抗肿瘤细胞多药抗性核酶的合成及其活性的研究
抗肿瘤细胞多药抗性核酶的合成及其活性的研究
王福生 雷周云 金磊 Takao Ohunma
摘 要 目的 研究抗肿瘤细胞多药抗性(MDR)核酶的生物学活性及其稳定性。方法 构建表达抗MDR1核酶的逆转录病毒载体(N2A+tRNAmeti-196 MDR1-Rz、N2A+tRNAmeti-196 MDR1-sRz、N2A+tRNAmeti-1iMDR1-sRz)和合成了裸核酶cDNA。利用体外转录反应合成5种anti-MDR1核酶(tRNA-196MDR1-Rz、tRNA-196MDR1-sRz、tRNA-iMDR1-sRz、196MDR1-sRz和196MDR1-Rz)及相应的底物A和底物B。在无细胞体系中检测了各种核酶的切割活性和它们对核酸酶降解的稳定性。结果 anti-MDR1核酶均能有效发挥切割作用。其中嵌合型核酶的活性高于裸核酶，而且经过stem-Ⅱ碱基修饰的核酶催化活性较高。核酶的稳定性依次是tRNA-196MDR1-sRz(嵌合型)>tRNA -196MDR1-Rz =196MDR1-sRz(裸核酶)。在对照组，突变的tRNA-mut-iMDR1-sRz没有切割活性。结论 核酶分子经过stem-Ⅱ碱基修饰和与tRNA串联形成嵌合型核酶增强了核酶的切割活性。
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主题词：多药抗药性；核酶；信使核糖核酸
在恶性肿瘤的化疗过程中，肿瘤细胞产生的多药抗性(multidrug resistance, MDR)是普遍存在的现象[1，2]。目前已证实，MDR1基因过度表达产生大量的P-glycoprotein(Pgp, 170 000)是一种常见的MDR。如何能有效地逆转Pgp介导的MDR？以往的研究表明，虽然利用抗MDR1 mRNA的核酶在RNA水平上能有效地阻止MDR1基因的过度表达，但是在耐药的肿瘤细胞中，MDR仍然难以完全逆转[3]。其原因除了存在非Pgp介导的MDR因素以外，就核酶本身而言，核酶的活性和结构的稳定性也是影响因素。为了进一步提高核酶分子的稳定性以及它的生物学活性，我们在以往工作的基础上，从以下几个方面进行了改进：(1)对核酶的stem-Ⅱ结构中4个碱基进行了修饰。(2)将tRNA分子和核酶串联起来，形成嵌合型tRNA-Rz[4]。(3)为了进一步在耐药肿瘤细胞中研究核酶的生物学活性，构建了具有高效转移能力、能表达嵌合型tRNA-Rz的逆转录病毒载体[5]。现将有关的研究结果报告如下。
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Stem-Ⅱ碱基修饰的核酶是iMDR1-sRz和196MDR1-sRz；下方分别是196MDR1-Rz和突变的核酶mut-iMDR1-sRz；Intron代表内含子，exon表示外显子
图1 人MDR1基因和抗MDR1 mRNA锤头状核酶设计示意图
材料与方法
一、抗MDR1 mRNA锤头状核酶的设计和合成
本研究中的4个核酶均为锤头状核酶(图1)。编码这4个锤头状核酶的寡核苷酸单链的序列见表1。双链DNA的锤头状核酶通过退火两条互补的寡核苷酸链获得，后者两端分别携带有Mlu Ⅰ和Sac Ⅱ的限制性内切酶的位点。
二、构建含抗MDR1核酶的逆转录病毒载体
上述锤头状核酶cDNA经过5′-端磷酸化后，在T4连接酶的作用下，插入到逆转录病毒载体N2A+ tRNAmeti的polymerase Ⅲ启动子和tRNAmeti基因下游的Sac Ⅱ/Mlu Ⅰ位点中[6]，分别形成N2A+tRNAmeti-196MDR1-Rz、N2A+ tRNAmeti-196MDR1-sRz、N2A+tRNAmeti-iMDR1-sRz 和N2A+tRNAmeti-mut-iMDR1-sRz。在poly Ⅲ作用下，高效表达嵌合型核酶分子。分别将构建好的4种重组逆转录病毒载体转化感受态的DH5α E. Coli细菌体内，初步筛选含阳性克隆的菌落，进行少量载体DNA纯化，用于酶切分析和DNA测序鉴定。
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三、体外转录反应合成核酶和相应的底物RNA
1.制备嵌合核酶的模板DNA：体外转录4种嵌合型核酶(tRNA-196MDR1-Rz、tRNA -196MDR1-sRz、tRNA-iMDR1- sRz和tRNA-mut-iMDR1-sRz)的cDNA模板用PCR扩增，PCR共用引物是Rz-Pr1 5′TAATACGACTCACTATAGGGCGA AGCAGAGTGGCGC-AGCGGAA-3′ (43 mer划线的序列代表体外转录的T7启动子)； Rz-Pr2 5′-TACTTAAGCTAGCACGC-GTCCA-3′ (22 mer，由美国Genset公司合成和纯化)。PCR的模板分别来自上述重组的逆转录病毒载体(N2A+tRNAmeti-196MDR1-Rz、N2A+tRNAmeti-196MDR1-sRz、N2A+tRNAmeti-iMDR1-sRz和N2A+tRNAmeti-mut-iMDR1-sRz)。PCR的条件是在50 μl的PCR反应体系中，加1.5U的Taq DNA多聚酶，PCR条件同文献[3]。PCR产物从5′至3′端依次是T7启动子、tRNA序列和核酶的序列，它们的核苷酸长度分别为tRNA-196MDR1-Rz 145 bp、tRNA-196MDR1-sRz 145 bp和tRNA-iMDR1- sRz 146 bp。
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2.制备裸核酶(196MDR1-sRz和196MDR1-Rz)的模板DNA：先合成3条寡核苷酸链，Rz-sense:5′-TAATACGACTCACTAT-AGGGCGAGTTGCCATTCTGATGG-AG-3′；196MDR1-sRz-antisense：5′-TCTTTCAGTTTCGTCCTCACGGAC-TCATCAGAATGG-3′；196MDR1-Rz-antisense: 5′-TCTTTCAGTTTCGGC-CTTTCGGCCTCATCAGAATGG-3′。具体步骤同文献[3]。
3.制备底物A和底物B模板DNA：相应于上述核酶的底物RNA分子有两种，即底物A(185 bp)和底物B(191 bp)，分别对应于全长MDR1 mRNA的转录起始区-72nt～113nt和第196位编码子区域的520 nt～710 nt[6]。底物
表1 4种抗MDR1mRNA核酶的寡核苷酸链的序列
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核酶引物
序 列
196MDR1-Rz+
5′GGTTGCCATTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGAAAGCGTTTTTGGA-3′
196MDR1-Rz-
5′CGCGTCCAAAAACGTCTTTCAGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAATGGCAACCCGC-3′
196MDR1-sRz+
5′GGGTTGCCATTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTGAAAGACGTTTTTGGA-3′
, 百拇医药 196MDR1-sRz-
5′CGCGTCCAAAAACGTCTTTCAGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGAATGGCAACCCGC-3′
iMDR1-sRz+
5′GGATCCATCCCCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCTCGCGCCGTTTTTGGA-3′
iMDR1-sRz-
5′CGCGTCCAAAAACGGCGCGAGGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGGGGTAGGATCCCGC-3′
mut-iMDR1-sRz+
5′GGATCCATCCCCTtATGAGGCCGAAAGGCCGAcACCTCGCGCCGTTTTTGGA-3′
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mut-iMDR1-sRz-
5′CGCGTCCAAAAACGGCGCGAGGTgTCGGCCTTTCGGCCTCATaAGGGGTAGGATCCCGC-3′
注：划线的部分是polymer aseⅢ终止子序列；小写字母代表突变的碱基cDNA模板来自pMDR2000XS质粒，用PCR方法扩增。底物A的引物为：SaPr-1，5′ TAATACGACT-CACTATAGGGCGACCACTAAAGTCGGAGTATCTTC-3′ (45 mer，划线的序列代表体外转录的T7启动子，后续的22个核苷酸是MDR1 mRNA转录起始区的-72至-50核苷酸)；SaPr-2，5′-GAAAATACACTGA-CAGTTGGT-3′ (21 mer，相应于MDR1 mRNA的113～93区域的核苷酸)。底物B的引物为：SbPr-1，5′TAATACGACTCAC TATAGGGCGACGACTTACAGATG-ATGTCTCT-3′(44 mer，非划线的序列21个核苷酸是MDR1 mRNA 520～540之间的核苷酸)；SbPr-2，5′-AGATAGTATCTTTGCCCAGACA-3′ (22 mer，相应于MDR1 mRNA 710～689之间的核苷酸)。
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4.体外转录反应制备核酶和底物RNAs：用T7体外转录试剂盒(Ambion公司)合成4种核酶和2种相应的底物RNA。体外转录反应步骤同试剂盒的说明书。完成体外转录反应后，所有的样品在含有8 mol/L尿素的8%丙烯酰胺凝胶中进行电泳(120 V，7～8 h)，在暗室将底片轻压于凝胶上曝光40 min，然后显影[3]。
四、无细胞体系中抗MDR1核酶切割活性检测
将核酶和相应的底物RNA按2∶1(核酶10 pmol：底物5 pmol)比例混合于10 μl反应体积缓冲液中，内含50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L EDTA溶液。反应混合物加热至95℃ 2 min，然后立即在冰上冷却。 再加入MgCl2浓度至5 mmol/L，在37℃温育，在不同的时间加热至95℃ 3 min。用电泳方法(同步骤3)分析核酶的切割活性[3]。
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五、抗MDR1核酶的稳定性检测
为了检测各种核酶对核酸酶降解的稳定性，我们将5 pmol RNA分子与不同浓度的人AB血清(用50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，5 mmol/L MgCl2溶液稀释)在37℃共同温育，不同时间终止反应，用电泳方法(同步骤3)分析核酶在核酸酶作用下的稳定性。结果
1.核酶的设计和逆转录病毒载体的构建：我们在催化切割MDR1 mRNA第196位GUC编码子(196MDR1-Rz)研究基础上，为了增加核酶结构上的稳定性，对核酶stem-Ⅱ结构中的4个碱基进行了改变，设计了196MDR1-sRz (U9→G9，U13→A13，G14→A14，A18→C18)[4]。除196MDR1-sRz外，我们还设计了stem-Ⅱ上经过修饰的、针对MDR1-mRNA转录起始部位的-6至-4GUC编码子的核酶(iMDR1-sRz)。在实验中还设计了点突变的修饰而丧失生物学活性的mut-iMDR1-sRz(G3→U3，A22→C22)和原有的196MDR1-Rz作为必要的对照(图1)。将锤头状核酶cDNA分别插入N2A+tRNAmeti载体的sac Ⅱ/mlu Ⅰ位点中，形成了N2A+tRNAmeti-196MDR1-Rz、N2A+tRNAmeti-196MDR1-sRz、N2A+tRNAmeti-iMDR1-sRz 和N2A+tRNAmeti-mut-iMDR1-sRz，在poly Ⅲ启动子的作用下，可高效表达嵌合型核酶分子[5]。
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2.核酶和底物RNA的合成：体外转录反应中所合成的核酶和底物RNAs均用[α-32P]-CTP标记，在8% 丙烯酰胺(含8 mol/L尿素)的凝胶中进行电泳。结果显示RNA分子完整，几乎未见到降解现象，而且所有RNA产物分子量的大小和预计的均完全一致(图2)。
3.核酶对相应的底物切割活性的分析：在体外无细胞体系中，3种核酶都有较高的催化切割活性(图3)。嵌合型核酶tRNA-iMDR1-sRz将底物A(185nt)切割成117nt(5′端)和68nt(3′端)两个片段，嵌合型核酶tRNA -196MDR1-Rz和tRNA -196MDR1-sRz将底物B(191nt)切割成69nt(5′端)和122nt(3′端)两个片段。应用激光密度扫描仪进行密度分析和比较发现，经过tRNA-iMDR1-sRz和tRNA -196MDR1-sRz作用12 h后，底物残存量仅为0.9%(图3A)和1.5%(图3B)，可见所有底物几乎完全被切割成产物。而在相同时间，经过tRNA-196MDR1-Rz切割的底物残存量为6.1%(图3C)。结果显示，tRNA-iMDR1-sRz和tRNA-196MDR1-sRz的催化切割活性比tRNA-196MDR1-Rz要高。我们在实验中发现，未嵌合的裸核酶196MDR1-Rz和196MDR1-sRz也可有效切割底物，在经过12 h的切割以后，裸核酶196 MDR1-sRz和196MDR1-Rz残存的底物分别是11%(图3D)和12.8%(图3E)。可见与前述3种嵌合型核酶相比，裸核酶活性要低一些。
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4.核酶RNA分子对核酸酶降解作用的稳定性：人AB血清中含有核酸酶，后者具有很强的降解RNA的作用。为了检测核酶的稳定性，我们检测了每一种核酶抗人AB血清中的核酸酶的作用。结果显示，各种核酶的稳定性依次是tRNA-196MDR1-sRz>tRNA -196MDR1-Rz =裸核酶196MDR1-sRz。与tRNA-196MDR1-Rz、裸核酶196MDR1-sRz相比，tRNA-196MDR1-sRz增强的活性和它本身抗核酸酶的消化作用是平行的。
iMDR1-sRz、196MDR1-sRz和196MDR1-Rz的长度分别为146 nt和145 nt；底物A和B分别为185 nt和191 nt；对照RNA为116 nt
图2 体外转录反应合成的核酶和相应的底物电泳分析结果
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讨论
核酶本身是一种RNA分子，因而能特异地识别MDR1 mRNA中 GUC序列，并产生有效的催化切割作用，使MDR1 mRNA失活，从而阻止Pgp的合成。应用核酶的优势在于核酶几乎没有毒副作用，它完成切割底物RNA后，还能重复对底物进行切割，而且能针对底物RNA中不同部位的GUC设计多种Rz，近年来又研制出高效率基因转移的载体，所以应用核酶抗MDR1基因的过度表达有着广泛的前景[7]。
我们观察到嵌合型tRNA-Rzs的催化切割活性高于相应的裸核酶的活性，其与tRNA分子嵌合型核酶可以提高抗MDR1核酶的活性。目前有关与tRNA分子连接的核酶活性研究并不一致，Cotton等[8]认为，包埋在tRNA分子中的核酶与裸核酶具有相同的催化切割活性；而Yuyama等[9]认为，包埋在tRNA分子中的核酶只有线性裸核酶活性的70%。目前对于这些差别的本质尚不完全清楚。推测可能与下列因素有关：①包埋在tRNA分子中的核酶有较大分子；②同时与原来裸核酶的三维立体结构不同，难以和具有特定三维立体结构的底物RNA分子内部切割位点的侧翼序列发生有效的结合；③串联的嵌合tRNA-Rz分子具有较简单的结构，且在稳定性方面可能与包埋在tRNA分子中的核酶相同。
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A：嵌合型核酶tRNA-iMDR1-sRz；B：tRNA-196MDR1-sRz；C：tRNA-196MDR1-Rz；D：裸核酶196MDR1-sRz；E：裸核酶196MDR1-Rz
图3 在无细胞体系中各种anti-MDR1核酶对底物A(substrate A)和底物B(substrate B)切割活性的比较
从理论上说，stem-Ⅱ的碱基修饰能增强核酶的稳定性，以前尚未有涉及核酶实际切割活性优势和它们抗核酸酶稳定性的报道。我们发现与未经修饰的裸核酶相比，stem-Ⅱ碱基修饰过的核酶增强了抗核酸酶降解的作用。由于stem-Ⅱ结构的稳定性与否直接关系到核酶的催化活性高低，所以实验中检测到增强的核酶活性可能来源于stem-Ⅱ碱基修饰的结果[3]。我们注意到嵌合型、stem-Ⅱ修饰的核酶和原始的未经修饰的核酶具有相似的核酸酶消化的方式，而嵌合型、stem-Ⅱ修饰的核酶和裸核酶被核酸酶消化的方式有所不同。目前这种差别的确切原因尚不清楚。
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本实验研究表明，经过stem Ⅱ碱基修饰和与tRNA串联形成的嵌合型核酶显著地增强了核酶的稳定性和切割MDR1 mRNA的活性，此结果为进一步研究核酶在肿瘤细胞内逆转MDR的生物学活性奠定了良好的基础[7，8]。
志谢 美国纽约西奈山医学院肿瘤系TJ Martell 基金的资助和肿瘤系H Kobayashi博士的帮助
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970831)
作者单位：王福生(100039 北京，解放军第三○二医院传染病研究所生物工程室)
雷周云(100039 北京，解放军第三○二医院传染病研究所生物工程室)
金磊(100039 北京，解放军第三○二医院传染病研究所生物工程室)
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Takao Ohunma(Division of Medical Oncology,Mount Sinai School of Medicine)
参考文献
1.Bellamy WT. P-glycoproteins and multidrug resistance. Ann Rev Pharmacol Toxicol，1996，36:161-183.
2.Pastan I, Gottesman MM, Lovelace UK, et al. A retrovirus carrying an MDR1 cDNA confers multidrug resistance and polarized expression of P-glycoprotein in MDCK cells. Proc Natl Acad Sci USA，1988，85:4486-4490.
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3.Kobayashi H, Dorai T, Holland JF, et al. Reversal of drug sensitivity in multidrug-resistant tumor cells by an MDR1(PGY1) ribozyme. Cancer Res，1994，54:1271-1275.
4.Sullenger BA, Lee TC, Smith CA,et al. Expression of chimeric tRNA-driven antisense transcripts renders NIH3T3 cells highly resistant to Moloney murine leukemia virus replication. Mol Cell Biol, 1990, 10:6512-6523.
5.Hantzopoulos PA, Sullenger BA, Ungers BA, et al. Improved gene expression upon transfer of the adenosine deaminase minigene outside of the transcriptional unit of a retroviral vector. Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86:3519-3523.
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6.Chen CJ, Chin JE, Ueda K, et al. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr1 (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells. Cell, 1986, 47:381-389.
7.Sullivan SM. Development of ribozymes for gene therapy. J Infest Dermatol, 1994, 103:85S-89S.
8.Cotton M, Birnstiel ML. Ribozyme mediated destruction of RNA in vivo. EMBO J, 1989, 8:3861-3866.
9.Yuyama N, Ohkawa J, Inokuchi Y, et al. Construction of a tRNA-embedded-ribozyme trimming plasmid. Biochem Biophys Res Comm, 1992, 186:1271-1279., 百拇医药
王福生 雷周云 金磊 Takao Ohunma
摘 要 目的 研究抗肿瘤细胞多药抗性(MDR)核酶的生物学活性及其稳定性。方法 构建表达抗MDR1核酶的逆转录病毒载体(N2A+tRNAmeti-196 MDR1-Rz、N2A+tRNAmeti-196 MDR1-sRz、N2A+tRNAmeti-1iMDR1-sRz)和合成了裸核酶cDNA。利用体外转录反应合成5种anti-MDR1核酶(tRNA-196MDR1-Rz、tRNA-196MDR1-sRz、tRNA-iMDR1-sRz、196MDR1-sRz和196MDR1-Rz)及相应的底物A和底物B。在无细胞体系中检测了各种核酶的切割活性和它们对核酸酶降解的稳定性。结果 anti-MDR1核酶均能有效发挥切割作用。其中嵌合型核酶的活性高于裸核酶，而且经过stem-Ⅱ碱基修饰的核酶催化活性较高。核酶的稳定性依次是tRNA-196MDR1-sRz(嵌合型)>tRNA -196MDR1-Rz =196MDR1-sRz(裸核酶)。在对照组，突变的tRNA-mut-iMDR1-sRz没有切割活性。结论 核酶分子经过stem-Ⅱ碱基修饰和与tRNA串联形成嵌合型核酶增强了核酶的切割活性。
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主题词：多药抗药性；核酶；信使核糖核酸
在恶性肿瘤的化疗过程中，肿瘤细胞产生的多药抗性(multidrug resistance, MDR)是普遍存在的现象[1，2]。目前已证实，MDR1基因过度表达产生大量的P-glycoprotein(Pgp, 170 000)是一种常见的MDR。如何能有效地逆转Pgp介导的MDR？以往的研究表明，虽然利用抗MDR1 mRNA的核酶在RNA水平上能有效地阻止MDR1基因的过度表达，但是在耐药的肿瘤细胞中，MDR仍然难以完全逆转[3]。其原因除了存在非Pgp介导的MDR因素以外，就核酶本身而言，核酶的活性和结构的稳定性也是影响因素。为了进一步提高核酶分子的稳定性以及它的生物学活性，我们在以往工作的基础上，从以下几个方面进行了改进：(1)对核酶的stem-Ⅱ结构中4个碱基进行了修饰。(2)将tRNA分子和核酶串联起来，形成嵌合型tRNA-Rz[4]。(3)为了进一步在耐药肿瘤细胞中研究核酶的生物学活性，构建了具有高效转移能力、能表达嵌合型tRNA-Rz的逆转录病毒载体[5]。现将有关的研究结果报告如下。
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Stem-Ⅱ碱基修饰的核酶是iMDR1-sRz和196MDR1-sRz；下方分别是196MDR1-Rz和突变的核酶mut-iMDR1-sRz；Intron代表内含子，exon表示外显子
图1 人MDR1基因和抗MDR1 mRNA锤头状核酶设计示意图
材料与方法
一、抗MDR1 mRNA锤头状核酶的设计和合成
本研究中的4个核酶均为锤头状核酶(图1)。编码这4个锤头状核酶的寡核苷酸单链的序列见表1。双链DNA的锤头状核酶通过退火两条互补的寡核苷酸链获得，后者两端分别携带有Mlu Ⅰ和Sac Ⅱ的限制性内切酶的位点。
二、构建含抗MDR1核酶的逆转录病毒载体
上述锤头状核酶cDNA经过5′-端磷酸化后，在T4连接酶的作用下，插入到逆转录病毒载体N2A+ tRNAmeti的polymerase Ⅲ启动子和tRNAmeti基因下游的Sac Ⅱ/Mlu Ⅰ位点中[6]，分别形成N2A+tRNAmeti-196MDR1-Rz、N2A+ tRNAmeti-196MDR1-sRz、N2A+tRNAmeti-iMDR1-sRz 和N2A+tRNAmeti-mut-iMDR1-sRz。在poly Ⅲ作用下，高效表达嵌合型核酶分子。分别将构建好的4种重组逆转录病毒载体转化感受态的DH5α E. Coli细菌体内，初步筛选含阳性克隆的菌落，进行少量载体DNA纯化，用于酶切分析和DNA测序鉴定。
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三、体外转录反应合成核酶和相应的底物RNA
1.制备嵌合核酶的模板DNA：体外转录4种嵌合型核酶(tRNA-196MDR1-Rz、tRNA -196MDR1-sRz、tRNA-iMDR1- sRz和tRNA-mut-iMDR1-sRz)的cDNA模板用PCR扩增，PCR共用引物是Rz-Pr1 5′TAATACGACTCACTATAGGGCGA AGCAGAGTGGCGC-AGCGGAA-3′ (43 mer划线的序列代表体外转录的T7启动子)； Rz-Pr2 5′-TACTTAAGCTAGCACGC-GTCCA-3′ (22 mer，由美国Genset公司合成和纯化)。PCR的模板分别来自上述重组的逆转录病毒载体(N2A+tRNAmeti-196MDR1-Rz、N2A+tRNAmeti-196MDR1-sRz、N2A+tRNAmeti-iMDR1-sRz和N2A+tRNAmeti-mut-iMDR1-sRz)。PCR的条件是在50 μl的PCR反应体系中，加1.5U的Taq DNA多聚酶，PCR条件同文献[3]。PCR产物从5′至3′端依次是T7启动子、tRNA序列和核酶的序列，它们的核苷酸长度分别为tRNA-196MDR1-Rz 145 bp、tRNA-196MDR1-sRz 145 bp和tRNA-iMDR1- sRz 146 bp。
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2.制备裸核酶(196MDR1-sRz和196MDR1-Rz)的模板DNA：先合成3条寡核苷酸链，Rz-sense:5′-TAATACGACTCACTAT-AGGGCGAGTTGCCATTCTGATGG-AG-3′；196MDR1-sRz-antisense：5′-TCTTTCAGTTTCGTCCTCACGGAC-TCATCAGAATGG-3′；196MDR1-Rz-antisense: 5′-TCTTTCAGTTTCGGC-CTTTCGGCCTCATCAGAATGG-3′。具体步骤同文献[3]。
3.制备底物A和底物B模板DNA：相应于上述核酶的底物RNA分子有两种，即底物A(185 bp)和底物B(191 bp)，分别对应于全长MDR1 mRNA的转录起始区-72nt～113nt和第196位编码子区域的520 nt～710 nt[6]。底物
表1 4种抗MDR1mRNA核酶的寡核苷酸链的序列
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核酶引物
序 列
196MDR1-Rz+
5′GGTTGCCATTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTGAAAGCGTTTTTGGA-3′
196MDR1-Rz-
5′CGCGTCCAAAAACGTCTTTCAGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAATGGCAACCCGC-3′
196MDR1-sRz+
5′GGGTTGCCATTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACTGAAAGACGTTTTTGGA-3′
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5′CGCGTCCAAAAACGTCTTTCAGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGAATGGCAACCCGC-3′
iMDR1-sRz+
5′GGATCCATCCCCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCTCGCGCCGTTTTTGGA-3′
iMDR1-sRz-
5′CGCGTCCAAAAACGGCGCGAGGTTTCGGCCTTTCGGCCTCATCAGGGGTAGGATCCCGC-3′
mut-iMDR1-sRz+
5′GGATCCATCCCCTtATGAGGCCGAAAGGCCGAcACCTCGCGCCGTTTTTGGA-3′
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mut-iMDR1-sRz-
5′CGCGTCCAAAAACGGCGCGAGGTgTCGGCCTTTCGGCCTCATaAGGGGTAGGATCCCGC-3′
注：划线的部分是polymer aseⅢ终止子序列；小写字母代表突变的碱基cDNA模板来自pMDR2000XS质粒，用PCR方法扩增。底物A的引物为：SaPr-1，5′ TAATACGACT-CACTATAGGGCGACCACTAAAGTCGGAGTATCTTC-3′ (45 mer，划线的序列代表体外转录的T7启动子，后续的22个核苷酸是MDR1 mRNA转录起始区的-72至-50核苷酸)；SaPr-2，5′-GAAAATACACTGA-CAGTTGGT-3′ (21 mer，相应于MDR1 mRNA的113～93区域的核苷酸)。底物B的引物为：SbPr-1，5′TAATACGACTCAC TATAGGGCGACGACTTACAGATG-ATGTCTCT-3′(44 mer，非划线的序列21个核苷酸是MDR1 mRNA 520～540之间的核苷酸)；SbPr-2，5′-AGATAGTATCTTTGCCCAGACA-3′ (22 mer，相应于MDR1 mRNA 710～689之间的核苷酸)。
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4.体外转录反应制备核酶和底物RNAs：用T7体外转录试剂盒(Ambion公司)合成4种核酶和2种相应的底物RNA。体外转录反应步骤同试剂盒的说明书。完成体外转录反应后，所有的样品在含有8 mol/L尿素的8%丙烯酰胺凝胶中进行电泳(120 V，7～8 h)，在暗室将底片轻压于凝胶上曝光40 min，然后显影[3]。
四、无细胞体系中抗MDR1核酶切割活性检测
将核酶和相应的底物RNA按2∶1(核酶10 pmol：底物5 pmol)比例混合于10 μl反应体积缓冲液中，内含50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，1 mmol/L EDTA溶液。反应混合物加热至95℃ 2 min，然后立即在冰上冷却。 再加入MgCl2浓度至5 mmol/L，在37℃温育，在不同的时间加热至95℃ 3 min。用电泳方法(同步骤3)分析核酶的切割活性[3]。
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五、抗MDR1核酶的稳定性检测
为了检测各种核酶对核酸酶降解的稳定性，我们将5 pmol RNA分子与不同浓度的人AB血清(用50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，5 mmol/L MgCl2溶液稀释)在37℃共同温育，不同时间终止反应，用电泳方法(同步骤3)分析核酶在核酸酶作用下的稳定性。结果
1.核酶的设计和逆转录病毒载体的构建：我们在催化切割MDR1 mRNA第196位GUC编码子(196MDR1-Rz)研究基础上，为了增加核酶结构上的稳定性，对核酶stem-Ⅱ结构中的4个碱基进行了改变，设计了196MDR1-sRz (U9→G9，U13→A13，G14→A14，A18→C18)[4]。除196MDR1-sRz外，我们还设计了stem-Ⅱ上经过修饰的、针对MDR1-mRNA转录起始部位的-6至-4GUC编码子的核酶(iMDR1-sRz)。在实验中还设计了点突变的修饰而丧失生物学活性的mut-iMDR1-sRz(G3→U3，A22→C22)和原有的196MDR1-Rz作为必要的对照(图1)。将锤头状核酶cDNA分别插入N2A+tRNAmeti载体的sac Ⅱ/mlu Ⅰ位点中，形成了N2A+tRNAmeti-196MDR1-Rz、N2A+tRNAmeti-196MDR1-sRz、N2A+tRNAmeti-iMDR1-sRz 和N2A+tRNAmeti-mut-iMDR1-sRz，在poly Ⅲ启动子的作用下，可高效表达嵌合型核酶分子[5]。
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2.核酶和底物RNA的合成：体外转录反应中所合成的核酶和底物RNAs均用[α-32P]-CTP标记，在8% 丙烯酰胺(含8 mol/L尿素)的凝胶中进行电泳。结果显示RNA分子完整，几乎未见到降解现象，而且所有RNA产物分子量的大小和预计的均完全一致(图2)。
3.核酶对相应的底物切割活性的分析：在体外无细胞体系中，3种核酶都有较高的催化切割活性(图3)。嵌合型核酶tRNA-iMDR1-sRz将底物A(185nt)切割成117nt(5′端)和68nt(3′端)两个片段，嵌合型核酶tRNA -196MDR1-Rz和tRNA -196MDR1-sRz将底物B(191nt)切割成69nt(5′端)和122nt(3′端)两个片段。应用激光密度扫描仪进行密度分析和比较发现，经过tRNA-iMDR1-sRz和tRNA -196MDR1-sRz作用12 h后，底物残存量仅为0.9%(图3A)和1.5%(图3B)，可见所有底物几乎完全被切割成产物。而在相同时间，经过tRNA-196MDR1-Rz切割的底物残存量为6.1%(图3C)。结果显示，tRNA-iMDR1-sRz和tRNA-196MDR1-sRz的催化切割活性比tRNA-196MDR1-Rz要高。我们在实验中发现，未嵌合的裸核酶196MDR1-Rz和196MDR1-sRz也可有效切割底物，在经过12 h的切割以后，裸核酶196 MDR1-sRz和196MDR1-Rz残存的底物分别是11%(图3D)和12.8%(图3E)。可见与前述3种嵌合型核酶相比，裸核酶活性要低一些。
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4.核酶RNA分子对核酸酶降解作用的稳定性：人AB血清中含有核酸酶，后者具有很强的降解RNA的作用。为了检测核酶的稳定性，我们检测了每一种核酶抗人AB血清中的核酸酶的作用。结果显示，各种核酶的稳定性依次是tRNA-196MDR1-sRz>tRNA -196MDR1-Rz =裸核酶196MDR1-sRz。与tRNA-196MDR1-Rz、裸核酶196MDR1-sRz相比，tRNA-196MDR1-sRz增强的活性和它本身抗核酸酶的消化作用是平行的。
iMDR1-sRz、196MDR1-sRz和196MDR1-Rz的长度分别为146 nt和145 nt；底物A和B分别为185 nt和191 nt；对照RNA为116 nt
图2 体外转录反应合成的核酶和相应的底物电泳分析结果
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讨论
核酶本身是一种RNA分子，因而能特异地识别MDR1 mRNA中 GUC序列，并产生有效的催化切割作用，使MDR1 mRNA失活，从而阻止Pgp的合成。应用核酶的优势在于核酶几乎没有毒副作用，它完成切割底物RNA后，还能重复对底物进行切割，而且能针对底物RNA中不同部位的GUC设计多种Rz，近年来又研制出高效率基因转移的载体，所以应用核酶抗MDR1基因的过度表达有着广泛的前景[7]。
我们观察到嵌合型tRNA-Rzs的催化切割活性高于相应的裸核酶的活性，其与tRNA分子嵌合型核酶可以提高抗MDR1核酶的活性。目前有关与tRNA分子连接的核酶活性研究并不一致，Cotton等[8]认为，包埋在tRNA分子中的核酶与裸核酶具有相同的催化切割活性；而Yuyama等[9]认为，包埋在tRNA分子中的核酶只有线性裸核酶活性的70%。目前对于这些差别的本质尚不完全清楚。推测可能与下列因素有关：①包埋在tRNA分子中的核酶有较大分子；②同时与原来裸核酶的三维立体结构不同，难以和具有特定三维立体结构的底物RNA分子内部切割位点的侧翼序列发生有效的结合；③串联的嵌合tRNA-Rz分子具有较简单的结构，且在稳定性方面可能与包埋在tRNA分子中的核酶相同。
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A：嵌合型核酶tRNA-iMDR1-sRz；B：tRNA-196MDR1-sRz；C：tRNA-196MDR1-Rz；D：裸核酶196MDR1-sRz；E：裸核酶196MDR1-Rz
图3 在无细胞体系中各种anti-MDR1核酶对底物A(substrate A)和底物B(substrate B)切割活性的比较
从理论上说，stem-Ⅱ的碱基修饰能增强核酶的稳定性，以前尚未有涉及核酶实际切割活性优势和它们抗核酸酶稳定性的报道。我们发现与未经修饰的裸核酶相比，stem-Ⅱ碱基修饰过的核酶增强了抗核酸酶降解的作用。由于stem-Ⅱ结构的稳定性与否直接关系到核酶的催化活性高低，所以实验中检测到增强的核酶活性可能来源于stem-Ⅱ碱基修饰的结果[3]。我们注意到嵌合型、stem-Ⅱ修饰的核酶和原始的未经修饰的核酶具有相似的核酸酶消化的方式，而嵌合型、stem-Ⅱ修饰的核酶和裸核酶被核酸酶消化的方式有所不同。目前这种差别的确切原因尚不清楚。
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本实验研究表明，经过stem Ⅱ碱基修饰和与tRNA串联形成的嵌合型核酶显著地增强了核酶的稳定性和切割MDR1 mRNA的活性，此结果为进一步研究核酶在肿瘤细胞内逆转MDR的生物学活性奠定了良好的基础[7，8]。
志谢 美国纽约西奈山医学院肿瘤系TJ Martell 基金的资助和肿瘤系H Kobayashi博士的帮助
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39970831)
作者单位：王福生(100039 北京，解放军第三○二医院传染病研究所生物工程室)
雷周云(100039 北京，解放军第三○二医院传染病研究所生物工程室)
金磊(100039 北京，解放军第三○二医院传染病研究所生物工程室)
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Takao Ohunma(Division of Medical Oncology,Mount Sinai School of Medicine)
参考文献
1.Bellamy WT. P-glycoproteins and multidrug resistance. Ann Rev Pharmacol Toxicol，1996，36:161-183.
2.Pastan I, Gottesman MM, Lovelace UK, et al. A retrovirus carrying an MDR1 cDNA confers multidrug resistance and polarized expression of P-glycoprotein in MDCK cells. Proc Natl Acad Sci USA，1988，85:4486-4490.
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3.Kobayashi H, Dorai T, Holland JF, et al. Reversal of drug sensitivity in multidrug-resistant tumor cells by an MDR1(PGY1) ribozyme. Cancer Res，1994，54:1271-1275.
4.Sullenger BA, Lee TC, Smith CA,et al. Expression of chimeric tRNA-driven antisense transcripts renders NIH3T3 cells highly resistant to Moloney murine leukemia virus replication. Mol Cell Biol, 1990, 10:6512-6523.
5.Hantzopoulos PA, Sullenger BA, Ungers BA, et al. Improved gene expression upon transfer of the adenosine deaminase minigene outside of the transcriptional unit of a retroviral vector. Proc Natl Acad Sci USA 1989, 86:3519-3523.
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6.Chen CJ, Chin JE, Ueda K, et al. Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr1 (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells. Cell, 1986, 47:381-389.
7.Sullivan SM. Development of ribozymes for gene therapy. J Infest Dermatol, 1994, 103:85S-89S.
8.Cotton M, Birnstiel ML. Ribozyme mediated destruction of RNA in vivo. EMBO J, 1989, 8:3861-3866.
9.Yuyama N, Ohkawa J, Inokuchi Y, et al. Construction of a tRNA-embedded-ribozyme trimming plasmid. Biochem Biophys Res Comm, 1992, 186:1271-1279., 百拇医药