.2.3 抗GZ-PCX IgG的检测 ELISA方法参照文献[7]，以GZ-PCX或Pf抗原包被，二抗为HRP-羊抗兔及HRP-兔抗鼠IgG，1：10 000稀释。
, 百拇医药 1.2.4 迟发性超敏反应(DTH) 用GZ-PCX抗原注射于小鼠后足趾皮下或家兔腿部皮内，注射剂量分别为10、50 μg，观察注射部位的变化。
1.2.5 安全性 免疫各周分别称取各组小鼠平均体重，观察小鼠及家兔的行为、存活率及肝脾大小。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定及大量抽提质粒的质量检测 经琼脂糖凝胶电泳及酶切鉴定，证实获得正确的重组克隆pUC119/CAB及pcDNA3/CAB质粒(图略)。大量抽提的质粒DNA pcDNA3及pcDNA3/CAB，经检测后发现两者的OD260/OD280比例均在1.8～1.9之间(表1)。琼脂糖凝胶电泳发现，绝大部分DNA为超螺旋结构(图略)，可见所用于免疫的质粒DNA质量较好。
2.2 抗GZ-PCX IgG的检测 pcDNA3/CAB免疫小鼠及家兔后，均在第10周时可检测到最高水平的特异性抗GZ-PCX IgG抗体(1：400及1：3 200)，与对照载体组及空白对照组相比，存在显著差异(P<0.001及P<0.05)，但高水平抗体的持续时间较短(图1)，其中家兔免疫后6月，抗体水平又轻微回升。
, 百拇医药
表1 用于免疫的质粒DNA质量检测
Tab.1 Detection of DNA quality using for immunization Plasmid
OD260
OD280
OD260/OD280
Diluted
times
Concentration
(mg/ml)
pcDNA3
, http://www.100md.com
2.32
1.284
1.81
300
34.80
pcDNA3/CAB
1.338
0.718
1.86
300
20.07
图1 家兔及小鼠基因免疫后抗-GZ-PCX IgG的检测结果(血清1：100稀释)
, http://www.100md.com
Fig.1 Detection of anti-GZ-PCX IgG in rabbits and mice after genetic immunization (antiserum 1:100 dilution)
2.3 抗Pf IgG的检测 疫苗组第10周家兔免疫血清可以特异识别Pf抗原，其平均OD490nm值0.087(0.091，0.076，0.089，0.092)高于载体0.032(0.020，0.043，0.031，0.036)及空白组0.029(0.019，0.023，0.040，0.035)(P<0.05)，提示pcDNA3/CAB免疫后可诱发针对Pf抗原的特异性IgG反应，这与GZ-CAB蛋白免疫小鼠血清可特异识别Pf抗原的结果相符[8]。
2.4 迟发性超敏反应(DTH)结果 免疫后第4周，各组小鼠均未诱发针对GZ-PCX的明显DTH反应，至第8周时，疫苗组部分小鼠(5/8)DTH反应阳性，而对照组均未见阳性反应。家兔于免疫后第4周，疫苗组开始出现轻微的DTH反应，至第12周时，可诱发较明显的DTH反应，与载体及空白对照组相比，P<0.01。
, 百拇医药
2.5 安全性 小鼠体重动态分析表明，pcDNA3/CAB免疫后体重未见显著改变，免疫小鼠及家兔均未见明显异常及死亡，小鼠肝脾大小未见明显变化，可见DNA疫苗免疫比较安全。
3 讨论
我们设计的HCV复合多表位抗原，已经被证实具有良好的HCV免疫特异性，其融合表达产物可用于检测抗HCV，并可有效诱导免疫应答。但由于该基因太小，其基因疫苗pcDNA3/PCX在小鼠及家兔中均未能诱发理想的免疫应答，因此我们把HCV与Pf基因连接后，以增加外源基因的分子量，期望能够提高在体内所表达的外源蛋白的稳定性，继而诱发较高水平的免疫应答。
本研究利用了带强CMV启动子的真核表达载体，虽然pcDNA3/CAB肌肉注射免疫小鼠及家兔后可诱发针对GZ-PCX融合蛋白的特异性抗体，但其滴度只有1：102～1：103水平，明显低于在大肠杆菌中所表达的GZ-CAB融合蛋白质所诱发的高水平抗体反应(1：105)及细胞免疫应答[8]。我们还尝试直接把DNA皮下注射免疫及直接涂试于皮肤上，但均未诱发明显的特异性免疫应答。
, http://www.100md.com
免疫后小鼠体重未见下降，肝脾无肿大，未见其它明显的毒副作用，可见DNA注射免疫较为安全。本研究在于探讨HCV/Pf复合双价多表位DNA疫苗的可行性，为HCV/Pf DNA双价疫苗研究提供一些实验依据。
本研究得到复旦大学遗传学研究所张伯生副教授、姚锡惠老师等；海军医学研究所贾福星教授、朱炳钗教授、陈铁河老师、雷呈祥老师、陈金国老师的指点及帮助，在此我们表示衷心的谢意!
(编辑 张 慧)
作者简介：黄建生，男，31岁，遗传学博士；
指导教师，任大明，教授，男，博士生导师，主要研究分子遗传学
作者单位：黄建生(第一军医大学抗衰老研究室，广州 510515)
张丽芸(第一军医大学抗衰老研究室，广州 510515)
, 百拇医药
郭明秋(第一军医大学抗衰老研究室，广州 510515)
任大明(复旦大学生命科学院，上海 200433)
参考文献
1，陈素良，张志坤，赵 勇 et al.单采血浆还输血细胞引起疟疾和丙型肝炎的流行病学研究.中国公共卫生，1995；11(1)：1
2，钱 朴，吴定芬.输血后疟疾的预防措施及与丙肝抗体检测关系之探讨.中原医刊，1996；31(5)：24
3，黄建生，解咏梅，林元凯 et al.丙型肝炎病毒复合多表位抗原基因的高效表达及表达产物免疫原性的初步研究.微生物学报，1999；39(3)：268
4，王昌才，钟雄林，陈仕荣 et al.恶性疟原虫杂合抗原基因的表达及其产物免疫功能的研究.上海免疫学杂志，1997；17(3)：139
, 百拇医药
5，黄建生，解咏梅，沈先荣 et al.HCV 多表位抗原基因与β-半乳糖苷酶基因融合表达、产物纯化及酶活性分析.复旦学报，1998；37(4)：551
6，Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular cloning.New York：Cold Spring Harbor Laborarory Press,1989：28
7，Huang J S,Wang C C,Ren D M et al.Immunogenicity of recombinant at tenuatd Salmonella typhimurium expressing a 45-peptide hybrid antigen gene of plasmodium falciparum.J Med Col PLA,1997;12(2):166
8，黄建生，钟雄林，毕惠祥 et al.丙型肝炎病毒及恶性疟原虫复合多表位抗原基因与谷胱甘肽转硫酶基因的融合表达及其在小鼠中免疫应答的研究.中国免疫学杂志，1999；15(6)：250
[收稿1999-03-15，修回1999-11-12], 百拇医药
单位：解咏梅(复旦大学生命科学院，上海 200433)；张潜(复旦大学生命科学院，上海 200433)沈先荣(复旦大学生命科学院，上海 200433)；钟雄林(第一军医大学抗衰老研究室，广州 510515)
关键词：丙型肝炎病毒；恶性疟原虫；多表位抗原；DNA疫苗；免疫应答
中国免疫学杂志001005 摘 要 目的：探讨丙型肝炎病毒(HCV)及恶性疟原虫(Pf)复合 DNA 疫苗的可行性。方法：把HCV复合多表位抗原基因PCX与Pf复合基因AB克隆到带CMV启动子的真核表达载体pcDNA3中，构建真核表达载体pcDNA3/CAB，肌肉注射免疫小鼠及家兔，检测其诱发特异性免疫应答水平及安全性。结果：小鼠及家兔分别于免疫后第6周及第8周可检测到抗GZ-PCX抗体，于第10周达最高，滴度分别为1：400及1：3 200，但持续时间较短；免疫血清可识别Pf抗原；免疫动物还可产生针对GZ-PCX融合蛋白的迟发性超敏反应；免疫后小鼠体重正常，肝脾脏未见明显肿大，具有良好的安全性。结论：HCV/Pf双价多表位DNA抗原基因在小鼠及家兔中可诱发特异性免疫应答，但抗体的持续时间较短。
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中国图书分类号 R979.5
Immunogenicity of a hybrid multiple epitopes antigen gene of hepatitis C virus and P.falciparum in mice and rabbits
HUANG Jian-Sheng，XIE Yong-Mei，ZHANG Qian
(School of Life Science,Fudan University,Shanghai 200433)
Abstract Objective:To explore the possibility of a bivalent DNA vaccine specific for hepatitis C virus (HCV) and Plasmodium falciparum(Pf).Methods:Two synthetic multiple epitopes antigen gene PCX of HCV and AB of Pf were cloned into eukaryotic vector pcDNA3 with CMV promoter to construct a HCV/Pf eukaryotic expression vector pcDNA3/CAB.Humoral and cellular immunity and safety were studied after the plasmid was genetically immunized mice and rabbits.Results:Specific antibodies against GZ-PCX antigen were detected at week 6th and 8th in mice and rabbits and the highest titers of anti-GZ-PCX IgG were 1:400 and 1:3 200,respectively.The immunized antisera also recognized Pf antigen.Delayed type hypersensitivity (DTH)reactions were induced by GZ-PCX protein.The body weight immunized mice and rabbit were normal and no obvious toxicity appeared.Conclusion:The study shows that the HCV/Pf hybrid antigen gene induced specific immune responses and might be able to provide some data for the researches of bivalent vaccine against HCV and Pf.
, 百拇医药
Key words Hepatitis C virus (HCV) Plasmodium falciparum Multiple epitopes antigen DNA vaccine Immune response
研究发现，丙型肝炎与疟疾的感染具有一定的相关性[1，2]，因此设计一种能同时针对这两种广泛流行的疾病，特别是可诱发高水平细胞免疫应答的疫苗，将具有重要的意义。本研究将人工合成的已经被证实具有良好免疫原性的HCV多表位复合抗原基因PCX[3]及Pf复合多价疫苗基因AB(SPf66+SPf105)[4]串联起来，克隆到真核表达载体pcDNA3中，研究该HCV/Pf双价抗原基因在小鼠及家兔体内的免疫应答及安全性。
1 材料与方法
1.1 材料
, 百拇医药 1.1.1 质粒与菌株 质粒pUC119/PCX及大肠杆菌TG1为复旦大学遗传学研究所遗传工程国家重点实验室提供；质粒 pWR/AB[4]、pcDNA3为第一军医大学钟雄林老师及王昌才教授惠赠。
1.1.2 试剂 限制性内切酶及T4 DNA连接酶购自Promega公司；HRP-兔抗鼠IgA、小牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司；HRP-羊抗兔IgG、HRP-兔抗鼠IgG购自Calbiochem-Novabiochem International Inc.；蛋白质GZ-PCX为我室纯化样品[5],Pf抗原为第一军医大学热带医学研究所毕惠祥老师赠送。
1.1.3 动物 ICR小鼠及新西兰家兔均购自海军医学研究所实验动物中心，健康6周龄小鼠17～21 g，新西兰家兔2～2.5 kg。每组小鼠8只，家兔3只。
1.2 方法
, 百拇医药
1.2.1 真核表达载体的构建[6] pUC119/PCX、pWR/AB分别经SalI/BamHI双酶切后，用胶回收Kit(华舜生物工程公司)分别回收前者的大片段及后者的AB基因小片段，常规连接、转化及筛选重组子pUC119/CAB(PCX与AB连接的片段命名为CAB),再用HindⅢ/BamHI酶切回收CAB片段，与载体pcDNA3的相应酶切片段连接，构建重组子pcDNA3/CAB。
1.2.2 DNA免疫 参照文献大量抽提质粒DNA，获得的高纯度DNA用于腿部肌肉注射免疫ICR小鼠及新西兰家兔，免疫量分别为0.1、1.0 mg/(只*次)，隔周连续免疫3次。免疫后隔2～4 w采集血清1次。
1.2.3 抗GZ-PCX IgG的检测 ELISA方法参照文献[7]，以GZ-PCX或Pf抗原包被，二抗为HRP-羊抗兔及HRP-兔抗鼠IgG，1：10 000稀释。
, 百拇医药 1.2.4 迟发性超敏反应(DTH) 用GZ-PCX抗原注射于小鼠后足趾皮下或家兔腿部皮内，注射剂量分别为10、50 μg，观察注射部位的变化。
1.2.5 安全性 免疫各周分别称取各组小鼠平均体重，观察小鼠及家兔的行为、存活率及肝脾大小。
2 结果
2.1 重组质粒的鉴定及大量抽提质粒的质量检测 经琼脂糖凝胶电泳及酶切鉴定，证实获得正确的重组克隆pUC119/CAB及pcDNA3/CAB质粒(图略)。大量抽提的质粒DNA pcDNA3及pcDNA3/CAB，经检测后发现两者的OD260/OD280比例均在1.8～1.9之间(表1)。琼脂糖凝胶电泳发现，绝大部分DNA为超螺旋结构(图略)，可见所用于免疫的质粒DNA质量较好。
2.2 抗GZ-PCX IgG的检测 pcDNA3/CAB免疫小鼠及家兔后，均在第10周时可检测到最高水平的特异性抗GZ-PCX IgG抗体(1：400及1：3 200)，与对照载体组及空白对照组相比，存在显著差异(P<0.001及P<0.05)，但高水平抗体的持续时间较短(图1)，其中家兔免疫后6月，抗体水平又轻微回升。
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表1 用于免疫的质粒DNA质量检测
Tab.1 Detection of DNA quality using for immunization Plasmid
OD260
OD280
OD260/OD280
Diluted
times
Concentration
(mg/ml)
pcDNA3
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2.32
1.284
1.81
300
34.80
pcDNA3/CAB
1.338
0.718
1.86
300
20.07
图1 家兔及小鼠基因免疫后抗-GZ-PCX IgG的检测结果(血清1：100稀释)
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Fig.1 Detection of anti-GZ-PCX IgG in rabbits and mice after genetic immunization (antiserum 1:100 dilution)
2.3 抗Pf IgG的检测 疫苗组第10周家兔免疫血清可以特异识别Pf抗原，其平均OD490nm值0.087(0.091，0.076，0.089，0.092)高于载体0.032(0.020，0.043，0.031，0.036)及空白组0.029(0.019，0.023，0.040，0.035)(P<0.05)，提示pcDNA3/CAB免疫后可诱发针对Pf抗原的特异性IgG反应，这与GZ-CAB蛋白免疫小鼠血清可特异识别Pf抗原的结果相符[8]。
2.4 迟发性超敏反应(DTH)结果 免疫后第4周，各组小鼠均未诱发针对GZ-PCX的明显DTH反应，至第8周时，疫苗组部分小鼠(5/8)DTH反应阳性，而对照组均未见阳性反应。家兔于免疫后第4周，疫苗组开始出现轻微的DTH反应，至第12周时，可诱发较明显的DTH反应，与载体及空白对照组相比，P<0.01。
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2.5 安全性 小鼠体重动态分析表明，pcDNA3/CAB免疫后体重未见显著改变，免疫小鼠及家兔均未见明显异常及死亡，小鼠肝脾大小未见明显变化，可见DNA疫苗免疫比较安全。
3 讨论
我们设计的HCV复合多表位抗原，已经被证实具有良好的HCV免疫特异性，其融合表达产物可用于检测抗HCV，并可有效诱导免疫应答。但由于该基因太小，其基因疫苗pcDNA3/PCX在小鼠及家兔中均未能诱发理想的免疫应答，因此我们把HCV与Pf基因连接后，以增加外源基因的分子量，期望能够提高在体内所表达的外源蛋白的稳定性，继而诱发较高水平的免疫应答。
本研究利用了带强CMV启动子的真核表达载体，虽然pcDNA3/CAB肌肉注射免疫小鼠及家兔后可诱发针对GZ-PCX融合蛋白的特异性抗体，但其滴度只有1：102～1：103水平，明显低于在大肠杆菌中所表达的GZ-CAB融合蛋白质所诱发的高水平抗体反应(1：105)及细胞免疫应答[8]。我们还尝试直接把DNA皮下注射免疫及直接涂试于皮肤上，但均未诱发明显的特异性免疫应答。
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免疫后小鼠体重未见下降，肝脾无肿大，未见其它明显的毒副作用，可见DNA注射免疫较为安全。本研究在于探讨HCV/Pf复合双价多表位DNA疫苗的可行性，为HCV/Pf DNA双价疫苗研究提供一些实验依据。
本研究得到复旦大学遗传学研究所张伯生副教授、姚锡惠老师等；海军医学研究所贾福星教授、朱炳钗教授、陈铁河老师、雷呈祥老师、陈金国老师的指点及帮助，在此我们表示衷心的谢意!
(编辑 张 慧)
作者简介：黄建生，男，31岁，遗传学博士；
指导教师，任大明，教授，男，博士生导师，主要研究分子遗传学
作者单位：黄建生(第一军医大学抗衰老研究室，广州 510515)
张丽芸(第一军医大学抗衰老研究室，广州 510515)
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郭明秋(第一军医大学抗衰老研究室，广州 510515)
任大明(复旦大学生命科学院，上海 200433)
参考文献
1，陈素良，张志坤，赵 勇 et al.单采血浆还输血细胞引起疟疾和丙型肝炎的流行病学研究.中国公共卫生，1995；11(1)：1
2，钱 朴，吴定芬.输血后疟疾的预防措施及与丙肝抗体检测关系之探讨.中原医刊，1996；31(5)：24
3，黄建生，解咏梅，林元凯 et al.丙型肝炎病毒复合多表位抗原基因的高效表达及表达产物免疫原性的初步研究.微生物学报，1999；39(3)：268
4，王昌才，钟雄林，陈仕荣 et al.恶性疟原虫杂合抗原基因的表达及其产物免疫功能的研究.上海免疫学杂志，1997；17(3)：139
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5，黄建生，解咏梅，沈先荣 et al.HCV 多表位抗原基因与β-半乳糖苷酶基因融合表达、产物纯化及酶活性分析.复旦学报，1998；37(4)：551
6，Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular cloning.New York：Cold Spring Harbor Laborarory Press,1989：28
7，Huang J S,Wang C C,Ren D M et al.Immunogenicity of recombinant at tenuatd Salmonella typhimurium expressing a 45-peptide hybrid antigen gene of plasmodium falciparum.J Med Col PLA,1997;12(2):166
8，黄建生，钟雄林，毕惠祥 et al.丙型肝炎病毒及恶性疟原虫复合多表位抗原基因与谷胱甘肽转硫酶基因的融合表达及其在小鼠中免疫应答的研究.中国免疫学杂志，1999；15(6)：250
[收稿1999-03-15，修回1999-11-12], 百拇医药