降钙素基因相关肽对心肌细胞缺血缺氧状态下胞内钙的影响
降钙素基因相关肽对心肌细胞缺血缺氧状态下胞内钙的影响
商立军 臧益民 王春梅 臧伟进 董明清 陈贤明 王四旺
摘 要:目的 观察降钙素基因相关肽(CGRP)对急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状 态 下胞内钙的影响. 方法 急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下，以Fluo-3 作为钙指示剂，用共聚焦显微镜测定胞内钙的变化. 结果 急性缺血缺氧时， 心 肌细胞胞内钙浓度降低，加入CGRP后，钙浓度恢复；先加入CGRP,再在缺血缺氧的条件下， 胞内钙浓度基本保持不变. 结论 CGRP可恢复因急性缺血缺氧而导致的细胞内 钙浓度降低.
关键词：降钙素基因相关肽；缺血；缺氧；肌细胞；胞内钙；Fluo-3
0 引言
降钙素基因相关肽(CGRP)是一种内源性生物活性多肽，对心血管系统的活动具有十分重 要的调节作用，有明 显的抗心律失常作用，可引起正常及缺血状态下心肌细胞离子通道的变化，但其作用机制尚 有待进一步研究. 在模拟缺血缺氧状态下,我们用共聚焦显微镜结合Fluo-3染色技术,观察C GRP对急性分离心肌细胞胞内钙的影响.
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 液体配置台氏液(单位为mmol.L-1) NaCl 143, KCl 5.40, Mg Cl2 0.50, CaCl2 1.80, HEPES 5.00, NaH2PO4 0.33, Glucose 5.50, pH值用NaOH调至7.35 . 无 钙台氏液：台氏液中去除 CaCl2即可. 含酶液：无钙台氏液中加入0.1 g.L-1胶原 酶和0.7 g.L-1的BSA. KB液(单位为 mmol.L-1)： L-glutamic acid 70, KCl 25, taurine 20, KH2PO4 10, MgCl2 3, HEPES 10, Glu cose 10, EGTA 0.50, pH值用KOH调至7.35. 模拟缺血缺氧液：台氏液中去除 Glucose,将 pH值降到6.8，且实验前用纯氮气饱和至少1 h. CGRP在实验前加入到台氏液中，最终浓度为 1 nmol.L-1.
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1.1.2 豚鼠心肌细胞分离 豚鼠由本校实验动物中心提供，雌雄 不拘，体质量200～250 g，10 g.L-1戊巴比妥钠(ip 40 mg.kg-1)麻醉. 气管 插管后在正压人工呼吸状态下开胸，充分暴露心 脏和升主动脉，然后在原位进行主动脉插管，摘出心脏后置于Langendorff装置进行主动脉 逆向灌流(灌流与插管同步进行). 先用台氏液灌流3 min左右，复跳以充分冲洗冠脉内残 血，再用无钙台氏液灌流直至心脏完全停跳. 再用含有0.1 g.L-1胶原酶(Yakult,日 本)和0.7 g.L-1 BSA(华美公司)的无钙台氏液灌注约5 min，最后用KB液冲洗残酶 约5 min. 将心脏从Langendorff装置上取下，置于37℃ KB液中剪碎，温育，吹打5～10 m in. 经过滤后置于室温下静置1 h后进行实验. 整个灌流系统温度保持在37℃，所有液体均 用纯氧饱和.
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1.2 方法 急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下胞内钙离子的测定原理: F luo-3是一种敏感性钙指示剂，能特异性地与Ca2+结合，并在一定波长激发光激发后 产生荧光，且与Ca2+结合后其荧光光谱发生变化，其荧光强度与Ca2+浓度 成正比，因而可用于观察Ca2+的动态变化，但Fluo-3 为极性大的酸性化合物，难以 进入细胞，而当其结合上亲脂的乙酰氢甲基酯成为脂溶性的Fluo-3/AM,再与细胞温育时， 很容易透过细胞膜，胞质内的非特异性酯酶将其酯解脱去脂基生成游离的Fluo-3.
1.2.1 Fluo-3/AM的负载 用台氏液洗涤标本2次后，于室温避光条件 下 用Fluo-3/AM(10 mg.L-1)负载细胞约30 min. Fluo-3/AM预先按1 g.L-1溶 于DMSO配制，混匀后存于-20℃. 然后将 细胞滴加到特制的培养皿中，静置贴壁后再用台氏液冲洗细胞2～3次，即可在激光共聚焦显 微镜下进行观察、测量.
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1.2.2 细胞内钙的测定 将负载后的细胞放在特制的培养皿下，常温 下测定所选定的 细胞内的钙值，然后依实验条件分别加入含CGRP的台氏液、缺血缺氧液或正常台氏液，时间 间隔5～10 min,分别测定各时间点的钙值，动态扫描细胞内荧光强度变化. 我们使用的是 Bio Rad 公司的MRC-1024 LSCM，其单幅采样频率可达4 Hz，如需观察Ca2+的快速变 化，可线扫方式，则其采样频率为488 Hz. 与Ca2+结合的Fluo-3可以被488 nm的氩 离子激光激发，可在525 nm处探测到荧光发射，其荧光强度的变化可指示胞内游离钙浓度的 相对变化. 未经校对时虽不能得到[Ca2+]i的绝对值，但通过记录荧光强度 的变化，可观察到胞内[Ca2+]i的空间分布及药物等条件改变时胞内[ Ca2+]i的变化幅度.
2 结果
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2.1 CGRP对缺血缺氧后胞内钙的影响 心肌急性缺血缺氧即刻，胞内 钙降低且基本稳定,1 min后加入CGRP可见胞内钙浓度迅速升高 ，5 min后继续升高，可上升到未缺血缺氧前的水平. 然后用台氏液洗脱上述作用，胞内钙 又回复到缺血缺氧后的状态(Fig 1).
2.2 预先加入CGRP再缺血缺氧时胞内钙的变化 先加入CGRP可略微 升高胞内钙的值，但不显著且随时间的延长，5 min及10 min升高的幅 度不大. 此时加入缺血缺氧液，胞内钙几乎没有变化；开始时整体都略有抬高，但3 min后 即恢复，10 min后用台氏液洗脱，胞内钙值能回复到静息状态的水平(Fig 2).
图 1 缺血缺氧后加入CGRP细胞内荧光光密度曲线
Fig 1 Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxia, and then with CGRP
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图 2 预先加入CGRP再缺血缺氧时细胞内荧光光密度曲线
Fig 2 Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxi a with added CGRP in advance
3 讨论
细胞内游离Ca2+在细胞信息传递过程中起着重要的作用. [Ca2+] i能反映细胞的状态、药物和环境等对细胞的影响. 测量细胞内游离Ca2+的方法有 ：钙离子选择性微电极法 、放射示踪法和标记示踪法等[1]. 我们采用第三代Ca2+荧光指示剂Fluo-3 , 利用激 光共聚焦扫描技术来 观察胞内Ca2+的空间和时间变化. Fluo-3是唯一在可见光区有激发峰的荧光剂，可 以避免紫 外光对细胞的损害和激发自荧光倾向，它和Ca2+结合后荧光强度增强40倍,故Fluo-3 适用于观察Ca2+的空间分布和快速时间变化,是目前荧光剂中性能最优，应用最多的 一种.
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CGRP对缺血缺氧时胞内钙的影响可能是各种因素共同作用的结果：首先,细胞处于 急性 缺血缺氧早期状态时，膜去极化可导致Ca2+内流减少，从而使胞内钙浓度降低. 同时 ，缺血 时细胞内ATP水平降低，可激活IK，ATP电流，使心肌细胞复极明显加速，从而使进入 细胞内 Ca2+减少. 再者,CGRP 可激活Ca2+通道，促进L型Ca2+内流增加，使胞 内钙浓度升高. 这可 能是因为CGRP通过作用于其特异受体，激活细胞内腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷系统，引起cA M P增加,再激活某种蛋白激酶，使钙通道蛋白磷酸化，增加钙通道的开放概率和时间的缘故. 另外还有,Ca2+引起Ca2+释放(calcium-induced calcium release, CICR)的 机制等[2-4]. 我们的研究结果表明，在急性缺血缺氧时,急性分离心肌细胞胞内钙 浓度降低，CGRP可引起 胞内 钙浓度稍微升高，且可改变缺血缺氧引起的胞内钙浓度的降低. 这种钙的变化无疑改变了细 胞内环境的稳定，同时也说明胞内钙是受多种复杂因素调控的，其详细机制还需进一步实 验来阐明.
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970273)
作者简介：商立军(1969-), 男(汉族)，河南省济源市人. 讲师，博士生 (导师臧益民). 已发表论文30篇. Tel.(029)3374521
商立军(第四军医大学基础部:生理学教研室，陕西 西安 710033)
臧益民(第四军医大学基础部:生理学教研室，陕西 西安 710033)
董明清(第四军医大学基础部:生理学教研室，陕西 西安 710033)
王春梅(第四军医大学基础部:中心实验室，陕西 西安 710033)
臧伟进(西安医科大学心血管生理药理研究室,第四军医大学)
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陈贤明(西安医科大学西京医院耳鼻咽喉科,第四军医大学)
王四旺(西安医科大学心药物研究所,第四军医大学)
参考文献:
[1] Brandes R, Figueredo VM, Camacho SA et al. Quantitation of cytosolic [Ca2+]i in whole perfused rat hearts using indo-1 fluorome try[J], Biophys J, 1993;65:1973-1979.
[2] Cornfield DN, Stevens T, Mcmurtry IF et al. Hypoxia-induced i ncrease in fetal pulmonary artery smooth muscle cell [Ca2+]i is mediat ed by entry of Ca2+ through voltage-operated Ca2+ channels (A bstract)[J]. Pediatr Res, 1993;33:320-321.
[3] Berridge MJ. Elementary and global aspects of calcium signalling [J]. J Physiol, 1997;499(2):291-306.
[4] Lopez-lopez JR, Shacklock PS, Balke CW et al. Local calcium tra nsients triggered by single L-type calcium channel currents in cardiac cells[J ]. Science,1995;268(5213):1042-1045., 百拇医药
商立军 臧益民 王春梅 臧伟进 董明清 陈贤明 王四旺
摘 要:目的 观察降钙素基因相关肽(CGRP)对急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状 态 下胞内钙的影响. 方法 急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下，以Fluo-3 作为钙指示剂，用共聚焦显微镜测定胞内钙的变化. 结果 急性缺血缺氧时， 心 肌细胞胞内钙浓度降低，加入CGRP后，钙浓度恢复；先加入CGRP,再在缺血缺氧的条件下， 胞内钙浓度基本保持不变. 结论 CGRP可恢复因急性缺血缺氧而导致的细胞内 钙浓度降低.
关键词：降钙素基因相关肽；缺血；缺氧；肌细胞；胞内钙；Fluo-3
0 引言
降钙素基因相关肽(CGRP)是一种内源性生物活性多肽，对心血管系统的活动具有十分重 要的调节作用，有明 显的抗心律失常作用，可引起正常及缺血状态下心肌细胞离子通道的变化，但其作用机制尚 有待进一步研究. 在模拟缺血缺氧状态下,我们用共聚焦显微镜结合Fluo-3染色技术,观察C GRP对急性分离心肌细胞胞内钙的影响.
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1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 液体配置台氏液(单位为mmol.L-1) NaCl 143, KCl 5.40, Mg Cl2 0.50, CaCl2 1.80, HEPES 5.00, NaH2PO4 0.33, Glucose 5.50, pH值用NaOH调至7.35 . 无 钙台氏液：台氏液中去除 CaCl2即可. 含酶液：无钙台氏液中加入0.1 g.L-1胶原 酶和0.7 g.L-1的BSA. KB液(单位为 mmol.L-1)： L-glutamic acid 70, KCl 25, taurine 20, KH2PO4 10, MgCl2 3, HEPES 10, Glu cose 10, EGTA 0.50, pH值用KOH调至7.35. 模拟缺血缺氧液：台氏液中去除 Glucose,将 pH值降到6.8，且实验前用纯氮气饱和至少1 h. CGRP在实验前加入到台氏液中，最终浓度为 1 nmol.L-1.
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1.1.2 豚鼠心肌细胞分离 豚鼠由本校实验动物中心提供，雌雄 不拘，体质量200～250 g，10 g.L-1戊巴比妥钠(ip 40 mg.kg-1)麻醉. 气管 插管后在正压人工呼吸状态下开胸，充分暴露心 脏和升主动脉，然后在原位进行主动脉插管，摘出心脏后置于Langendorff装置进行主动脉 逆向灌流(灌流与插管同步进行). 先用台氏液灌流3 min左右，复跳以充分冲洗冠脉内残 血，再用无钙台氏液灌流直至心脏完全停跳. 再用含有0.1 g.L-1胶原酶(Yakult,日 本)和0.7 g.L-1 BSA(华美公司)的无钙台氏液灌注约5 min，最后用KB液冲洗残酶 约5 min. 将心脏从Langendorff装置上取下，置于37℃ KB液中剪碎，温育，吹打5～10 m in. 经过滤后置于室温下静置1 h后进行实验. 整个灌流系统温度保持在37℃，所有液体均 用纯氧饱和.
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1.2 方法 急性分离心肌细胞在模拟缺血缺氧状态下胞内钙离子的测定原理: F luo-3是一种敏感性钙指示剂，能特异性地与Ca2+结合，并在一定波长激发光激发后 产生荧光，且与Ca2+结合后其荧光光谱发生变化，其荧光强度与Ca2+浓度 成正比，因而可用于观察Ca2+的动态变化，但Fluo-3 为极性大的酸性化合物，难以 进入细胞，而当其结合上亲脂的乙酰氢甲基酯成为脂溶性的Fluo-3/AM,再与细胞温育时， 很容易透过细胞膜，胞质内的非特异性酯酶将其酯解脱去脂基生成游离的Fluo-3.
1.2.1 Fluo-3/AM的负载 用台氏液洗涤标本2次后，于室温避光条件 下 用Fluo-3/AM(10 mg.L-1)负载细胞约30 min. Fluo-3/AM预先按1 g.L-1溶 于DMSO配制，混匀后存于-20℃. 然后将 细胞滴加到特制的培养皿中，静置贴壁后再用台氏液冲洗细胞2～3次，即可在激光共聚焦显 微镜下进行观察、测量.
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1.2.2 细胞内钙的测定 将负载后的细胞放在特制的培养皿下，常温 下测定所选定的 细胞内的钙值，然后依实验条件分别加入含CGRP的台氏液、缺血缺氧液或正常台氏液，时间 间隔5～10 min,分别测定各时间点的钙值，动态扫描细胞内荧光强度变化. 我们使用的是 Bio Rad 公司的MRC-1024 LSCM，其单幅采样频率可达4 Hz，如需观察Ca2+的快速变 化，可线扫方式，则其采样频率为488 Hz. 与Ca2+结合的Fluo-3可以被488 nm的氩 离子激光激发，可在525 nm处探测到荧光发射，其荧光强度的变化可指示胞内游离钙浓度的 相对变化. 未经校对时虽不能得到[Ca2+]i的绝对值，但通过记录荧光强度 的变化，可观察到胞内[Ca2+]i的空间分布及药物等条件改变时胞内[ Ca2+]i的变化幅度.
2 结果
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2.1 CGRP对缺血缺氧后胞内钙的影响 心肌急性缺血缺氧即刻，胞内 钙降低且基本稳定,1 min后加入CGRP可见胞内钙浓度迅速升高 ，5 min后继续升高，可上升到未缺血缺氧前的水平. 然后用台氏液洗脱上述作用，胞内钙 又回复到缺血缺氧后的状态(Fig 1).
2.2 预先加入CGRP再缺血缺氧时胞内钙的变化 先加入CGRP可略微 升高胞内钙的值，但不显著且随时间的延长，5 min及10 min升高的幅 度不大. 此时加入缺血缺氧液，胞内钙几乎没有变化；开始时整体都略有抬高，但3 min后 即恢复，10 min后用台氏液洗脱，胞内钙值能回复到静息状态的水平(Fig 2).
图 1 缺血缺氧后加入CGRP细胞内荧光光密度曲线
Fig 1 Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxia, and then with CGRP
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图 2 预先加入CGRP再缺血缺氧时细胞内荧光光密度曲线
Fig 2 Intracellular fluorescence intensity curves under ischemia/hypoxi a with added CGRP in advance
3 讨论
细胞内游离Ca2+在细胞信息传递过程中起着重要的作用. [Ca2+] i能反映细胞的状态、药物和环境等对细胞的影响. 测量细胞内游离Ca2+的方法有 ：钙离子选择性微电极法 、放射示踪法和标记示踪法等[1]. 我们采用第三代Ca2+荧光指示剂Fluo-3 , 利用激 光共聚焦扫描技术来 观察胞内Ca2+的空间和时间变化. Fluo-3是唯一在可见光区有激发峰的荧光剂，可 以避免紫 外光对细胞的损害和激发自荧光倾向，它和Ca2+结合后荧光强度增强40倍,故Fluo-3 适用于观察Ca2+的空间分布和快速时间变化,是目前荧光剂中性能最优，应用最多的 一种.
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CGRP对缺血缺氧时胞内钙的影响可能是各种因素共同作用的结果：首先,细胞处于 急性 缺血缺氧早期状态时，膜去极化可导致Ca2+内流减少，从而使胞内钙浓度降低. 同时 ，缺血 时细胞内ATP水平降低，可激活IK，ATP电流，使心肌细胞复极明显加速，从而使进入 细胞内 Ca2+减少. 再者,CGRP 可激活Ca2+通道，促进L型Ca2+内流增加，使胞 内钙浓度升高. 这可 能是因为CGRP通过作用于其特异受体，激活细胞内腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷系统，引起cA M P增加,再激活某种蛋白激酶，使钙通道蛋白磷酸化，增加钙通道的开放概率和时间的缘故. 另外还有,Ca2+引起Ca2+释放(calcium-induced calcium release, CICR)的 机制等[2-4]. 我们的研究结果表明，在急性缺血缺氧时,急性分离心肌细胞胞内钙 浓度降低，CGRP可引起 胞内 钙浓度稍微升高，且可改变缺血缺氧引起的胞内钙浓度的降低. 这种钙的变化无疑改变了细 胞内环境的稳定，同时也说明胞内钙是受多种复杂因素调控的，其详细机制还需进一步实 验来阐明.
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基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970273)
作者简介：商立军(1969-), 男(汉族)，河南省济源市人. 讲师，博士生 (导师臧益民). 已发表论文30篇. Tel.(029)3374521
商立军(第四军医大学基础部:生理学教研室，陕西 西安 710033)
臧益民(第四军医大学基础部:生理学教研室，陕西 西安 710033)
董明清(第四军医大学基础部:生理学教研室，陕西 西安 710033)
王春梅(第四军医大学基础部:中心实验室，陕西 西安 710033)
臧伟进(西安医科大学心血管生理药理研究室,第四军医大学)
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陈贤明(西安医科大学西京医院耳鼻咽喉科,第四军医大学)
王四旺(西安医科大学心药物研究所,第四军医大学)
参考文献:
[1] Brandes R, Figueredo VM, Camacho SA et al. Quantitation of cytosolic [Ca2+]i in whole perfused rat hearts using indo-1 fluorome try[J], Biophys J, 1993;65:1973-1979.
[2] Cornfield DN, Stevens T, Mcmurtry IF et al. Hypoxia-induced i ncrease in fetal pulmonary artery smooth muscle cell [Ca2+]i is mediat ed by entry of Ca2+ through voltage-operated Ca2+ channels (A bstract)[J]. Pediatr Res, 1993;33:320-321.
[3] Berridge MJ. Elementary and global aspects of calcium signalling [J]. J Physiol, 1997;499(2):291-306.
[4] Lopez-lopez JR, Shacklock PS, Balke CW et al. Local calcium tra nsients triggered by single L-type calcium channel currents in cardiac cells[J ]. Science,1995;268(5213):1042-1045., 百拇医药