流式细胞术用于临床检验中的一些问题
陈珊珊
关键词：流式细胞仪(FCM)；临床检验 流式细胞仪(FCM)是用于研究细胞生物学的重要工具。其特点是快速、精确、多参数，相对定量测定单个细胞膜、胞浆、或核内的多种物质。自上个世纪70年代以来已较广泛地用于细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学等研究。近年来由于仪器进一步提高了自动化程度便于操作，多种单克隆抗体的制备成功以及多种荧光素的应用使FCM不仅局限于研究并已较广泛地用于临床诊断。20年前FCM在我国还是凤毛麟角，如今已有200余台分布于全国各大中小城市的科研与医疗机构。FCM虽然在我国起步较慢,但近年来的发展迅速。很多单位业已开展了不少工作。为使FCM更恰当地用于临床，现对日常工作中易发生的问题提出一些看法与同行商榷，望FCM的应用在我国能有更快速的发展。
1.FCM是一种十分精密的仪器，所测定的数据是相对的荧光量。其光路线路是否调试到最佳状态下直接影响数据结果。仪器本身虽已达到相当的自动化程度。其光路，线路等的标准化仍不可忽视。有关公司已推出多种质控试剂盒用于光路与流路校正、线性度测试、荧光强度标准化、颜色补偿等。以使一个实验室批间数据具重复性和其他实验室的数据具可比性。望同道们重视。
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2.FCM是依据相对荧光量来反映所测定的物质。因此，测定时相应的对照管是必不可少的。此外，不论是原标本中存在或标本制备过程中，人为因素造成的死细胞都会影响荧光参数。死细胞会成为G0/1期前峰，可误认为是亚二倍体峰或凋亡峰。死细胞超过20%免疫试验多不可靠。荧光素浓度、配伍不当，试剂的质量均会造成假阳性或假阴性结果。标本的制备过程虽不复杂但需严格。
3.细胞免疫功能测定是近年来国内应用最广泛的项目。不少单位简单地用细胞表面分化抗原(CD)3，CD4，CD8单参数来反映细胞免疫功能是不足的。因为真正的T辅助细胞是CD3+CD4+细胞。真正的T抑制细胞是CD3+CD8+细胞。所以应该用双标法来测定。此外，细胞免疫还应测定T与B细胞的比例和自然杀伤细胞(NK)，甚或胞内某些细胞因子。细胞免疫功能受多种生理、病理因素影响很大，下结论时应结合临床。细胞免疫参数异常对诊断获得性免疫缺陷病最有价值。CD4与CD8比例倒置，CD4+细胞绝对值明显下降需高度疑为获得性免疫缺乏综合征(AIDS)。但也可发生于其他疾病。因而需作进一步检查以明确之。
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4.FCM-免疫分型已是当今诊断白血病/淋巴瘤不可缺少的标准之一。间接免疫荧光标记法单参数测定已基本废弃。目前国际上惯用的是直接标记法2～4个荧光参数，CD45/SSC设门法。该法的优点是可以排除正常细胞的干扰，明确计算出幼稚细胞所占的百分率及其表型。标本中幼稚细胞数量低于50%或检测残存肿瘤细胞时尤为重要。设门后，定性分析比定量更为重要。结论中应说明幼稚细胞所占总有核细胞数的百分数及其表型特点。对典型表型可下肯定诊断，否则，应结合临床、细胞形态学甚或遗传学，分子生物学特征作出综合判断。FCM-免疫分型究竟还不是金标志。
5.造血干/祖细胞移植已较广泛用于治疗血液系统恶性肿瘤及某些遗传病。干/祖细胞的植入量是移植成功的关键，早期的造血重建依靠祖细胞量，持久的植活靠干细胞。所以测定移植物中干细胞及其亚群数量在选择采集干/祖细胞时机与预测移植效果至关重要，有核细胞数并不能正确反映干/祖细胞数。然而造血干/祖细胞不论在骨髓、动员后外周血或脐血中只约占1%～5%。FCM虽是相当精密的仪器，但对如此少量的细胞要保证测量的可靠性亦非易事。欧美各国均曾对造血干/祖细胞测定的质量控制进行过专题讨论会并制定一些方案。其原则是尽量排除死细胞、非造血细胞、单核细胞或荧光素颗粒等的干扰，设有不同的内参以保证测定真正的CD34+细胞。不同的公司也生产了相应的试剂盒，如BD公司的Pro Count，简化了操作程序控制质量标准，使测定结果具有重复性与可比性。
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6.随着医学的进展，更多的理论用于医学实践，FCM必将在临床医学中发挥更大的作用。例如80年代发现阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)的异常血细胞，缺乏一系列糖肌醇磷脂连接的膜蛋白。用FCM可精确测出红细胞、粒细胞、淋巴细胞膜CD55，CD59抗原表达百分数与相对量是诊断PNH的特异标志，还能了解病情。此法较用了半个世纪的Ham试验又精确又可靠。用FCM测定全血血小板粘附、聚集功能以及血小板活化等更能反映体内状况。血细胞的配型，移植免疫，白细胞的释放、趋化与吞噬功能，造血细胞的释放与归巢等不胜枚举。本期所刊登的论著反映了国内部分进展。有的尚有待于我们共同努力开发利用。总之是大有可为。
7.FCM标本要求是单个细胞悬液。血细胞有其天然优势，取材又方便，因而FCM在血液学中的应用发展最快。凡能制成单细胞悬液的组织不论是新鲜或蜡块组织或体液均可用FCM作相应的检测。如国外对淋巴瘤的诊断，FCM-免疫分型已是必不可少的一项检查。它能较快速的判断出T或B淋巴细胞亚型、细胞的大小、 DNA倍体及细胞周期。与病理学检查结合可作出更精确的诊断。
8.FCM有别于一般的生化仪、血球计数仪等医疗仪器。需要根据检测的目的来判断和分析数据结果。所以检测人员与临床医师应相互配合共同完成。
可以预计在未来的10年中FCM在医学中的应用必会有更大的发展。望同道携手前进。
作者单位：陈珊珊(100034 北京大学人民医院血液病研究所), 百拇医药
关键词：流式细胞仪(FCM)；临床检验 流式细胞仪(FCM)是用于研究细胞生物学的重要工具。其特点是快速、精确、多参数，相对定量测定单个细胞膜、胞浆、或核内的多种物质。自上个世纪70年代以来已较广泛地用于细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学等研究。近年来由于仪器进一步提高了自动化程度便于操作，多种单克隆抗体的制备成功以及多种荧光素的应用使FCM不仅局限于研究并已较广泛地用于临床诊断。20年前FCM在我国还是凤毛麟角，如今已有200余台分布于全国各大中小城市的科研与医疗机构。FCM虽然在我国起步较慢,但近年来的发展迅速。很多单位业已开展了不少工作。为使FCM更恰当地用于临床，现对日常工作中易发生的问题提出一些看法与同行商榷，望FCM的应用在我国能有更快速的发展。
1.FCM是一种十分精密的仪器，所测定的数据是相对的荧光量。其光路线路是否调试到最佳状态下直接影响数据结果。仪器本身虽已达到相当的自动化程度。其光路，线路等的标准化仍不可忽视。有关公司已推出多种质控试剂盒用于光路与流路校正、线性度测试、荧光强度标准化、颜色补偿等。以使一个实验室批间数据具重复性和其他实验室的数据具可比性。望同道们重视。
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2.FCM是依据相对荧光量来反映所测定的物质。因此，测定时相应的对照管是必不可少的。此外，不论是原标本中存在或标本制备过程中，人为因素造成的死细胞都会影响荧光参数。死细胞会成为G0/1期前峰，可误认为是亚二倍体峰或凋亡峰。死细胞超过20%免疫试验多不可靠。荧光素浓度、配伍不当，试剂的质量均会造成假阳性或假阴性结果。标本的制备过程虽不复杂但需严格。
3.细胞免疫功能测定是近年来国内应用最广泛的项目。不少单位简单地用细胞表面分化抗原(CD)3，CD4，CD8单参数来反映细胞免疫功能是不足的。因为真正的T辅助细胞是CD3+CD4+细胞。真正的T抑制细胞是CD3+CD8+细胞。所以应该用双标法来测定。此外，细胞免疫还应测定T与B细胞的比例和自然杀伤细胞(NK)，甚或胞内某些细胞因子。细胞免疫功能受多种生理、病理因素影响很大，下结论时应结合临床。细胞免疫参数异常对诊断获得性免疫缺陷病最有价值。CD4与CD8比例倒置，CD4+细胞绝对值明显下降需高度疑为获得性免疫缺乏综合征(AIDS)。但也可发生于其他疾病。因而需作进一步检查以明确之。
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4.FCM-免疫分型已是当今诊断白血病/淋巴瘤不可缺少的标准之一。间接免疫荧光标记法单参数测定已基本废弃。目前国际上惯用的是直接标记法2～4个荧光参数，CD45/SSC设门法。该法的优点是可以排除正常细胞的干扰，明确计算出幼稚细胞所占的百分率及其表型。标本中幼稚细胞数量低于50%或检测残存肿瘤细胞时尤为重要。设门后，定性分析比定量更为重要。结论中应说明幼稚细胞所占总有核细胞数的百分数及其表型特点。对典型表型可下肯定诊断，否则，应结合临床、细胞形态学甚或遗传学，分子生物学特征作出综合判断。FCM-免疫分型究竟还不是金标志。
5.造血干/祖细胞移植已较广泛用于治疗血液系统恶性肿瘤及某些遗传病。干/祖细胞的植入量是移植成功的关键，早期的造血重建依靠祖细胞量，持久的植活靠干细胞。所以测定移植物中干细胞及其亚群数量在选择采集干/祖细胞时机与预测移植效果至关重要，有核细胞数并不能正确反映干/祖细胞数。然而造血干/祖细胞不论在骨髓、动员后外周血或脐血中只约占1%～5%。FCM虽是相当精密的仪器，但对如此少量的细胞要保证测量的可靠性亦非易事。欧美各国均曾对造血干/祖细胞测定的质量控制进行过专题讨论会并制定一些方案。其原则是尽量排除死细胞、非造血细胞、单核细胞或荧光素颗粒等的干扰，设有不同的内参以保证测定真正的CD34+细胞。不同的公司也生产了相应的试剂盒，如BD公司的Pro Count，简化了操作程序控制质量标准，使测定结果具有重复性与可比性。
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6.随着医学的进展，更多的理论用于医学实践，FCM必将在临床医学中发挥更大的作用。例如80年代发现阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)的异常血细胞，缺乏一系列糖肌醇磷脂连接的膜蛋白。用FCM可精确测出红细胞、粒细胞、淋巴细胞膜CD55，CD59抗原表达百分数与相对量是诊断PNH的特异标志，还能了解病情。此法较用了半个世纪的Ham试验又精确又可靠。用FCM测定全血血小板粘附、聚集功能以及血小板活化等更能反映体内状况。血细胞的配型，移植免疫，白细胞的释放、趋化与吞噬功能，造血细胞的释放与归巢等不胜枚举。本期所刊登的论著反映了国内部分进展。有的尚有待于我们共同努力开发利用。总之是大有可为。
7.FCM标本要求是单个细胞悬液。血细胞有其天然优势，取材又方便，因而FCM在血液学中的应用发展最快。凡能制成单细胞悬液的组织不论是新鲜或蜡块组织或体液均可用FCM作相应的检测。如国外对淋巴瘤的诊断，FCM-免疫分型已是必不可少的一项检查。它能较快速的判断出T或B淋巴细胞亚型、细胞的大小、 DNA倍体及细胞周期。与病理学检查结合可作出更精确的诊断。
8.FCM有别于一般的生化仪、血球计数仪等医疗仪器。需要根据检测的目的来判断和分析数据结果。所以检测人员与临床医师应相互配合共同完成。
可以预计在未来的10年中FCM在医学中的应用必会有更大的发展。望同道携手前进。
作者单位：陈珊珊(100034 北京大学人民医院血液病研究所), 百拇医药